אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

Summary

כאן, אנו מציגים גישה האנזימטית לבודד hepatocytes העיקרי של עכברים בוגרים, ואנחנו מתארים כימות של תגובה דלקתית באמצעות ELISA ו- בזמן אמת PCR.

Abstract

הכבד ממלא תפקיד מכריע בוויסות דלקת מערכתית. במחלת כליות כרונית בפרט, הכבד מגיב בתגובה המילייה אורמיה, סטרס חמצוני, endotoxemia ואת אישור ירד מחזורי ציטוקינים מעודדי דלקת על ידי הפקת מספר רב של המגיבים-השלב האקוטי. כלי ניסיוני ללמוד דלקת והתפקיד הבסיסי של hepatocytes הם קריטיים להבנת הרגולציה תרומת ציטוקינים כבדים לתגובה בשלב חריף מערכתית תרחיש הפר דלקתי ממושך, במיוחד בסביבה מורכבת כגון מחלת כליות כרונית. מאז לימוד מנגנונים מורכבים של דלקת in vivo נותר מאתגר, עתירי משאבים ובדרך כלל מחייב את השימוש של חיות טרנסגניות, hepatocytes מבודד העיקרי לספק כלי חזק כדי להשיג תובנות מכניסטית לתוך תגובה חריפה פאזיים בכבד. מאז טכניקה במבחנה זה כוללת עלויות מתונות, גבוה מחדשproducibility וידע טכני משותף, hepatocytes המבודד העיקרי יכולים גם לשמש בקלות כגישת הקרנה. כאן אנו מתארים שיטה אנזימטית מבוססי לבודד hepatocytes murine העיקרי, ואנחנו מתארים את הערכה של תגובה דלקתית בתאים אלה באמצעות ELISA ו- PCR כמותי בזמן אמת.

Introduction

מחלת כליות כרונית (CKD) יכולה להיות מוגדרת כמדינה של דלקת חריפה וכרונית ^1. בחולים עם מחלת כליות כרונית, רמות בסרום של גורם גדילה פיברובלסטים הורמון phosphaturic 23 (FGF23) בהדרגה לעלות על מנת לשמור על הומאוסטזיס ² פוספט בסרום. רמות FGF23 אצלה עלו קשורות באופן עצמאי עם תחלואה ותמותה קרדיו-וסקולרית בקרב חולים אשר מתחילים המודיאליזה טיפול ^{3, 4.} יתר על כן, מספר מחקרים קליניים הראו קשר חזק בין רמות גבוהות FGF23 ורמות של C-reactive protein (CRP), אינטרלאוקין 6 (IL-6) ו גידול נמק α פקטור (TNFα) ^{5, 6.} יתר על כן, במחקר ניסיוני, אנחנו הוכחנו לאחרונה כי FGF23 יכול למקד ישירות hepatocytes ולגרום לתגובה דלקתית על ידי הגדלת CRP ו- IL-6 עמ 'roduction בכבד ^7. לפיכך, FGF23 עשוי לפעול כגורם במחזור שתורם דלקת מערכתית CKD.

בשנות ה -70 המוקדמות, hepatocytes העיקרי היו מבודדים למד בפעם הראשונה ^8. מאז העיקרי תאים בכבד תרבותי נעשה שימוש נרחב לבחון עיבוד מטבולית, תפקוד הורמונלי, מטבוליזם התרופה ורעילות כמו גם חסינות ותגובות דלקתיות ^{9, 10.} פרוטוקולים הקודם בעיקר תארו את הבידוד האנזימטית של hepatocytes העיקרי מרקמות כבדות אנושי ^{11, 12.} בעוד מודל מצוין, זה משמיט את היכולת ללמוד כיצד מניפולציה גנטית משפיע מנגנוני איתות כבדה מורכבים כמו גם השלכות תפקודיות על סוגים של גירויים שונים. בחלק הבא, אנו מתארים את הבידוד של hepatocytes העיקרי murine. יש לציין, כי השפעת מספר מתווכים של התגובה חריפה פאזיים בכבד, כגון lipopolysaccharide (LPS), IL-6 ו- FGF23 ניתן לנתח באופן קל, מהיר לשחזור ^13.

בזאת, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד האנזימטית של hepatocytes מעכברים בוגרים, ואנחנו מראים כי מעוררים הוקמו של דלקת, כגון LPS ו- IL-6, כמו גם מתווכים דלקתיים רומן כגון FGF23, יכול ישירות לעורר ביטוי הפרשה ציטוקינים דלקתיים, כגון CRP ו- IL-6 ב hepatocytes תרבותי.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) מאוניברסיטת מיאמי מילר מבית הספר לרפואה.

1. הכנה

1. תקשורת וכבדה זלוף כבד מחממים לעכל תקשורת באמבט מים ב 37 ° C.
2. גדר משאבת זלוף (30 mL / min). בזהירות ולמלא מראש את מערכת הצינורות של המשאבה עם תקשורת זלוף הכבד. הימנע מכל בועות אוויר במערכת ולהכין המיקרוסקופ stereotactic.
3. מנות תרבית תאים מעיילות באמצעות קולגן סוג אני על פי הפרוטוקול של היצרן.

2. שחזור כבד

1. להרדים את העכבר התורם באמצעות / חמצן משאיפת isoflurane (isoflurane 4% / 2 ליטר / דקה חמצן).
   1. לשמור על הרדמה באמצעות הורדת isoflurane ל 2-2.5% או על ידי הזרקת קטמין (100 מ"ג / ק"ג של משקל הגוף intraperitoneally) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג משקל גוף intraperitoneally). הרדמה isoflurane רציפה עדיפה מאז קטמין מורידה את לחץ הדם ויכול לגרום לרעילות כבדית.
2. מניח את העכבר מורדם על כרית ספיגה. תקן את הגפיים של העכבר עם סרט דביק.
3. לגלח ולחטא את הבטן של העכבר ולבצע פיום בטן גחון מן החיק לגבול גולגולתי של הכבד באמצעות מספרי כירורגיות עם טיפים חדים / קהים. לחתוך את דופן הבטן לשני הצדדים, זנב של הסרעפת.
4. לחשוף את הווריד הנבוב הנח (IVC) על ידי הזזת המעי בזהירות לצד ימין. בזהירות לנתח רקמות שומן סביב IVC באמצעות מטליות קצה כותנה סטרילית מלקחיים קצה זוויתי.
5. לחתוך את הסרעפת suprahepatic ולפתוח את חלל בית החזה על ידי שני חתכים לרוחב באמצעות מספריים כירורגיות בסדר עם טיפים חד / חדות. ולקשור את IVC החזה באמצעות משי כירורגית (5/0).
6. Cannulate את IVC infrarenal באמצעות צנתר iv מוגן, להוציא את המחט בזהירות,לחבר את משאבת זלוף ולהתחיל מרוססת הכבדה. אם ביצע כראוי, הכבד צריך מיד להתחיל מחווירות להתנפח.
7. Transect פורטל וריד המאפשר ניקוז מתאים של תקשורת דם זלוף באמצעות מספרי כירורגיות בסדר.
8. Perfuse את הכבד עם כ 30 מ"ל של התקשורת זלוף הכבד, ולאחר מכן לעבור הכבד לעכל מדיה (30 מ"ל). כבה את המשאבה זלוף ולהסיר את הצינורית פעם זלוף תושלם.
9. בעדינות לחשוף את האזור המרכזי של הכבד ולאתר את רקמת חיבור המקשרת את האונה של הכבד. תפוס את סיבי חיבור המרכזיים ובזהירות לנתח כל הרקמות מחזיקות הכבד במקום בעדינות להסיר את הכבד.
10. מיד להעביר את הכבד לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של הכבד לעכל התקשורת.
    הערה: אין זמן אונליין ספציפי עבור שלב זה. לאחר זלוף, הכבד נשאר תקשורת לעכל להובלה כדי ברדס תרבית תאים סטריליים. כל זהצעדים ubsequent צריכה להתבצע בסביבה סטרילית.

3. בידוד וטיפול של תאים

1. בתוך מכסה מנוע תרבית תאים, להעביר את הכבד מתקשורת העיכול המכילה צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מיליליטר לתוך צלחת רקמת סטרילית תרבות.
2. בעזרת מלקחיים סטריליות, לקרוע את אונות הארבע בעדינות של הכבד. אם ביצע כראוי, בינוני העיכול צריך להיות עכורים בשל לבודד hepatocytes מהכבד.
3. בעזרת קצה פיפטה סטרילית 25 מיליליטר, לסנן מדיום העיכול העכור דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטים 50 מיליליטר פוליפרופילן חדש כדי להסיר חלקיקי רקמות מעוכלים ופסולת תא.
4. חזור על שלבי 3.2 ו -3.3 עם פוספט שנאגר מלוח סטרילית (PBS). זה מסייע בהסרת hepatocytes שיורית כל מהכבד.
5. צנטריפוגה ב 50 XG במשך 2 דקות ב 4 °. לשאוב supernatant המכיל פסולת התא עודף מחדש להשעות התאים בעדינות 25 1x מ"ל קרהבינונית 'וויליאמס E.
6. בעזרת קצה פיפטה סטרילית 25 מ"ל, לסנן מחדש ההשעיה דרך מסננת תא ניילון חדש 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל להשיג השעיה מנקה.
7. חזור על שלבי 3.5 ו -3.6 עבור שלושה שוטף נוסף באמצעות 'הקר וויליאמס הבינוני E 1x לקבל השעית תא ברורה.
8. לאחר שלב הכביסה הסופי, לשאוב supernatant כדי להסיר שאריות תאים עודפות. Re- להשעות ותאי מסנן 25 מ"ל חם 1x E מדיה 'וויליאמס המכיל הפשרת hepatocyte העיקרי ותוספי ציפוי דרך מסננת תא ניילון חדש 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל.
9. ספירת תאים בתוך 25 ההשעיה תא מ"ל באמצעות hemocytometer. צופים בממוצע 15 - 20 מיליון תאים לכל כבד מבוגר. לקבוע כדאיות התא באמצעות מכתים trypan כחול.
10. פלייט תאים 2 מ"ל של וויליאמס 'מדיה E 1x המכיל הפשרת hepatocyte העיקרי ותוספי ציפוי על קולגן מצופה ce 6 בארll אשכול תרבות (9 x 10 ⁵ תאים לכל טוב).
11. לאחר 4 שעות, לשנות התקשורת 1x E מדיה 'וויליאמס המכיל תוספי תחזוקה hepatocyte העיקרי.
12. לאחר 24 שעות, סרום להרעיב תאים עם מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) תקשורת 1x במשך 6 שעות.
13. פנקו את התאים עם PBS כמו רכב, FGF23 (25 ng / mL), LPS (100 מיקרוגרם / מ"ל) או IL-6 (50 ng / mL) במדיום סרום ללא דגירה במשך 24 שעות.

בידוד 4. של RNA

1. כן RNA באמצעות ערכת טור הספין מסחרית על פי הוראות היצרן.

5. יצירת cDNA מ- RNA מבודד על ידי שעתוק לאחור

1. הוספת 200 ננוגרם של מדגם RNA בודד לצינור PCR.
2. להוסיף 14 μL של endonuclease ללא H ₂ O PCR צינור משלב 5.1.
3. הוסף 4 μL של transcriptase הפוך צינור PCR משלב 5.1.
4. Re- להשעות תוכן בעדינות לעשות תערובת הומוגנית; צנטריפוגות בעדינות.
5. מניחים צינור PCR המכיל את התערובת לתוך thermocycler. thermocycler לרוץ שעתוק לאחור: 1 מחזור של 25 מעלות צלזיוס (5 דקות), 42 ° C (30 דק '), 85 ° C (5 דקות) ולאחר מכן החזק על 4 מעלות צלזיוס. התוצר הסופי יהיה cDNA הרצוי.

6. ניתוח של תאים על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)

1. מכין את צלחת 96-היטב.
   1. מניחים את כל מרכיבי התגובה qPCR על הקרח: 1 μL cDNA, .25 פריימר קדימה מיקרומטר, .25 פריימר הפוכה מיקרומטר, 5 μL SYBR גרין, 3.5 מים כיתה μL PCR כדי בהיקף כולל של 10 μL. באמצעות SYBR הירוק, להכין תערובת הורים כדי להפעיל את כל דגימות בשלושה עותקים.
   2. לאחר לערבב מאסטר יושלם, מערבולת לעשות הומוגנית. Aliquot 9 μL של qPCR תערובת אמן לבאר כל צלחת 96-WLL. לאחר, בזהירות להוסיף 1 μL של cDNA לבאר כל אחד. עוצמת התגובה סך הכל יהפוך 10 μL.
   3. לאחר הטעינה הושלמה, לאטום צלחת 96-היטב עם אופטיסרט דבק צלחת 96-היטב בקצרה צנטריפוגות (50 XG דקות 1).
2. דגימות מפעילים מכשיר Real Time-PCR. מניחים צלחת 96-היטב אטום לתוך מכשיר Real Time-PCR ודוגמאות לרוץ לפי המלצות היצרן המכשיר. דוגמאות של מחזורי רגיל ומהיר כלולות להלן.
   1. עבור הפרמטרים רכיבה רגיל, השתמש בנוסחה הבאה: denaturation הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 120 שניות, ואז 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ולאחר מכן החזק אופציונלי על 4 מעלות צלזיוס.
   2. עבור הפרמטרים רכיבה מהירה: השתמש בנוסחה הבאה: denaturation הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואז 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ולאחר מכן 72 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות.
3. עיין במדריך מכשיר להדרכה כיצד לנתח נתונים.

ניתוח 7. Supernatants Cell ידי ELISA

הערה: כל הצעדים מבוצעים על פי הפרוטוקול של היצרן.

1. לדוגמא הכנה
   1. לוותר 398 μL של diluent לתוך צינורות נפרדים. פיפטה 2 μL של המדגם supernatant התא לתוך הצינור diluent 398 μL. זה יספק קפל דילול של 200.
   2. חזור על שלב 7.1.1 עבור כל דגימה להיבדק.
2. תהליך
   1. פיפטה 100 μL של פי 200 מדגם בדילול ורמה לתוך הבארות של צלחת 96-היטב.
   2. דגירת צלחת 96-היטב של 25 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות על שייקר microplate ב 150 סל"ד.
   3. שטפו את בארות 5 פעמים עם פתרון חיץ לשטוף 1x. לאחר לשטוף האחרון הושלם, להסיר את כל הפתרון לשטוף שיורית עם נייר סופג.
   4. הוספת 500 μL של מגיב HRP-המצומד לבאר כל אחד.
   5. חזור על שלבי 7.2.2 - 7.2.3.
   6. פיפטה 100 μL של tetramethylbenzidine (TMB) מגיב לבאר כל צלחת 96-היטב.
   7. בעדינות מערבבים בצלחת 96-גם על 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על microplateשייקר ב 150 סל"ד. עצור את התגובה על ידי הוספת ישירות 100 μL של פתרון להפסיק היטב כל ומערבבים בעדינות. לאחר הפתרון להפסיק מתווסף הצבע צריך להפוך צהוב. זה מודיע כי הפתרון להפסיק כבר מעורבב כהלכה.
   8. באמצעות קורא צלחת microtiter, לקבוע את הצפיפות האופטית ב 450 ננומטר בתוך 5 הדקות הראשונות.
3. חישוב התוצאות
   1. חישוב טבלת ערכים ספיגת הממוצע ₍₄₅₀₎ עבור כל דגימה כל תקן.
   2. להרכיב עקומת סטנדרט ידי התוויית מתכוון ₄₅₀ של כל תקן נגד ריכוז הסטנדרטי שלה ב ng / mL על גרף ליניארי. אפשר ציר x לייצג את הריכוז ואת ציר y לייצג ₄₅₀ ערכים.
   3. ניצול מתכוון ₄₅₀ מכל מדגם בדילול מלא, לקבוע את הריכוז של החלבון הרצוי ב ng / mL מעקום סטנדרטי.
   4. הכפל את הריכוז מדגם על ידי הדילול פקטוr. זה יאפשר לקביעת ריכוז בפועל של החלבון הרצוי במדגם supernatant התא.
   5. מגרש השולחן בנוי דגימות לתוך גרף קו. אם ערכי OD ₄₅₀ ליפול מחוץ עקומת סטנדרט, דגימות צריך להיות מדולל כראוי ו-נבדק מחדש.
   6. נרמל תוצאות 500,000 תאים.

תוצאות

היסטולוגיה

נציג תמונות מיקרוסקופ האור של תאים מבודדים בתרבית ראשוניים מתוארות באיור 1A. ניתוח Immunocytochemical מוכיח כי hepatocytes מבודד מאוד להביע אלבומין (אדום) כמו גם הקולטן לגורם הצמיחה פיב...

Discussion

בידוד hepatocytes העיקרי מעכברים הוא כלי מהיר, זול ואמין ללמוד תגובות דלקתיות vivo לשעבר. אם מבוצע כהלכה, יכול להיווצר תוצאות בקלות לשכפל מבעוד מועד וחסכוניים. הנקודות הבאות יש לבחון בזהירות כדי להבטיח בידוד מוצלח.

החתך כירורגית וא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer	Falcon	352350
BD Insyte Autoguard	BD	381412
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2	Becton Dickinson	329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style	Corning	353003
6 well Cell Culture Cluster	Costar	3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)	LOOK	SP115
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump	Gilson	F155007
Hemacytometer Kits, Propper	VWR	48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper	VWR	48300-470
Surgical Scissers - Sharp/Blunt	F.S.T.	14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight	F.S.T.	14058-11
Dumont SS-45 Forceps	F.S.T.	11203-25
Student Tissue Forceps	F.S.T.	991121-12
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N	Sigma	A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL	Piramal Healthcare	66794-013-25
KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)	VEDCO	50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL	AnaSed Injection	139-236
Willams' Medium E (1x)	gibco	12551-032
Liver Perfusion Medium (1x)	gibco	17701-038
Liver Digest Medium (1x)	Life Technologies	17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements	Life Technologies	CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements	Life Technologies	CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4	ThermoFisher scientific	10010031
Collagen Type 1	Corning	354236
Trypan Blue Solution	VWR	45000-717