JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג סדרה של פרוטוקולים לפיתוח תאים מהונדסים ומשטחים פונקציונליים המאפשרים מהונדס חיידק סינטטי לשלוט ולטפל משטחי חומר לתכנות.

Abstract

פתחנו ממשק אביוטי-ביוטיים המאפשר תאים מהונדסים לשלוט בתכונות החומר של משטח פונקציונלי. מערכת זו נעשית על ידי יצירת שני מודולים: זן מהונדס סינטטי של תאי חיידק וממשק חומר פונקציונלי. בתוך נייר זה, אנו פרטנו פרוטוקול עבור גנטית הנדסת התנהגויות נבחרות בתוך זן של חיידק באמצעות אסטרטגיות שיבוט מולקולריות. לאחר שפותח, זן זה מייצר רמות גבוהות של ביוטין כאשר הם נחשפים inducer כימי. בנוסף, אנו פרוטוקולי פרט ליצירת שני משטחים פונקציונליים שונים, שכל אחת מהן מסוגלת להגיב ביוטין תא-מסונתז. יחדיו, אנו מציגים מתודולוגיה ליצירה צמודה, מערכת אביוטי-ביוטיים המאפשר מהונדסת תאים לשלוט רכב חומר והרכבה על מצעים דוממים.

Introduction

כאן אנו מדווחים בנהלי פיתוח מצע לתכנות מסוגל להגיב אות כימית מן קו תא מהונדס. 1 אנו עושים זאת על ידי יצירת ממשק streptavidin ביוטין שמגיב ביוטין מיוצר על ידי coli Escherichia המהונדס סינטטי (E. coli) תאים. בעבר, משטחים לתכנות כבר מהונדסים עבור מגוון רחב של יישומים מ זיהוי הרעלן 2 ונקודה של טיפול אבחון 3 עד הגנה וביטחון. 4 בעוד משטחים לתכנות יכולים להיות שימושיים כמו חיישנים ומפעיל, הם יכולים להיעשות "חכמים" על ידי להנחיל להם את היכולת להסתגל לאתגרים סביבתיים שונים. לעומת זאת, אפילו מיקרואורגניזמים פשוטים, כגון E. coli, יש הסתגלות טמונה ומסוגלים להגיב לאתגרים עם פתרונות מתוחכמים ולעתים קרובות בלתי צפויים. הסתגלות זו אפשרה E.אוכלוסיות coli, בשליטת רשתות גנים המורכבים שלהן, חסכונית לחפש משאבים, 5 ליצור מוצרים בעלי ערך מוסף, 6 ואפילו רובוטיקה כוח בקנה מידה מיקרו. 7 על ידי צימוד היתרונות אדפטיבית של תאי חיים עם שימוש משטחים לתכנות, נוכל ליצור מצע חכם מסוגל להגיב לתנאי סביבה שונים.

ביולוגיה סינתטית נתן החוקרים יכולות חדשות כדי לתכנת את ההתנהגות של היצורים החיים. באמצעות הנדסה לתאים להכיל רשתות רגולטוריות גן חדש, חוקרים יכולים לעצב תאים כי תערוכה מגוונת של התנהגויות מתוכנות. 8, 9 מעבר מחקר בסיסי, התנהגויות אלו עשויות לשמש ליישומים כגון שליטת הרכבת חומר ביולוגי לייצר מוצרים בעלי ערך מוסף. 10 בזאת, אנו בפירוט כיצד השתמשנו בכלים של ביולוגיה סינתטית כדי engineer זן החיידק כי מסנתז ביוטין על אינדוקציה. זן זה פותח באמצעות שיטות שיבוט אנזים הגבלה להרכיב פלסמיד, pKE1-לאצי-bioB. פלסמיד זה, כאשר הפך K-12 זן E. coli MG1655, מעניק לתאים עם יכולת להביע רמות גבוהות של bioB, אנזים חיוני לסינתזת ביוטין. כאשר תאים שהשתנו היו מושרים עם איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ובתנאי עם מבשר ביוטין, desthiobiotin (DTB), רמות גבוהות של ביוטין יוצרו.

האינטראקציה המחייבת של ביוטין עם streptavidin היא אחת איגרות החוב הלא-קוולנטיים החזקים המצויים בטבע. ככזה, האינטראקציה streptavidin ביוטין הוא גם היטב מאופיין והעסיק מאוד בביוטכנולוגיה. 11 בתוך כתב היד הזה, אנו מציגים שתי אסטרטגיות העסקת אינטראקצית streptavidin ביוטין לחוש ולזהות ביוטין בייצור תאים עם משטח פונקציונלי. אָנוּמתייחסים משטחים מנוגדים אלה תוכניות שליטה "עקיפה" ו "ישירה". בתכנית השליטה העקיפה, ביוטין-מיוצר תא מתחרה עם ביוטין כי כבר מצומדות ו משותק על משטח קלקר streptavidin אתרי קישור. בנוסף, streptavidin הוא מצומדות עם peroxidase חזרת (HRP). HRP משנה 3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB), להפקת אותות אופטיים, 12 אשר עשוי להיות במעקב על ידי לכימות ספיגת ספקטרלי (כלומר, צפיפות אופטית) ב -450 ננומטר (OD 450). לפיכך, את ערכת השליטה העקיפה מאפשרת לחוקרים למדוד ביוטין בייצור תאים על ידי ניטור attentuation של אות OD 450.

ערכת השליטה הישירה מנצלת את האירוע ביוטין-streptavidin על ידי streptavidin משתק ישירות משטח חומר ומאפשר ביוטין תא-פיק biotinylated HRP להתחרות על streptavidin אתרי קישור. שוב,רמות יחסיות של ביוטין בייצור התאים מנוטר על ידי מדידת אות OD 450.

יחדיו, התאים המהונדסים משטחים פונקציונליים מאפשרים לנו לשלוט על התכונות של משטח לתכנות על ידי גרימת רשתות בתאים חיים. במילים אחרות, יצרנו מערכת שמנצלת את יכולת ההתאמה של היצורים החיים ואת אמינות מפרט של ממשק חומר מהונדס ידי קישור המערכות הללו יחד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. מדיה והכנה תרבות

  1. כן lysogeny מרק (LB) בתקשורת על ידי ערבוב 25 גרם של מניית אבקת LB עם 1 ליטר של deionized (DI) מי מעוקר הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לעקר.
    1. כדי להכין צלחות LB, להוסיף 15 גרם אגר (1.5%) לתקשורת LB לפני עיקור
    2. הכינו מלאי של פתרונות 1,000x carbenicillin (Cb) במים DI (50 מ"ג / מ"ל).
    3. אם הכנת תקשורת LB הכוללת אנטיביוטיקה לבחירת transformants העמיד, לחכות עד לטמפרטורה של LB התקשורת המעוקרת היא מתחת ל -60 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 1 μL של מניית אנטיביוטיקה לכל מיליליטר תקשורת של LB 1.
  2. עבור תקשורת המינימאלית M9 (טבלה 1), להכין פתרונות מניות נפרדים מהפעולות הבאות: מלחים 5X M9 (L / 56.4 גרם), 1 M 4 MgSO, 1 M CaCl 2, 20 גלוקוז%, וחומצות casamino 2% חינם ביוטין.
    1. בשנת בקבוק בטוח חיטוי, לשלב 20 מיליליטר של מלחים 5x M9, 200 &# 181; L של 1M MgSO 4, 10 μL של 1 2 M CaCl, 2 מ"ל של גלוקוז 20%, 1 מ"ל של 2% חומצות casamino ללא ביוטין, ו 76.8 מ"ל מים DI.
    2. חיטוי הפתרון מוכן בשלב 1.2.1 ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
  3. דגירה כל התרבויות על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב 400 סל"ד. פעמי דגירה משתנות בהתאם ניסוי ומתח, אבל בדרך כלל להימשך בין 8 כדי 12 שעות.

2. הדור של E. ביוטין הפקת E. (פלסמיד pKE1-לאצי-bioB)

הערה: המעגל הגנטי מכיל שני חלקים: מדכא לאצי, מונע על ידי L P, TETO-1 האמרגן וכתוצאה מכך ביטוי המכונן בשל העדר של חלבון מדכא tetR, כמו גם מערכת ביטוי ביוטין המכיל את P TRC-2 אמרגן ואחריו אתר קישור הריבוזום חזק (RBS) נהיגת ביטוי bioB. כל שיבוט הוצא להורג בתוך stra coli מסחרי, המתחלקים במהירות E.ב. הפך הבונה הסופי לתוך E. coli MG1655WT לבדיקה. Primers (טבלה 2) נרכש מסחרי.

  1. לבודד גן bioB מן הגנום החיידק על ידי ביצוע תגובת שרשרת פולימראז כל תא (PCR):
    1. לגדול E. coli תאים MG 1655WT לילה בשעה 37 ° C.
    2. בתוך צינור 0.2 מ"ל PCR, לשלב 1 μL של תרבות לילה מוכן בשלב 2.1.1 עם 9 μL של מים די סטרילי.
    3. דגירה הצינור ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך thermocycler ומיד להעביר את הצינור כדי במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי lyse התאים. זה מאפשר הדנ"א הגנומי כדי לשמש כתבנית PCR.
    4. להפשיר את הפתרון ולהוסיף (i) 2.5 μL כל אחת פריימרים nBioB2-F1 ו nBioB2-r, (ii) 5 μL של חיץ פולימראז 5x DNA, (iii) 0.25 μL של DNA פולימרז, (iv) 0.5 μL של תמהיל dNTP , ו (v) 6.75 μL של מי DI עבור נפח תגובה כולל של 25 μL(לוח 4).
    5. מכה על דופן (כלומר, קפיצי) הצינור לערבב את תוכנו. לאחר מכן, מייד לסובב את הצינור במהירות (~ 2 ימים) על מנת להבטיח את המדגם הוא בתחתית של התחתית.
    6. מניח את הצינור ב thermocycler PCR ולהשתמש התכנית מתוארת בטבלה 3 עם צעד נוסף של 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס בתחילת הפרוטוקול.
    7. אשר ג'ל אלקטרופורזה באמצעות PCR מוצלח (1.0 - 1.2% agarose במים DI + ethidium ברומיד) ב טריס בסיס, חומצה אצטית, ו חיץ EDTA (TAE). מוצר PCR צריך להיות 1,070 basepairs (נ"ב) ארוך.
    8. השתמש ערכות מסחריות לפי הוראות היצרן כדי לחלץ קטעי דנ"א מן ג'ל משלב 2.1.7.
  2. לבודד את האמרגן P TRC-2 ואת אופרון לאצי מן הפלסמיד pKDL071 13 (באדיבות המעבדה של ג'יימס קולינס ב- MIT):
    1. לגדל תאי E. coli המכיליםהפלסמיד pKDL071 לילה LB + Cb על 37 מעלות צלזיוס.
    2. חלץ את ה- DNA פלסמיד מן התאים באמצעות ערכת miniprep מסחרית על פי הוראות היצרן. הפלסמיד ישמש כתבנית PCR.
    3. פעל על פי פרוטוקול ה- PCR מצעדים 2.1.4. כדי 2.1.8. בשינויים הבאים:
    4. חלף תאי lysed עם תמצית פלסמיד בשלב 2.2.2.
    5. השתמש 2.5 μL כל אחד פריימרים 1-F ו- 1-r להפקת קלטת לאצים. לחילופין, להשתמש 2.5 μL כל אחד פריימרים nBioB1-F ו- nBioB1-r להפקת P TRC-2.
    6. בצע ג'ל אלקטרופורזה (שלב 2.1.7) כדי לאשר את מוצרי ה- PCR הם קלטת לאצי ו- P אתר מקדם TRC-2. הם צריכים להיות 1213 נ"ב ו -109 נ"ב ארוכים, בהתאמה.
  3. השתמש שחבור ובהרחבה חפיפה (SOE) PCR לבנות את הקלטת bioB המכיל P TRC-2, אתר מחייב הריבוזום סינתטי (RBS) ב פריימר nBioB2-f2, ואת bioB גן. תכנית thermocyler PCR נמצאת בטבלה 3.
  4. בונה הכנס (P L, TETO-1 + לאצי ו- P TRC-2 + bioB) לתוך 13 עמוד השדרה וקטור הפלסמיד pKE1-MCS (באדיבות המעבדה של ג'יימס קולינס ב- MIT) על ידי לעכל את וקטור והכנס עם אנזימי הגבלה:
    1. חלץ גנים באמצעות אנזימי הגבלה ו ג'ל אלקטרופורזה. התגובה של כל מכיל (i) 5 μL של חיץ התגובה 10x, (ii) 1 μL של אנזים הגבלה 1, (iii) 1 μL של הגבלה האנזים 2, (iv) לפחות 1 מיקרוגרם של ה- DNA, ו (v) DI מים להביא את הנפח הסופי 50 μL (לוח 5). לעכל עם אנזימי AatII ו EcoRI עבור הקלטת לאצים ועם אנזימי HindIII ו SacII עבור קלטת bioB.
    2. לאחר התגובות מורכבות, במהירות מערבולת אותם צנטריפוגות בקצרה (~ 2 s) לפני הדגירה של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס.
    3. בְּמַהֲלָךעיכול, להכין ג'ל אלקטרופורזה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
    4. שלב ה- DNA מתעכל עם חיץ טעינת 6x ג'ל אלקטרופורזה.
    5. השתמש סולם 2-יומן כדי לאמת מיקום של מבנה רצוי, לחתוך קטע DNA מן הג'ל, ולהשתמש ערכות חילוץ ג'ל מסחריות לפי הוראות היצרן כדי לחלץ קטעי דנ"א מן הג'ל.
  5. לכמת DNA באמצעות ספקטרוסקופיית ולחשב כרכים עבור 0: 1, 1: 1, ו -3: 1 יחסים טוחנים של כנס וקטור באמצעות משוואה 1:
    figure-protocol-7187 משוואה 1
    במשוואה 1, M הוא היחס של הכנס כדי וקטור (0, 1, או 3), אני X הוא כמות ה- DNA להוסיף, נ"ב אני הוא אורך את התותב זוגות בסיסים, נ נ"ב הוא אורך של וקטור ב basepairs, ו- V X הוא כמות וקטור (50 נ"ג).
  6. מערבבי תגובת קשירה ידי שילוב (i) 1 μL 10X אנזים הצפה, (ii)1 μL T4 האנזים, (iii) DNA וקטור 50 ng, (iv) מסה של DNA הכנס ספציפי לכל תגובה, ו- (v) מים די כדי 10 μL התגובה הכולל נפח (לוח 6).
  7. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעה 1.
  8. במהלך דגירת הקשירה בשלב 2.7, להכין תאים מוסמכים כימי.
    1. Aliquot 1 מ"ל של תרבויות לילה לתוך צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב 16,200 XG דקות 1.
    3. למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 200 μL של קר (על הקרח) 100 מ"מ CaCl 2. Resuspend את הכדור על ידי pipetting בעדינות. לא מערבולת.
    4. מניחים את הצינור microcentrifuge על קרח למשך 10 דקות.
    5. צנטריפוגה, להסיר את supernatant, resuspend גלולה ב 100 μL של 100 מקורר מ"מ CaCl 2, ולמקם את הצינור על הקרח שוב.
    6. צנטריפוגה הצינור בפעם האחרונה, resuspend גלולה ב 50 μL של 100 מקורר מ"מ CaCl 2.
    7. מקוםהצינור על קרח ולהשתמש התאים מוסמכים הכימי מייד.
  9. הוסף 5 μL של ה- DNA ligated, ערוכי צעדים 2.6 ו -2.7, על צינור אחד של תאים מוסמכים, מוכנים בשלב 2.8.
  10. להתסיס את הצינור בקצרה על ידי מכה בצד (כלומר מצליף) הצינורות ולאחר מכן למקם את הצינורות על קרח למשך 30 דקות.
  11. מחממים לזעזע צינורות במשך 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס ולהחזיר את צינורות קרח במשך 2 דקות.
  12. תאי פיפטה על אגר LB סלקטיבי + צלחות אנטיביוטיות ולהפיץ את התאים באמצעות חרוזי זכוכית ציפוי.
  13. דגירת צלחות הלילה ב 37 מעלות צלזיוס.
  14. למחרת בבוקר, פיק מושבות מצלחות כנס חיובי (כלומר, 1: 1 ו -3: 1 צלחות). פיק 3 מושבות אם 0: צלחת הביקורת השלילית 1 לא מראה צמיחה, או לבחור 5-8 מושבות אם 0: צלחת 1 יש כמה צמיחה. השתמש מושבות הרים לחסן 5 מ"ל LB + אנטיביוטי ולגדול במשך 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
  15. חלץ את ה- DNA פלסמיד מן התאים באמצעות miniprערכת EP, בעקבות הוראות היצרן. בצע חתך בדיקה באמצעות אנזימי הגבלה (בעקבות אותו הנוהל המפורט בשלב 2.4.1.).
  16. לזהות תאים עם בונה מוצלחת ידי השוואת אורך קטעי דנ"א מתעכלים עם התוצאות הצפויות מן הקונסטרוקציה נכונה. תרבויות נושאת בונת פלסמיד מוצלחת עשויות להישמר על ידי ערבוב תרבות בחלקים שווים עם תמיסה של גליצרול סטרילי, מסונן, 40% (במי DI) והקפאת התערובת ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: טרנספורמציות של פלסמידים לתוך זני E. coli אחרים (כלומר, MG1655WT) ניתן להשיג על ידי ביצוע ההליך הנ"ל להכנת תאים מוסמכים כימי.

3. תא אפיון: עקומת צמיחה ו מנת תגובה

  1. לגדול זנים מהונדסים לילה בתקשורת LB עם אנטיביוטיקה מתאימה.
  2. עבור עקומות גדילה, להכין 50 מ"ל של התקשורת M9 מינימלי עם ובלי IPTG (מתוך 0.5 M יםטוק) ו / או DTB (ממלאי 500 מיקרוגרם / מ"ל) כדלקמן:
    1. הכן 0 ng / mL DTB (0 μL של המניה) / 0 מ"מ IPTG (0 μL של המניה).
    2. הכן 200 ng / mL DTB (200 μL של המניה) / 0 מ"מ IPTG (0 μL של המניה).
    3. הכן 0 ng / mL DTB (0 μL של המניה) / 0.5 מ"מ IPTG (50 μL של המניה).
    4. הכן 200 ng / mL DTB (200 μL של המניה) / 0.5 מ"מ IPTG (50 μL של המניה).
    5. לחסן עם התרבות לילה בשעה 1: 100 בתקשורת שצוין לעיל.
    6. צלחת 96-היטב, aliquot 200 μL של התרבות, בשלושה עותקים, זה טוב.
    7. מדוד OD 600 כל 5 דקות במשך 24 שעות עם רעד דגירה רציפים ב 37 מעלות צלזיוס קוראת צלחת.
  3. עבור מחקרי מנת תגובה, להחליף את גן bioB ב pKE1-לאצים-bioB עם mCherry (חלבון פלואורסצנטי אדום) כימות אופטי בזמן האמת.
  4. להוסיף כמויות משתנות של IPTG החל 0.1 מ"מ עד 5 מ"מ כדי לגרום ביטויבתקשורת LB.
  5. לחסן עם תרבות הלילה בדילול של 1: 100.
  6. מדוד קרינה כל 30 דקות במשך 15 שעות.

4. גרימה ביוטין ייצור מתאי מהונדסים והכנת Supernatant

  1. לגדול pKE1-לאצי-bioB בזן העכברים MG1655 E. coli לילה בתקשורת LB.
  2. מוסף תקשורת M9 עם DTB הנע בין 30 כדי 200 ng / mL.
  3. הוסף 0.5 מ"מ IPTG לגרום סינתזה ביוטין.
  4. לחסן שתושלם, תקשורת M9 מינימאלית ללא ביוטין עם תרבות לילה בשעת 1: 100 דילול.
  5. לאחר 24 שעות של צמיחה, תאים צנטריפוגות לאסוף את supernatant מועשר ביוטין.
  6. מדוד supernatant מועשר ביוטין עם השליטה העקיפה ואת משטחים פונקציונליים השליטה הישירה. השתמש supernatant במקום של המדגם ביוטין בצעדים 5.23 ואת 6.12, בהתאמה.

5. הכנת תכנית פונקציונלית משטח שליטה עקיפה

  1. כן הדואר בא פתרונות.
    1. הכן פתרון SMCC המורכב 20 מ"ג / מ"ל ​​של succinimidyl טרנס-4- (maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) ב sulfoxide דימתיל (DMSO).
    2. הכן פתרון SPDP המורכב 20 מ"ג / מ"ל ​​של succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) ב DMSO.
    3. הכן 20 מ"ג / מ"ל ​​LC-LC-ביוטין ב DMSO.
    4. הכן 10 מ"ג / מ"ל ​​peroxidase חזרת (HRP) ב בופר פוספט (PBS).
    5. הכן 10 מ"ג / מ"ל ​​streptavidin (SA) ב PBS.
    6. הכן 10 מ"ג / מ"ל ​​בסרום שור אלבומין (BSA) ב- PBS.
    7. הכן 100 מ"מ dithiothreitol (DTT) במים DI.
    8. כן 5 מ"מ חומצת ethylenediaminetetaacetic (EDTA) ב- PBS.
    9. כן קזאין 0.5% ב- PBS.
    10. הכן 20% Tween 80 מניות במי DI.
    11. כן 0.05% 80 Tween (מ -20% מניות) ב- PBS.
    12. הכן 50 מ"מ של נתרן אצטט במים DI.
    13. כן 1% TMB ב DMSO.
    14. כן 3% H 2 O 2 iמים די n.
    15. כן 2 MH 2 4 SO במי DI.
  2. להוסיף 1.4 μL של פתרון SPDP 20 פתרון μL SA.
  3. דגירת הפתרון מ -5.2 ל -1.5 שעות ב RT, עטוף בנייר אלומיניום, כדי להימנע מחשיפה לאור. צעד זה מאפשר crosslinker SPDP אג"ח ל SA באמצעות קבוצת האמין ויצרה SA מופעל pyridyldithio.
  4. להוסיף 2.4 μL של פתרון DDT לפתרון משלב 5.3 ו דגירה של 1 ש 'ב RT. זה מאפשר מחשוף פירידין 2-thione, וכתוצאה מכך SA המופעל sulfhydryl.
  5. להוסיף 7.5 פתרון μL SMCC 72 פתרון μL HRP דגירה במשך 1.5 שעות ב RT, עטוף בנייר אלומיניום, כדי להימנע מחשיפה לאור. התוצאה היא HRP maleimide המופעל כבול קבוצת אמינו.
  6. מערבבים 17 פתרון μL LC-LC-ביוטין עם 200 פתרון μL BSA ו דגירה של 1.5 שעות ב RT, עטוף בנייר אלומיניום, כדי להימנע מחשיפה לאור. שלב זה מאפשר ביוטין המצומד tBSA o באמצעות אג"ח אמיד.
  7. מעבירים את פתרונות מצעדים 5.4, 5.5 ו -5.6 להפריד ריכוז צנטריפוגלי בתוך צינורות ספין.
  8. עבור צינורות המכילים SA-SPDP, משלב 5.4, צנטריפוגות ב XG 10,000 עד נפח הצינור מגיע ל -100 μL או במשך 16 דקות. מלאו את צינור ספין 500 μL עם PBS-EDTA.
    1. 5.8 חמש פעמים חזור על שלב. אחסן את המניה ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. עבור צינורות המכילים HRP-SMCC, משלב 5.5, צנטריפוגות ב XG 10,000 עד נפח מגיע 25 μL או במשך 16 דקות. מלאו את צינור ספין 500 μL עם PBS.
    1. 5.9 חמש פעמים חזור על שלב. אחסן את המניה ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. עבור צינורות המכילים BSA ביוטין, משלב 5.6, צנטריפוגות ב XG 10,000 עד נפח מגיע ל -100 μL או במשך 12 דקות. מלאו את צינור ספין 500 μL עם PBS.
    1. 5.10 ארבע פעמים חזור על שלב.
    2. צנטריפוגה ב XG 10,000 עד נפח מגיע ל -100 μLאו במשך 12 דקות. הוספת 100 μL של PBS על הצינור. אחסן את המניה ב 4 מעלות צלזיוס.
  11. הוסף 25 μL של פתרון HRP 10 מ"ג / מ"ל עם 25 μL של 10 מ"ג / פתרון SA מ"ל ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. זה גורם SA להפוך מצומדות עם HRP באמצעות אג"ח thioether.
    1. כן 1: פתרון עובד 4 עם הפתרון ולאחסן לילה 4 ° C במקרר. פתרון הנותרים חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
  12. כן שני פתרונות מורכבים BSA-ביוטין (או BSA) ב- PBS, על ידי הוספת 10 μL של מניית BSA ביוטין (או 10 מניות μL BSA) 490 μL של PBS.
  13. הוספת 100 μL של הפתרון משלב 5.12 היטב בכל צלחת קלקר 96-היטב.
  14. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, עטופה בנייר כסף.
  15. שטוף את הבארות צלחת עם 0.05% Tween 80.
    1. הוספת 200 μL של 0.05% PBS-Tween 80 בארות. דגירה של 2 דקות ב RT. למזוג את הנוזל.
    2. חזור על שלב 5.15.1 שלוש פעמים.
  16. הוספת 200 μL של פתרון קזאין 0.5% לכל אחת מן הבארות בצלחת 96-היטב.
  17. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  18. חזור על שלב 5.15 לשטוף את הבארות שלוש פעמים.
  19. הכן פתרון על ידי ערבוב 12 מ"ל של תמיסת קזאין 0.5% עם 7.5 μL של 0.05% Tween 80.
  20. לדלל את מניות SA-HRP 1: 10,000 באמצעות הפתרון מוכן בשלב 5.19.
  21. הוסף 80 μL של פתרון מוכן בשלב 5.20 היטב בכל צלחת 96-היטב.
  22. הוסף 20 μL של המדגם ביוטין המוכן היטב בכל צלחת הקלקר. את supernatant ערוך 4.6 יכול לשמש מדגם ביוטין בשלב זה.
  23. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. צעד זה מאפשר תחרותי מחייב בין ביוטין בחינם לשתק BSA ביוטין עבור אתרי הקישור SA-HRP.
  24. חזור על שלב 5.15 לשטוף את הבארות שלוש פעמים.
  25. מערבבים 50 מ"מ פתרון נתרן אצטט, פתרון 1% TMB,ו -3% H 2 O 2 פתרון בכל 1,000: 10: יחס 1 (20 נפח הכולל מיליליטר).
  26. הוספת 200 μL של הפתרון משלב 5.25 היטב כל ולאפשר לשבת במשך 15 דקות ב RT, מכוסה בנייר כסף.
  27. הוסף 50 μL של 2 MH 2 SO 4 היטב כל כדי לעצור את התגובה. מדוד OD 450 באמצעות קורא צלחת.

6. הכנת פני שטח הפונקציונלית Scheme שליטה ישירה

  1. הכן את הפתרונות הבאים.
    1. הכן 20 מ"ג / מ"ל ​​LC-LC-ביוטין ב DMSO.
    2. הכן 10 מ"ג / מ"ל ​​HRP ב PBS.
    3. כן 0.17 מיקרוגרם / מיליליטר SA ב PBS.
    4. כן קזאין 0.5% ב- PBS.
    5. הכן 20% Tween 80 מניות במי DI.
    6. כן 0.05% 80 Tween (מ -20% מניות) ב- PBS.
    7. הכן 50 מ"מ של נתרן אצטט במים DI.
    8. כן 1% TMB ב DMSO.
    9. כן 3% H 2 O 2 במי DI.
    10. כן 2 MH 2 SO 4 במי DI.
  2. להוסיף 7.5 μL LC-LC-ביוטין 72 μL HRP לדגור על 1.5 שעות ב RT, עטוף בנייר אלומיניום, כדי להימנע מחשיפה לאור. צעד זה גורם ביוטין המצומד כדי HRP באמצעות אג"ח אמיד.
  3. מעבירים את הפתרון משלב 6.2 על concentrator צנטריפוגלי בתוך צינור ספין
    1. צנטריפוגה הפתרון ב XG 10,000 עד נפח מגיע ל -100 μL או במשך 12 דקות. מלאו את צינור ספין 500 μL עם PBS וחזור על צנטריפוגה בנוסף PBS ארבע פעמים. אחסן את המניה ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. מוסיפים את 100 μL של פתרון SA מ 6.1.3 היטב כל בתוך צלחת קלקר 96-היטב.
  5. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, עטופה בנייר כסף.
  6. שטוף את הבארות צלחת עם 0.05% Tween 80.
    1. הוספת 200 μL של 0.05% Tween 80 בארות. דגירה של 2 דקות ב RT. למזוג את הנוזל.
    2. חזור 6.6.1 שלוש פעמים.
  7. הוספת 200 μL של פתרון קזאין 0.5% לכל אחת מן הבארות בצלחת 96-היטב.
  8. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  9. צעד 6.6 חזור שלוש פעמים כדי לשטוף את הבארות.
  10. לדלל את המניות ביוטין-HRP 1: 10,000 באמצעות פתרון מוכן בשלב 6.3.
  11. הוסף 80 μL של פתרון מוכן בשלב 6.10 היטב בכל צלחת 96-היטב.
  12. הוסף 20 μL של המדגם ביוטין המוכן היטב בכל צלחת הקלקר. את supernatant ערוך 4.6 יכול לשמש מדגם ביוטין בשלב זה.
  13. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. צעד זה מאפשר תחרותי מחייב בין ביוטין בחינם ביוטין-HRP עבור אתרי קישור SA משותקות.
  14. חזור על שלב 6.6 כדי לשטוף את הבארות שלוש פעמים.
  15. מערבבים 50 פתרון נתרן אצטט מ"מ, פתרון 1% TMB, ו -3% H 2 O 2 פתרון בכל 1,000: 10: יחס 1 (20 הנפח הכולל מ"ל).
  16. הוספת 200 μL של הפתרון משלב 6.15 זה טוב דגירה במשך 15 דקות ב RT, מכוסה בנייר כסף.
  17. הוסף 50 μL של 2 MH 2 SO 4 פתרון זה טוב כדי לעצור את התגובה. מדוד OD 450 באמצעות קורא צלחת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תוצאות נציגים מוצגות חמש דמויות המצורפות. ראשית, אנו מציגים את תהליך השיבוט גרפי (איור 1), כך שהקורא יכול חזותי בצע את השלבים הקריטיים ליצירת זן החיידק המהונדס הסינטטי. על מנת לאפיין את הדינמיקה באוכלוסייה של התאים, אנו מספקים עקומת צמי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הצגנו אסטרטגיה חדשה עבור התממשקות תאים מהונדסים חיים עם משטח חומר פונקציונלי. הדבר זה הושג על ידי פיתוח קו תא מסוגל לסנתז רמות גבוהות של ביוטין כאשר מושרה עם IPTG. הרמות הגבוהות של ביוטין יכולות לשמש כדי לשנות את פני השטח הפונקציונליים. הפרוטוקולים המפורטים כיצד להנדס ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים בתודה להכיר תמיכה בפרס FA9550-13-1-0108 מלשכת חיל האוויר של המחקר המדעי של ארה"ב. המחברים גם מכירים תמיכה מן הפרס N00014-15-1-2502 מן משרד המחקר של הצי של ארה"ב, מימון מהמכון לטכנולוגיה קריטית ומדע יישומי במכון הפוליטכני וירג'יניה סטייט, ומן מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע אחוות תוכנית, מספר הפרסים 1,607,310.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
LB Broth, Miller Fisher Scientific12-795-027
AgarFisher ScientificBP9744500
Carbenicillin Fisher ScientificBP26481
M9, Minimimal Salts, 5xSigma-AldrichM6030
Casamino Acids Fisher ScientificBP1424-100
Magnesium Sulfate, AnhydrousFisher ScientificM65-500
Calcium Chloride, DihydrateFisher ScientificC79-500
Dextrose (D-Glucose), AnhydrousFisher ScientificD16-1
NEB Turbo Cell LineNew England BiolabsC2984l
Oligonucleotide PrimersThermo Fisher ScientificN/A25N synthesis, DSL purification
Q5 High-Fidelity PolymeraseNew England BiolabsM0491S
Q5 Reaction BufferNew England BiolabsB9027S
dNTP Solution MixNew England BiolabsN0447S
AgaroseBioexpressE-3120-125
Ethidium Bromide, 1%Fisher ScientificBP1302-10
Gel Extraction KitsEpoch Biolabs2260250
GenCatch Plasmid DNA Miniprep KitEpoch Biolabs2160250
AatIINew England BiolabsR0117S
SacIINew England BiolabsR0157S
HindIII-HFNew England BiolabsR3104S
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101S
Cutsmart BufferNew England BiolabsB7204S
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BiolabsB0202S
ColiRolle Glass Plating Beads EMD Millipore7101-3
GlycerolFisher ScientificBP229-1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Fisher ScientificBP1755-10
NHS-Desthiobiotin (DTB)Thermo Fisher Scientific16129
Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) Thermo Fisher ScientificS1534
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher ScientificBP231-100
Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) Thermo Fisher ScientificS1531
NHS-LC-LC-biotinThermo Fisher Scientific21343
Horseradish Peroxidase (HRP) Thermo Fisher Scientific31490
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x SolutionFisher ScientificBP399500
Streptavidin (SA) Thermo Fisher Scientific21145
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Dithiothreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) Fisher ScientificS311-500
Tween 80 Fisher ScientificT164-500
Hydrogen PeroxideFisher ScientificH325-4
3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB)Fisher ScientificAC229280050
Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators Viva ProductsVS0192
Sodium Acetate, AnhydrousFisher ScientificBP333-500
96-Well Polystyrene PlatesThermo Fisher Scientific266120

References

  1. Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
  2. Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
  3. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
  4. Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
  5. Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
  6. Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
  7. Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
  8. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  9. Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988(2015).
  10. Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).
  11. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
  12. Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
  13. Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
  14. Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  15. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  16. Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
  17. Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering121biosensing

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved