ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

Summary

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.

Abstract

הסינפסה החיסון הוא האזור של תקשורת בין תאי T, תאים אנטיגן (נגמ שים). תאי T polarize רצפטורים משטח וחלבונים לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית כדי להבטיח איגוד יציב אות exchange. מיקרוסקופ קונפוקלי, TIRF או רזולוציה סופר קלאסי שימשו ללמוד הסינפסה המערכת החיסונית. מאז שיטות אלו דורשות ייבוא תמונות ידנית, כימות גוזלת זמן, ההדמיה של מאורעות נדירים הוא מאתגר. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המאפשרת ניתוח מורפולוגי של עשרות אלפי תאים. הסינפסות המערכת החיסונית הם המושרה בין ראשי בתאי T אנושיים בהכנות פאן-ליקוציט Staphylococcus aureus enterotoxin ראג'י טעון-B SEB תאים כמו נגמ שים. ייבוא תמונות מתבצע באמצעות הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ, המשלבת תכונות של cytometer זרימה של מיקרוסקופ זריחה. אסטרטגיה חסימה מלאה לזוגות תא T/APC ואבחון הסינפסות החיסון הינו מסופק. כאשר זרימת עבודה זו מאפשרת הניתוח של החיסון synapses בהכנות ולזרימה פאן-ליקוציט ודורש ומכאן רק נפח קטן של דם (קרי, 1 מ"ל), ניתן להחיל אותה על דגימות מחולים. חשוב לציין, מספר דגימות מוכן, ולהשוואה ניתח במקביל.

Introduction

תאי T הרגולטורים העיקריים של מערכת החיסון מסתגלת, מופעלים באמצעות פפטידים antigenic המוצגים בהקשר של מתחמי histocompatibility הגדולות (MHC). הפעלה מלאה של תא T דורש שני אותות, האות כשירות באמצעות הקולטן תא T אנטיגן ספציפי (TCR) / CD3 מתחם, האות costimulatory באמצעות קולטנים אביזר. שני אותות שנוצרו באמצעות האינטראקציה הישירה של תאי T עם אנטיגן תאים (נגמ שים). נגמ שים בוגרים מספקים את האות מיומנות להפעלת T-cell דרך MHC-פפטיד מתחמי, הם מבטאים ליגנדים costimulatory (למשל, CD80 או CD86) כדי להבטיח את ההתקדמות של T-cell הפעלה¹. פונקציה חשובה אחת של costimulation היא התארגנות מחודשת של^3,42,שלד התא אקטין. בקליפת המוח F-אקטין היא סטטית יחסית ב נח בתאי T. תא T גירוי דרך מניבי אנטיגן נגמ שים מוביל שחלוף עמוקה של שלד התא אקטין. אקטין דינמיקה (קרי, אקטין מהר פלמור/depolymerization מעגלים) מאפשרים תאי T ליצור כוחות אשר משמשים להעברת חלבונים או organelles, למשל. יתר על כן, שלד התא אקטין חשוב לפיתוח אזור קשר מיוחד בין תאי T נגמ שים, שנקרא הסינפסה המערכת החיסונית. בשל חשיבות שלד התא אקטין את הסינפסה המערכת החיסונית, זה הפך חיוני לפתח שיטות כדי לכמת שלד התא אקטין של T תאים^5,6,7,8 שינויים ^{, 9}.

על-ידי סיוע cytoskeletal אקטין, קולטנים משטח וחלבונים איתות מובדלים באשכולות הפעלה סופרא מולקולרית (SMACs) בתוך הסינפסה המערכת החיסונית. היציבות של הסינפסה המערכת החיסונית מובטחת על ידי קשירה של קולטני חבילות F-אקטין המגבירים את האלסטיות של שלד התא אקטין. היווצרות סינפסה החיסון הוכח להיות קריטית עבור הדור של ההיענויות החיסון מסתגלת. השפעות מזיקות של צורה פגומה סינפסה המערכת החיסונית ויוו התממשו קודם בחולים הסובלים מ תסמונת אולדריץ ויסקוט (WAS), מחלה אשר פלמור אקטין, / ת, נגרמת הפרעה היווצרות מערכת החיסון סינפסה¹⁰ . היה מטופלים עלולים לסבול אקזמה, דלקות חוזרות ונשנות חמורים, מחלות אוטואימוניות, מלנומה. למרות ממצא זה, כרגע לא ידוע אם המערכת החיסונית סינפסה היווצרות שונה בתאי T אנשים בריאים וחולים הסובלים החיסון מולדים או מחלות אוטואימוניות.

מיקרוסקופ פלורסצנטיות, כולל וידאו, TIRF, סופר-רזולוציה מיקרוסקופ, שימשו לגלות את הארכיטקטורה המערכת החיסונית סינפסה^11,12,13,14. הרזולוציה הגבוהה של מערכות אלה ועל האפשרות של ביצוע הדמיה לחיות תאים מאפשרת איסוף מידע מדויק, -עתיים על שלד התא של אקטין, פני שטח או תאיים חלבונים ב הסינפסה המערכת החיסונית. עם זאת, תוצאות רבות, מבוססות על ניתוח רק כמה עשרות תאי T. יתר על כן, תאי T חייבים להיטהר עבור סוגים אלה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עבור שאלות מחקר רבות, השימוש של תאים ולזרימה ולא את הרזולוציה הגבוהה ביותר-האפשר זאת, חשיבות עליונה. זה רלוונטי אם T תאים מחולים מנותחים, שכן כמות הדם שנתרמו מוגבל, ייתכן שיש צורך לעבד דוגמאות רבות במקביל.

הקמנו שיטות מיקרוסקופיים לאפשר הניתוח של שלד התא אקטין ב הסינפסה מחוסן^16,15,המערכת האנושית¹⁷. שיטות אלה מבוססות על הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ¹⁸. כמו הכלאה בין זרימה מולטי ספקטריאליות cytometry, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הדמיה cytometry זרימה יש הייתרונות בניתוח מורפולוגי פרמטרים ולוקליזציה חלבון באוכלוסיות הטרוגניות התא, כגון פאן-לויקוציטים מ דם היקפיים. הצגנו מתודולוגיה המאפשרת לנו לכמת F-אקטין ב- T-תא/APC conjugates של תאים אנושיים T מדגימות דם מלא, ללא צורך זמן רב ויקרות טיהור צעדים¹⁷. הטכניקה המובאת כאן כוללת כל זרימת העבודה, מלקבל את דגימת הדם על כימות של F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת פאן-לויקוציטים

1. צייר 1 מ"ל של דם היקפיים תורם בריא (או החולה) במזרק heparinized. הקפד לקבל אישור על-ידי ועדת האתיקה אחראי על תרומת דם.
2. לערבב 1 מ"ל של ציוד היקפי האנושי דם עם 30 מ של מאגר פירוק ACK (150 מ מ NH₄קלרנית, 1 מ מ KHCO₃ו- 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.0) בשפופרת 50 מ ל, תקופת דגירה של 8 דקות בטמפרטורת החדר.
3. למלא את הצינורות עם PBS, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 6 דקות לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב30 מ"ל ACK פירוק המאגר.
4. חזור על שלבים 1.2 ו- 1.3 עד תגובת שיקוע ברור. לבסוף, רוחצים את התאים ב- PBS, צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר, את resuspend בגדר תא ב- 2 מ של תרבות בינוני (RPMI1640 + 10% FCS). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

2. טעינת ראג'י תאים עם סאב

1. להכין שני צינורות בז 15 מ"ל עם 1.5 x 10⁶ תאים ראג'י למחזור. ספין למטה התאים (300 x g למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר) וזורקים את תגובת שיקוע.
2. Resuspend התאים שיורית בינוני (בערך 50 – 100 µL), להוסיף µL 1.9 (1.9 µG) סאב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות הוסף 5 מ של תרבות בינוני, ספין למטה התאים (300 x g למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר) ואת resuspend בגדר תרבות בינוני (RPMI 1640 + 10% FCS)-צפיפות של עונה 1 פרק 10⁶ תאים/מ ל....

3. אינדוקציה של המערכת החיסונית הסינפסות, צביעת פרוטוקול

1. פיפטה µL 500 של הכנת ראג'י טעון-SEB תאים לתוך צינור FACS, 500 µL ההכנה של תאים ראג'י לפרוק לתוך צינור FACS אחר. להוסיף µL 650 פאן-וחריגה של כל צינור ו ספין למטה התאים (300 גר' x 10 דקות בטמפרטורת החדר). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 150 µL של תרבות בינוני (RPMI1640 + 10% FCS). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס (בדרך כלל למשך 45 דקות).
2. בעדינות מערבולת התאים (10 s ב 1,000 סל"ד) ו להוסיף 1.5 מ של paraformaldehyde (1.5%) במהלך המערבולת כדי לתקן את התאים. לעצור את הקיבעון על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA. גלולה התאים (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר, resuspension בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS + 1% BSA לאחר המקננת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
3. גלולה (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר), resuspend תאי µL 100 של PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי permeabilize את התאים (96-ובכן לוח, בצורת U).
4. לשטוף את התאים PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין עם צנטריפוגה (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר), resuspend בגדר תא ב- 50 µL של PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין המכיל נוגדנים מתויג fluorophore או תרכובות (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150), ודאפי (1:3, 000)).
5. דגירה התאים בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות לשטוף את התאים 3 פעמים על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA + סאפונין 0.1%. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות בטמפרטורת החדר. Re-resuspend תאי µL 60 ל- PBS עבור הדמיה cytometry זרימה.

4. התמונה רכישה באמצעות Cytometer של זרימה

הערה: הבאים התמונה רכישה בהליך ניתוח ממצאים מבוססים על הדמיה cytometry זרימה באמצעות תוכנה כגון imagestream (IS100), אינספייר ורעיונות. עם זאת, cytometers זרימה אחרים תוכנת ניתוח יכול לשמש גם.

1. פתח ניתוח תוכנה על המחשב מחובר cytometer זרימה, לחץ על אתחל פלואידיקה של התפריט מכשיר הדמיה. להחיל את החרוזים ביציאה הנכונה כאשר תתבקש לעשות זאת.
2. לטעון את התבנית שתוגדר כברירת מחדל מתוך תפריט קובץ ולחץ על הפעל/התקנה. לבחור חרוזים מתוך התפריט הנפתח ' תצוגה '.
3. התאם את אלומת האור הבהיר-שדה על-ידי לחיצה על הגדר עוצמת אם הערך שצוין הוא מתחת ל-200.
4. הפעל את הכיול של שיגרת הבדיקה בכרטיסיה סיוע על-ידי לחיצה על התחל כל.
5. לחץ על סומק/נעל/לטעון ולהחיל את הדגימות בנמל השמאלי כאשר תתבקש לעשות זאת. לאחר טעינת התאים cytometer זרימה, לפתוח את המסווג תא ולהתאים את הערכים כדלקמן: שיא עוצמת הגבול העליון-1,022 עבור כל ערוץ, שיא עוצמת הגבול התחתון 50 בערוץ 2 (דאפי) וכל ערוץ 5 (CD3-Pe-TxR), אזור הגבול התחתון-50 ערוץ 1 (לצד פיזור) והגבול העליון ב- 1,500.
6. לשנות את עוצמת הלייזר עירור 405 ננומטר (15 מגוואט), 488 ננומטר (200 mW), ו 647 nm (90 mW) בכרטיסיה התקנה.
7. לעבור את התפריט הנפתח בתצוגת בין תאים, חרוזים כדי להעריך את ההתאמות כוח תא המסווג ולייזר.
   הערה: ודא כי כל התאים וזוגות תא נמצאו התצוגה תא כי תא גושים, פסולת, תמונות עם פיקסלים רווי נמצאים בתצוגה פסולת על-ידי שינוי המסווגים את התא ו/או כוחות לייזר עירור.
8. להגדיר השם לדוגמה ואת כמות תמונות לרכוש (15,000 – 25,000 לדוגמאות) ו-500 עבור פקדים פיצוי הכרטיסיה התקנה לחץ על התקנה/הפעלה כדי להפעיל את הרכישה.

5. ניתוח נתונים

1. העברת קבצים תמונת raw (.rif) אל המחשב ניתוח נתונים ופתחו את תוכנת ניתוח.
2. לייצר מטריצה פיצוי ועקוב אחר ההוראות של מהרשימה הנפתחת פיצוי. שמירת המטריקס פיצויים comp_Date.ctm.
3. פתח את קובץ תמונת raw לדוגמה (.rif) ולהחיל את comp_Date.ctm בחלון שמופיע לייצר את קובצי התמונה מדובבים (.cif), קובץ ניתוח הנתונים המוגדר כברירת מחדל (.daf).
4. פתח את קובץ התמונה מדובבים. המרת התמונות למצב צבע ולהתאים את טבלאות בדיקת מידע כדי לקבל צבעים אופטימלית גלוי בסרגל הכלים מאפייני גלריית תמונות. להשיג את התמונה התמזגו RGB באמצעות הכרטיסיה הפרדות של הכלים מאפייני גלריית תמונות.
5. פתח את מנהל מסכת מהרשימה הנפתחת ניתוח. ליצור מסכות להגדיר תאי T של הסינפסה המערכת החיסונית, כדלקמן:
   1. בחר את המסכה T-cell: "((Threshold_Ch05, 60) מילוי." בחר את המסכה העמק: "Valley(Ch02,3)." בחר את המסכה סינפסה T-cell: "T-cell המסכה של עמק (M02, Ch02, 3)."
6. פתח את מנהל תכונה מהרשימה הנפתחת ניתוח. לחשב את התכונות הבאות:
   1. עבור הביטוי CD3 סה ב- T תאים, בחר "Intensity_T-cells_Ch5." עבור הסכום הכולל של F-אקטין בתאי T, בחר "Intensity_T-cells_Ch6." להבעה CD3 הסינפסה המערכת החיסונית, בחר "Intensity_T-תא synapse_Ch5." עבור כמות F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית, בחר "Intensity_T-תא synapse_Ch6."
   2. כדי לחשב את השטח T-cell, בחר "Area_T-התאים." כדי לחשב את השטח סינפסה המערכת החיסונית T-cell, בחר "Area_T-תא סינפסה."
7. לקבוע את F-אקטין והעשרה CD3 ב הסינפסה המערכת החיסונית באמצעות המשוואה במנהל תכונה:
   
8. להחיל את האסטרטגיה הבאה חסימה באמצעות היסטוגרמות ומתכנן נקודה מאזור הניתוח (עבור עוד פרטים, ראה הפניות 17, 19):
   1. למחוק את התאים out-of-להתמקד על ידי התוויית "RMS_M2_Ch2 מעבר" בהיסטוגרמה; הגדר את הסף בגיל 15.
   2. מגרש בבית המשפט לביטחון המדינה נגד CD3 בעוצמה בחלקה נקודה. להגדיר שער על אירועים CD3-חיוביות.
   3. העלילה על "יחס" של M02 (דאפי כתם) לעומת האזור של M02 (דאפי כתם). שער ב- T-cell ללבישה ותא זוגות בהתאם. תקן לזוגות תא נכון תוך שימוש בשטח המסכה סינפסה, כפי שתואר לעיל^17,19.
   4. לקבוע את כמות F-אקטין ב- T-cell ללבישה ותאי T של T-תא/APC זוגות, האחוזים של F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

יעד מרכזי של השיטה המתוארת כאן היא כימות של העשרה חלבונית (למשל, F-אקטין) ב הסינפסה המערכת החיסונית בין אם פונדקאית נגמ שים (ראג'י תאים) ותאי T ב ולזרימה פאן-לויקוציטים נלקחו דגימות דם אדם בנפח נמוך (1 מ"ל). צילום מסך באיור 1 נותן סקירה של האסטרטגיה המגביל קריטי של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר כימות של המערכת החיסונית הסינפסות. בין תאי T אנושיים (ex-vivo) נגמ שים. ראוי לציין, פן כדוריות דם אדומות-lysed-לויקוציטים שימשו כמקורות T-cell, ביצוע פעולות טיהור T-cell לוותר. הקו תא B-cell לימפומה ראג'י שימש הפונדקאית נגמ שים. זה נושא יתרונות משמעותיים, שכן הוא מאפשר השוואות ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube	Falcon	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8662
Bovine Serum Albumin	Roth	#8076.3
Saponin	Sigma	S7900
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	#16005
FACS Wash Saponin		PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
Speed Bead	Amnis	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Enterotoxin SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Phalloidin-AF647	Molecular Probes	A22287	1:150
IS100	Amnis		Imaging flow cytometer
IDEAS	Amnis		Software
INSPIRE	Amnis		Software