ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות

Summary

כאן, אנו מראים כיצד לנתח ניתוב הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית בעמודות ושכבות. זרימת העבודה כוללת טכניקת דימות כפול במטרה לשפר את איכות התמונה ואת בכלים חישוביים לאיתור, רישום סוכות דנדריטים למערך טור התייחסות לניתוח מבנים הדנדריטים בחלל 3D.

Abstract

באזורים רבים של מערכות עצבים המרכזיות, כגון אונות זבוב הראייה ואת קליפת החולייתנים, מעגלים הסינפטי מאורגנים בשכבות ועמודות כדי להקל חיווט המוח במהלך התפתחות ועיבוד מידע בחיות מפותחות. Postsynaptic נוירונים דנדריטים משוכללים בדפוסי סוג ספציפי בשכבות ספציפיות סינפסה עם מסופי presynaptic מתאימים. Neuropil לשד זבוב מורכב 10 שכבות וכ 750 עמודים; כל טור מעוצבבים על ידי דנדריטים של מעל 38 סוגים של נוירונים מוארכים, אשר תואמו עם מסופי axonal של כ -7 סוגים של afferents באופן סוג ספציפי. דו"ח זה מפרט את הנהלים תמונה ולנתח דנדריטים של נוירונים לשד. זרימת העבודה כוללת שלושה חלקים: (i) בסעיף ההדמיה הכפול-הנוף משלב שתי ערימות תמונת confocal שנאספו אורינטציות מאונכות לתמונת 3D ברזולוציה גבוהה של דנדריטים; (Ii) דנדריט התחקות וסעיף רישום עקבות הדנדריטיםסוכות ב 3D ורושמת עקבות הדנדריטים למערך טור הפניה; הסעיף (iii) בניתוח הדנדריטים מנתח דפוסי הדנדריטים ביחס עמודות ושכבות, כוללים סיום שכבה ספציפית והשלכה מישוריים לכיוון סוכת דנדריטים, ונובע הערכות של הסתעפות הדנדריטים ותדרי סיום. הפרוטוקולים לנצל plugins נבנה בהתאמה אישית על MIPAV הקוד הפתוח (עיבוד הדמיה רפואי, ניתוח, ויזואליזציה) ארגזי כלי פלטפורמה אישית בשפת מעבדת מטריקס. יחד, פרוטוקולים אלה מספקים עבודה מלאה לנתח את ניתוב הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית בשכבות ועמודות, לזהות סוגי תאים, ולקבוע פגמים מוטציות.

Introduction

במהלך פיתוח, נוירונים דנדריטים משוכללים מורכבים אך שבלונות דפוסי קנים כדי ליצור סינפסות עם שותפי presynaptic שלהם. דפוסי הסתעפות דנדריטים לתאם עם זהות ופונקציות עצביות. המיקומים של סוכות דנדריטים לקבוע את סוג תשומות presynaptic שהם מקבלים, בעוד הדנדריטים הסתעפות גדלים מורכבי שדה למשול מספר הקלט. לפיכך, תכונות מורפולוגיות הדנדריטים הם גורמים קריטיים עבור קישוריות הסינפטי וחישוביות עצבית. באזורים רבים של מוחות מורכבים, כגון אונות האופטיות הזבוב לבין הרשתית החולייתנים, מעגלים הסינפטי מאורגנים בעמודות ושכבות כדי להקל מידע עיבוד ^{1, 2.} בארגון טור שכבה כזה, נוירונים presynaptic של אקסונים פרויקט אפנות ברורים לסיים ב שכבה מסוימת (מה שנקרא מיקוד שכבה ספציפית) וליצור מערך דו ממדים מסודר (מה calleמפה טופוגרפית ד), ואילו נוירונים postsynaptic להאריך דנדריטים בגדלים המתאימים שכבות ספציפיות כדי לקבל תשומות presynaptic לגבי סוגם המספרים הנכונים. בעוד אקסונלית מיקוד לשכבות ועמודות כבר גם למדה ^{3, 4,} הרבה פחות ידוע על כמה דנדריטים מנותבים שכבות מסוימות ולהרחיב בגודל מתאים שדות פתוחים כדי ליצור קשרים סינפטיים עם שותפי presynaptic הנכונים ^5. הקושי של הדמיה וכימות הדנדריטים מיקוד לשכבות ועמודות עיכב את חקר התפתחות דנדריטים במבנים במוח כמו עמודים למינציה.

נוירונים לשד תסיסנית מהווים מודל אידיאלי ללימוד ניתוב הדנדריטים והרכבה מעגל בעמודות ושכבות. Neuropil לשד לטוס מאורגן כמו סריג 3D של 10 שכבות וכ 750 עמודות. כל טור מעוצבבים על ידי קבוצה של afferents, כולל photoreceptors R7 / R8 ו lamina נוירונים L1 - L5, אשר מסופי אקסונלית ליצור מפות טופוגרפיות באופן שכבה ספציפית ^6. כ -38 סוגים של נוירונים לשד נוכחים בכל טור לשד דנדריטים משוכלל בשכבות ספציפיות עם גדלים בשדה מתאימים לקבל תשומות מן afferents אלה ^7. המעגלים הסינפטי לשד שוחזרו ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים; וכך, השותפויות הסינפטי מבוססות היטב ^{7, 8.} יתר על כן, כלים גנטיים תיוג סוגים שונים של נוירונים לשד זמינים ^{9, 10, 11.} על ידי בחינת שלושה סוגים של transmedulla (Tm) נוירונים (TM2, Tm9 ו Tm20), זיהינו בעבר שתי תכונות הדנדריטים תא מסוג ספציפי: (i) נוירונים Tm להקרין דנדריטים באחת בכיוון הקדמי או האחורי (proj מישורייםשיקוף כיוון), בהתאם לסוגי התאים (ii) דנדריטים של נוירונים לשד לסיים בשכבות לשד ספציפיות באופן תא מסוג ספציפי (סיום ספציפי שכבה) ^12. כיוון היטל מישורים והפסקה ספציפי שכבה מספיק כדי לבדל את השלושה סוגי נוירונים TM, תוך מוטציות שמפריעות תגובות Tm לרמזי שכבה ו בעמודה משפיעות היבטים שונים של תכונות אלה.

כאן, אנו מציגים עבודה מלאה לבחינת דפוסים הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית בעמודות ושכבות (איור 1). ראשית, אנו מציגים שיטת הדמיה כפול-נוף, אשר משתמשת תוכנה מותאמת אישית כדי לשלב שתי תמונת confocal ערימות ליצור תמונות איזוטרופיים באיכות גבוהה. שיטה זו דורשת מיקרוסקופ confocal הקונבנציונלי רק כדי ליצור תמונות באיכות גבוהה המאפשרות מעקב האמין של סניפים הדנדריטים, בלי להזדקק מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה, כזההים STED (דלדול פליטה מאולץ) או תאורה מבנית. שנית, אנו מציגים שיטה לאיתור סוכות דנדריטים לרישום עקבות neurite וכתוצאה מכך למגוון טור התייחסות. שלישית, אנו מציגים את השיטות חישוביות לחילוץ מידע על כיוון הקרנת מישוריים סיום ספציפי שכבת דנדריטים, כמו גם לגזירת אומדנים עבור הסתעפות הדנדריטים ותדרי סיום. יחד, כל אלה מאפשרים לאפיון דפוסי הדנדריטים ב -3 D, הסיווג של סוגי תאים מבוססים על מורפולוגיות הדנדריטים, ואת ההזדהות של פגמים פוטנציאליים מוטנטים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: הפרוטוקול מכיל שלושה חלקים: הדמיה כפול-נוף (סעיפים 1 - 3), מעקב הדנדריטים ורישום (סעיפים 4 - 6), וניתוח הדנדריטים (סעיפים 7 - 9) (איור 1). הקודים והקבצים למשל ניתנים בטבלה של חומרים / ציוד.

1. כפול-Image Acquisition

הערה: צעד זה נועד לרכישת שתי ערימות תמונה של הנוירון של עניין שני מאונך (אופקי חזיתית) אוריינטציות.

1. כן מוח זבוב המכילים שכותרתו בדלילות נוירונים לשד (~ 10 תאים / מוח באונה) בטוש GFP הממברנה (mCD8GFP), כפי שתואר לעיל ^12. הכתם המוח עם ארנב-GFP אנטי (עבור דנדריטים נוירון לשד) ועכבר mAb24B10 (עבור אקסונים קולטי האור), נוגדנים ראשוניים, ו נוגדנים משני ניאון (Alexa 488 נגד ארנב אלקסה 568 נוגדנים אנטי עכבר), כפי שתואר לעיל13. נקה את המוח גליצרול 70% ב 1x PBS.
2. כדי לעגן את המוח בכיוון אופקי (איורים 2A, B), להעביר את המוח זבוב פינה גליצרול ירידה של 20 μL של antifade הרכבה בינונית במרכז שקופית.
3. צרף טלאים קטנים של חימר ב -4 הפינות של coverslip כדי למנוע את coverslip מוחץ מדגם המוח במהלך גובר.
   הערה: מדבקות החימר לספק ריפוד כדי למנוע את coverslip מוחץ המדגם. כל מדבקה חימר צריך להיות בערך 1 מ"מ קוטר.
4. תחת מיקרוסקופ לנתח, מקם את המוח במצב הגחון-מעלה למקם את coverslip על גבי כדי לאבטח את המוח. השתמש שטח הגבי הקמור של מוח כציון דרך לזהות את הכיוון של מדגם המוח (איור 2 א).
5. השג את ערימת התמונה הראשונה (תצוגה אופקית) באמצעות מיקרוסקופ confocal. השתמש עדשה אובייקטיבית גבוהה NA (כגון טבילת 63X 1.3 NA גליצרול או שמן objeהעדשה ctive) וזום דיגיטלי פי 2.5 (בגודל פיקסל הוא 0.105 מיקרומטר לפיקסל; מספר מיצוע הוא 2). רוכש יותר מ -180 חלקים אופטיים (512 x 512 פיקסלים) כדי לכסות את neuropil הלשד עם גודל צעד של 0.2 מיקרומטר.
6. טען מחדש את המוח כמתואר בשלבים 1.3 - 1.4, אבל ליישר את המוח במצב הקדמי-עד (חזיתי).
7. רוכש את ערימת התמונה השנייה (חזיתי) של אותו נוירון, כמתואר בשלב 1.5.
   הערה: המציאה אותו נוירון עלולה להיות מאתגר כשיש נוירונים רבים שכותרתו באונה האופטית. כדי לזהות אותו נוירונים מ האוריינטציות הן, ערימות תמונה נמוכה הגדלים מתצוגות הן ייתכן שתידרשנה (למשל, משתמש זום של 0.7, וגודל צעד של 0.45 מיקרומטר לרכוש ערימות תמונה ברזולוציה נמוכה). אם התמונה גדולה יותר 512 x 512, התמונה צריכה להיות קצוץ 512 x 512 לפני שילוב תמונה, ואת גודל פיקסל צריך לשמור על 0.105 מיקרומטר לפיקסל בעוד הדמיה השדה הגדול. הפסד של האותהוא בעיה פוטנציאלית עבור רקמות עמוקות. אם האות חלש, תמונה במחצית הגחון של המוח. כדי להפחית photobleaching במהלך סריקה, השתמש נמוך כוח ליזר ככל האפשר. השתמש אינדיקטור הטווח כדי לבדוק חשיפה לפני רכישת ערימות תמונה. במידת האפשר, השתמש במיקרוסקופ confocal מצויד גלאי Gaasp.
8. לזהות ולתעד את המיקום של הנוירון של עניין ביחס neuropil לשד (ימין / שמאל [R / L] ועל הגב / הגחון [D / V]). בדקו אם המדגם עבר במהלך רכישת תמונה על ידי בחינת מחסנית התמונה.
   הערה: מרגש מדגם הוא לעתים קרובות בשל הרכבה לא נכונה. אם התנועה מדגם מתרחשת, את ערימת התמונה לא יכול לשמש לרישום אמור להיות מושלך. Re-הר המדגם ולרכוש ערימות תמונה מאותו נוירון.

Deconvolution תמונה 2.

הערה: שלב deconvolution משתמשת בתוכנת deconvolution תמונה כדי לשחזר את התמונות רכשו כי מפורקות על ידי טשטושורעש. בעוד צעד זה אופציונלי, זה משפר את איכות התמונה באופן משמעותי. מומלץ להשתמש ערימות התמונה deconvolved לרישום תמונה שילוב בסעיף 3.

1. הפעילו את תוכנית deconvolution במצב אינטראקטיבי. טען את ערימת התמונה (ב LSM או בפורמט מיקרוסקופי ספציפי) על ידי בחירת תפריט: קובץ / פתח (או-o Ctrl) בחלון הראשי.
2. לחץ כדי לבחור את ערימת תמונה הטעונה ולבחור תפריט: Ops כדי לפתוח את חלון פעולת תמונה. השתמש MLE נראות מקסימלית קלאסי ברירת המחדל (CMLE) אלגוריתם.
3. בחלון מבצע התמונה, לחץ על כרטיסיית "פרמטרים". הזן את הפרמטרים המתאימים עבור מדיום טבילת עדשה, הטבעה בינונית, ו צמצם מספרי (למשל, שמן, גליצרין, וכו.) (למשל, טבילה שמנה, וכו '.) (NA; כאן, 1.3 היה בשימוש). בדקו את הפרמטרים הנותרים כדי לוודא שהם משקפים נכונים את תנאי ההדמיה. לחץ על כרטיסיית "כוון את כל האומה" סנפירAlize הגדרות פרמטר.
4. בחלון מבצע התמונה, לחץ על הכרטיסייה "מבצע". הקצאת יעד פלט (למשל, ג). זן מספרים מתאימים "אות / רעש לערוץ" (למשל, "12 12 12 12" הוא נקודת התחלה טובה, תוך הגדרת ברירת המחדל היא "20 20 20 20"). השתמש בהגדרות ברירת מחדל עבור הפרמטרים הנותרים.
5. לחץ על כרטיסיית "הפעלתפקודה" להתחיל deconvoluting ערימת התמונה; תהליך זה יכול להימשך עד עשרות דקות כדי להשלים, בהתאם למחשב.
6. בחלון הראשי, לחץ על ובחר את ערימת התמונה deconvolved. בחר תפריט: שמירה בשם כדי לשמור את התמונה deconvolved בפורמט קובץ תמונה ICS (.ics ו- .ids).
   הערה: כל ערימת תמונה יש שני קבצים: קובץ ics מכיל את פרטי הכותרת ואת קובץ המזהים מכיל מידע על תמונת הגלם.
   1. שנה את שמות הקבצים ערימה התמונה בהתאם לאוריינטציה הדמיה (למשל, שם התמונה אופקי-נוף יםנעצים H.ids ו H.ics ואת המחסנית תמונה חזיתית נוף F.ids ו F.ics).

3. שילוב תמונה כפול-נוף

הערה: שלב זה משלב תמונה שתי ערימות ליצור תמונות 3D ברזולוציה גבוהה באמצעות תוכנת MIPAV.

1. יצירת מטריצות עבור שילוב תמונה.
   1. הפעילו את תוכנית MIPAV. טען את ערימות התמונה H ו- F-ידי בחירה בתפריט: קובץ / פתח את התמונה (א) מדיסק (או Ctrl-F) /H.ids ו F.ids; החלון יציג שתי תמונות.
   2. בחר את תמונת H ידי לחיצה על התמונה ולבחור תפריט: Utilities / מרת כלים / RGB / אפור; החלון נראה GrayG, GrayB, ותמונות GrayR.
   3. GrayR ו GrayB סגור רק שמירה GrayG על החלון.
   4. בחר את תמונת F על ידי לחיצה על התמונה ולבחור תפריט: Utilities / כלי Conversion / RGB / אפור. החלון נראה GrayG1, GrayB1, ותמונות GrayR1.
   5. לסגור GrayR1 ו GrayB1 ולשמור GrayG1 רק על החלון. בשלב זה, רק GrayG ו GrayG1 הם על החלון.
   6. בחר את GrayG (שיא), לבחור תפריט: רישום תמונת אלגוריתמים / רישום / אופטימלי אוטומטי; על "רישום תמונה אוטומטי אופטימלי 3D" תיבת הדו-שיח יצוץ.
      1. בתוך אפשרויות קלט, לשנות את "דרגותחופש" מברירת המחדל "Affine-12" ל "ספציפית rescale-9." ב "סבב" מפתח -105 עד 105 "טווח דגימת זווית הסיבוב" (ברירת מחדל: -30 עד 30 מעלות), 10 ב "תוספת הזווית הגסה" (ברירת מחדל: 15 מעלות), ו -3 "פיין תוספת זווית "(ברירת מחדל: 6 מעלות).
   7. לחץ על אישור; מטריקס הראשון "GrayG_To_GrayG1.mtx" יופק שנשמר בתיקיית התמונה. סגור את כל חלונות התמונה והמשך לשלב הבא; שלב זה ייקח לפחות 15 דקות.
   8. טען את ערימות תמונת H ו- F תפריט בחירה: קובץ / פתח את תמונה (א) מדיסק (או Ctrl-F) /H.ids ו F.ids, כמו בשלב 3.1.1.
   9. בחר את תמונת H ידי לחיצה על התמונה ולבחור תפריט: Utilities / מרת כלים / RGB / אפור; את "RGB-> גריי" תיבת הדו-שיח יצוץ. לחץ על אישור; החלון יראה תמונות "HGray". שמור HGray ולסגור את תמונת H.
   10. חזור על שלב 3.1.9 עבור התמונה F; תמונות "FGray" תופענה על החלון. שמור FGray ולסגור את תמונת F; רק HGray ו FGray ייותר על החלון.
   11. בחר את תמונת HGray (סמן) ועבור אל תפריט: כלי טרנספורמציה אלגוריתמים / / מרה. "צלם המרה / דגימה מחדש" תיבת הדו-שיח יצוץ. לחץ על הכרטיסייה "דגימה מחדש" ולשנות את דגימה מחדש לגודל של "HGray" ל "FGray". לאחר מכן, לחצו על הלשונית "המרה" עומס "GrayG_To_GrayG1.mtx" על ידי בחירת "מטריקס קרא מקובץ." לחץ על אישור; החלון יציג את תמונת HGray_transform. סגור את התמונה HGray כך רק HGray_transform ו FGray נותרים על החלון.
   12. בחר "את HGray_transform & #34; תמונה (סמן) ועבור אל תפריט: אלגוריתמים / רישום / אופטימלי תמונה אוטומטית רישום. תיבת הדו-השיח "אופטימלי אוטומטי תמונת הרישום 3D" יצוץ. ב "סבב" מפתח -5 עד 5 "מגוון דגימת זווית הסיבוב" (ברירת מחדל: -30 עד 30 מעלות), 3 ב "תוספת הזווית הגסה" (ברירת מחדל: 15 מעלות), ו -1 "פיין תוספת זווית "(ברירת מחדל: 6 מעלות). לחץ על אישור.
       הערה: המטריקס Affine (HGray_transform_To_FGray.mtx) תופק שנשמרה בתיקיית התמונה והתמונה "HGray_Transform_register" יוצגה על החלון. שלב זה ייקח לפחות 40 דקות.
   13. סגור את התמונה "HGray_transform"; רק "HGray_Transform_register" ו "FGray" יש להשאיר על החלון.
   14. בחר את התמונה "HGray_Transform_register" (סמן) ועבור אל תפריט: אלגוריתמים / רישום / B- שגם רישום אוטומטי 2D / 3D. Registrati האוטומטי "B- שגםעל-3D עוצם "תיבת הדו-שיח יצוץ. בחרי" ריבועים פחותים "בפונקצית העלות (ברירת המחדל הוא יחס מתאם).
       1. לחץ על "בצע שני עוקפי רישום". במקטע Pass 1, מפתח 2 לתוך "Descent Gradient מזער גודל שלב (יחידות מדגם)" (ברירת המחדל היא 1) והזינו 10 לתוך "מספר מרבי של חזרות:" (ברירת המחדל היא 10). במקטע Pass 2, מפתח 1 לתוך "Descent Gradient מזער גודל שלב (יחידות מדגם)" (ברירת המחדל היא 0.5) ואת מפתח 2 לתוך "מספר מרבי של חזרות:" (ברירת המחדל היא 10).
          הערה: מטריקס NLT, "HGray_transform_register.nlt," תישמר בתיקיית התמונה והתמונה "HGray_transform_register_registered" יוצגה על החלון. שלב זה ייקח לפחות 5 דקות.
   15. סגור את כל התמונות על החלון.
2. יצירת תמונת התייחסות שילוב תמונה.
   הערה: צעד זה נועד גנראכלתי תמונה אופקית רשומה עבור שילוב.
   1. ערימות H טען ותמונה F-ידי בחירה בתפריט: קובץ / פתח את התמונה (א) מדיסק (או Ctrl-F) /H.ids ו F.ids; שתי תמונות תופענה על החלון.
   2. בחר את תמונת H (סמן) ועבור אל תפריט: כלי טרנספורמציה אלגוריתמים / / מרה; "המרה / תמונת דגימה מחדש" בתיבת הדו-שיח יצוץ. לחץ על כרטיסיית "הדגימה מחדש" ולשנות את הדגימה מחדש מגודל של "H" ל "פ" לאחר מכן, לחצו על הלשונית "המרה" עומס "GrayG_To_GrayG1.mtx" על ידי בחירת "קרא מטריקס מקובץ." לחץ על אישור; תמונת H_transform תופיע על החלון. סגור את התמונה H אבל לשמור H_transform ו- F בחלון.
   3. בחר את התמונה "H_transform" (סמן) ועבור אל תפריט: כלי טרנספורמציה אלגוריתמים / / מרה; "המרה / תמונת דגימה מחדש" בתיבת הדו-שיח יצוץ. לחץ על כרטיסיית "הדגימה מחדש" ולשנות את הדגימה מחדש מגודל של "H_transform" ל "F. & #34; לאחר מכן, לחצו על הלשונית "המרה" עומס "HGray_transform_To_FGray.mtx" על ידי בחירת "קרא מטריקס מקובץ." לחץ על אישור; "H_transform_transform" התמונה תופיע על החלון. סגור את התמונה H_transform; בשלב זה, רק H_transform_transform ו- F ייותרו על החלון.
   4. בחר את התמונה "H_transform_transform" (סמן) ועבור אל תפריט: כלי טרנספורמציה אלגוריתמים / / מרה לינארית; בתיבת הדו-שיח "B- שגם טרנספורמציה לינארית" יצוץ. לאחר מכן, עומס "HGray_transform_register.nlt" ולחץ על אישור; "H_transform_transform_registered" התמונה תופיע על החלון. שמור את התמונה כקובץ ICS. סגור את כל התמונות על החלון.
3. שילוב ערימות תמונה
   הערה: שלב זה הוא לשלב בין שתי ערימות תמונה שנרכשו אורינטציות מאונכות (אופקיות חזיתית) לתוך ערימה ברזולוציה גבוהה אחת.
   1. עבור אל תפריט: תוספים / Generic / תסיסנית רשתית רגistrationl; את "v2.9 רישום תסיסנית רשתית" תיבת הדו-שיח יצוץ. העלה "H.ics" בצלמו H, "H_transform_transform_registered" משלב 3.2.4 ב תמונה H-רשומים, "F.ics" ב תמונה F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" משלב 3.1.7 ב טרנספורמציה 1-גרין (אופציונלי ,) "HGray_transform_To_FGray.mtx" משלב 3.1.12 ב טרנספורמציה 2-Affine, ו "HGray_transform_register.nlt" משלב 3.1.14 ב טרנספורמציה 3-קוי (לא חובה).
      1. בחר sqrt (F-Intensity x Intensity-H) ו- No rescale ב "Rescale H כדי פ" שמור את אפשרויות ברירת המחדל עבור הפרמטרים הנותרים. לחץ על אישור; שלב זה ייקח בערך 3 דקות.
         הערה: לאחר עיבוד, 3 סטים של תמונות יופקו: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (בתמונת recombined הסופית), greenChannelsImage-Gxreg-GY-Gcomp.IDS (ערוץ ירוק עבור H, F, ותמונת recombined הסופית), ו redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (מסלול אדום FOr H, F, והתמונה recombined הסופי); כל קבצי הפלט ישונה ל 512 x 512 x 512.
   2. "CombinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" פתוח תחת תוכנה להדמיה התמונה. שמור את מחסנית תמונה בפורמט IMS ו לשנות את שם הקובץ; קובץ תמונת recombined זה ישמש עקיבת neurite ורישום.

4. neurite האיתור ופניית הקצאת פוינט

הערה: שלב זה הוא להתחקות neurites (4.1) ו להקצות נקודות התייחסות לרישום (4.2) באמצעות תוכנת ויזואליזציה התמונה.

1. איתור neurites
   1. הפעל את תוכנת הדמיית תמונה. פתח את קובץ התמונה recombined. עבור אל תפריט: התאמת תצוגה ערוך / הצג ומכבים את ערוץ קולטי האור (אדום).
   2. דמיינו את התמונה במצב "לעלות". הפעל "סטריאו" ולהשתמש במצב "מאגר Quad" לדמיין תמונות 3D אם המחשב נמצא EQuipped עם מערכת stereograph.
   3. עבור אל תפריט: לעלות / חוטי זיכרונות להוסיף סיבים חדשים. לחץ על "דלג על יצירה אוטומטית, לערוך באופן ידני" כרטיסייה.
   4. לחץ על כרטיסיית "צייר" ובחר "AutoDepth."
   5. בחר "הגדרות" לבדוק "קו", והזינו מספר פיקסל מתאים ויזואליזציה טובה יותר (קו 4-פיקסל משמש בפרוטוקול זה). בדקו "צג דנדריטים," "נקודת התחלה" ו "נקודות מסעפות". גדר "לדקלם איכות" ל -100%.
   6. בחר בכרטיסייה "צייר" ולהתחיל התחקות neurites. התחל עם האקסון ולאחר מכן לעבור הדנדריטים (איור 2 ד). האקסון דנדריטים של נוירונים transmedulla הם קל להבחין.
      הערה: תא עצב Tm מרחיב האקסון מגוף התא פרויקטי כל הדרך למרכז עיבוד ויזואלי גבוה יותר, lobula. המערכת באופן אוטומטי להגדיר את הנימה הארוכה הראשונה בתור האקסון החלק והרסיסים הקצרים שנותרו כפידנדריטים. שמור לנקודת ההתחלה בתחילת הנימה (האקסון) במהלך מעקב ולוודא כי neurites לייחס מחוברים. בדוק את נקודות הסתעפות ואת נקודת ההתחלה. אם דנדריטים אינם מחוברים, נקודת התחלה חדשה תוגדר על הנימה שאינה מחוברת.
   7. לאחר התחקות, לחזור אל "הגדרות", בטל "נקודת ההתחלה" ו "בהתפצלות," וללכת תפריט: לעלות / אובייקטים שנבחרו ייצוא ../. שמור את הנימה כקובץ ממציא (* .iv).
2. הקצאת נקודות התייחסות
   1. בחר "לכיוון תצוגת צג" ולהדליק שני ערוצי ההדמיה. בדוגמה זו, ערוץ 1 הוא מכתים קולטי האור וערוץ 2 הוא הנוירון Tm20 (GFP).
   2. עבור אל תפריט: לעלות / מדידה. בחר את הכרטיסייה "ערוך" ולבדוק "ערוץ ספציפי:" (בחרו בערוץ קולטי האור [אדום]).
   3. הקצאת נקודות התייחסות השכבה העליונה. עבור אל תפריט: / לעלות / מדידה פויnts ליצור נקודות מדידה חדשות. לסמן את תחילתה של שכבת M1 כשכבה עליונה. סדר הנקודות הוא כדלקמן: קו משווה, קדמי-משווני, קדמי, קדמי-גחון, גחון, אחוריים-גחון, אחוריים, אחוריים-משווניים, ומרכז (איור 3F); להגדיר את קולטי אור מרכז כמי הקשורים תהליכים דנדריטיים ביותר.
   4. הקצה את שכבות R8 ו R7 כמו בשלב 4.2.3 (איור 3G). שלוש נקודות מדידת אדם צריכות להיוצר צעדי 4.2.3 ו 4.2.4.
   5. לייצא את הקואורדינטות של נקודות עבור כל שכבה. לחץ על הכרטיסייה "סטטיסטיקה", בחר "מפורט", "ערכים ספציפיים," ו "מיקום:" ולחץ על "יצוא סטטיסטיקות על תצוגת Tab כדי קובץ." שמירה בשם "ערכים מופרדים בפסיק" (* .csv).
   6. פתח את שלושת קבצי ה- CSV (בצעדיו 4.2.3 - 4.2.4) ולשלב את הקואורדינטות של 27 נקודות התייחסות לקובץ CSV חדש על ידי העתקה והדבקה (thדואר הסדר הוא למעלה, R8, ו R7). ראה טבלת החומרים / הציוד ובצע את הפורמט של הקובץ לדוגמא.

5. גוף קשיח ורישום TPS קוי

הערה: שלב זה הוא לרשום את עקבות neurite (בפורמט iv) למערך טור התייחסות כדי ליצור קובץ SWC רשום באמצעות תוכנית MIPAV. סעיף זה מחייב את הקבצים הבאים: ערימת התמונה recombined (.ids) משלב 3.3, קובץ נקודת התייחסות (csv) משלב 4.2, וקובץ נימת עקבות neurite (.iv) משלב 4.1.

1. עבור אל תפריט: תוספים / Generic / DrosophilaStandardColumnRegistration. החלון "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" יצוץ.
2. טען את קבצי תמונה (.ids), קובץ נקודות התייחסות (csv), וקובץ הנימה (.iv).
3. בחר 9 נקודות לכל שכבה.
4. בחר את המיקום של הנוירון הדמיה (LV / RD או RV / LD).
5. בחר "Registrati קשיחעל ו TPS "ו" רישום קשיח "כדי קוי ורישום-גוף קשיח, בהתאמה.
6. סמן את האפשרות 'צור קובץ SWC "כדי ליצור את קבצי הפלט הבא: קובץ עקבות neurite רשום בפורמט SWC (ראה חומרים ספציפיים / מכשור הגדרה), קובץ IV רשום (.iv), קואורדינטות של neurite הסטנדרטית (.txt), קואורדינטות טרנספורמציה (.txt), והתמונה המשולבת (.ids).
7. שינוי שם של קובץ SWC. החל את קיצור על המיקום לסוף שם הקובץ (שלב 1.7). לדוגמה, השתמש "Tm20_3_RV.swc" עבור נוירון Tm20 # 3 הממוקם במחצית הגחון של לשד הימני.

6. תקנון התצורה ימני גחון

הערה: שלב זה הוא להמיר את עקבות neurite (בפורמט SWC) כדי RV רגיל (לחיצה ימנית הגחון) תצורה באמצעות סקריפט מותאם אישית "RV_standardization.m." הנה, את התסריט כתב בשפת מעבדת מטריקס. השמות הקבצים SWC הקלט צריך להיות בפורמט הבא: "NeuronName _ _ מספר תצורת .swc" (למשל, Tm20_3_LV.swc).

1. פתח את התסריט "RV_standardization.m".
2. ערוך את הפרמטרים הבאים בסעיף "קלט משתמש":
   1. הקלד את שמותיהם של נוירונים ללא מספור (למשל, TM2, Tm20, וכו ') ב "neuron_names."
      הערה: ברירת המחדל ב "file_end_in" הוא "_ * SWC,." אשר מחפש קבצים בעלי שמות המכיל ( "*" הוא תו כללי התאמת מספר כלשהו של תווים) "_ * SWC.". ברירת המחדל של "swc_file_end_out" הוא "_f.swc," אשר יוסיף "_f" עד סוף את שם הקובץ לאחר סטנדרטיזציה.
   2. ציין את הספרייה שבה הקבצים SWC נמצאים "directory_in". ציין את הספרייה שבה הקבצים הסטנדרטיים ילכו "directory_swcout".
3. להריץ את הסקריפט.
4. Optional: השתמש Vaa3D ¹⁴ לדמיין את הקבצים SWC ולאמת את ההמרה.

7. מסעף דנדריטים חישוב ותדרי סיום

הערה: שלב זה משתמש-גוף נוקשה רשום קבצי SWC לחישוב אומדני Kaplan-Meier עבור הסתברות קטע הדנדריטים יגיע באורך נתון ללא סיום. סקריפט זה משתמש בשתי פונקציות Dendritic_Tree_Toolbox: extractDendriticSegmentLengthDistribution ו estimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. פתח את התסריט "Branch_term_P.m".
2. ערוך את הפרמטרים הבאים בסעיף "קלט משתמש":
   1. ציין את הנתיב לקבצי SWC הרשום גוף נוקשה "pathToSWCFiles" (למשל, / Rigid_Registered_swc /). ציין את הנתיב כי יקיים את פלט הגרפיקה ב "pathToOutput." ציין את שמו של נוירונים או סוגים עצביים "neuron_names" (למשל, TM2, Tm20, וכו ').
3. הפעל את התסריט; הפלטים הם עקומת אומדן קפלן-המאייר עבור הסתעפות הדנדריטים והפסקה.
   הערה: אופציונלית: ליישם את שיטת הולם הפונקציה לחלץ מן קפלן-המאייר אומד את ההסתברות המקומית כי במגזר הדנדריטים יהיה סניף או לסיים.

8. מגרש לחלוקת סיומת ספציפית שכבתית Arbors דנדריטים

הערה: שלב זה מגרש חלוקת מסופי הדנדריטים בשכבות לשד שונות בצורת תרשים עמודות. זה יכול להיות מיושם על נוירון אחד, קבוצה של נוירונים, או קבוצות של נוירונים. התסריט עושה שימוש בפונקציה extractDistributionAlongAxis מ Dendritic_Tree_Toolbox.

1. פתח את התסריט "Layer_term.m".
2. ערוך את הפרמטרים הבאים בסעיף "קלט משתמש":
   1. ציין את הספרייה שמכילה קבצים SWC רשום קוי ב "pathToSWCFiles" (למשל, / Non_linear_Registered_swc /). ציין את הספרייה עבור פלט גרפיקה ב "pathToOutput." ציין את שמו של נוירונים או סוגים עצביים "neuron_names" (למשל, TM2, Tm20, וכו ').
3. להריץ את הסקריפט הדרכה. הפלט הוא היסטוגרמה של הפרופורציה של בלוטות מסוף בשכבות לשד ספציפיות.

9. עלילת כיוון הקרנת המישורים של דנדריטים

הערה: שלב זה מגרש כיווני הקרנת מישוריים של דנדריטים כמזימת קוטב. התסריט עושה שימוש בפונקציה extractAngularDistribution מ Dendritic_Tree_Toolbox.

1. פתח את התסריט "Planar_proj.m."
2. ערוך את הפרמטרים הבאים בסעיף "קלט משתמש".
   1. ציין את הספרייה שמכילה את הקווים קבצי SWC רשומים "pathToSWCFiles" (למשל, / Non_linear_Registered_swc /). ציין את הספרייה עבור פלט גרפי "pathToOutput." ציין את שמו שלהנוירונים או סוגים עצביים "neuron_names" (למשל, TM2, Tm20, וכו ').
3. הפעל את התסריט; הפלט הוא מזימת קוטב של כיווני הקרנת מישוריים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות הליך ההדמיה הכפול-נוף המוצג כאן, מוח זבוב המכיל נוירונים Tm20 שכותרתו בדלילות היה צלם בשני כיוונים מאונכים. לפני ההדמיה, המוח היה מוכתם נוגדנים ראשוניים ומשניים מתאימים המאפשר הדמית אקסונים GFP ו קולטי אור קרום קשור. עבור הדמיה, המוח הוצב ראשון ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מראים כיצד התמונה ולנתח סוכות הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית. החלק הראשון, ההדמיה הכפולה VOD, מתאר את deconvolution שילוב של שתי ערימות תמונה לתוך ערימת תמונה ברזולוציה גבוהה. החלק השני, מעקב דנדריט ורישום, מתאר את העקיבה ורישום דנדריטים של נוירונים לשד למערך...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000