פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

Summary

בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.

Abstract

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Introduction

מחלת האלצהיימר היא הפרעה ניוונית של מערכת העצבים כי תופעות למעלה מ -35 מיליון בני אדם ברחבי העולם. ¹ מעורב מאוד ב שתחילתה והתפתחותה של המחלה, היא בטא עמילואיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד פפטיד (Aβ). ² Aβ נע בין 36 כדי 43 חומצות אמינו אורך, עם זאת, הוא חשב כי גרסת חומצה 42-אמינו, עמילואיד בטא 42 (Aβ42), הוא הצורה הרעילה ביותר של החלבון. ³ זה נובע לרוב ליכולת של Aβ42 להיווצר קושי diffusible, מינים oligomeric כי הם האמינו להיות ישויות הנוירו במיוחד. ⁴ על מנת לקדם את ההבנה שלנו של הפפטיד Aβ, זה הכרחי כדי להשיג חומר טוהר גבוה באופן שיגרתי. הנוכחות של זיהומי עקבות הוכחה לשנות את מאפייני נטיית צבירה דראמטי של הפפטיד. ⁵

Traditionally, כרומטוגרפיה הנוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) הפרדת פפטידים הידרופובי כגון Aβ נעשתה באמצעות שילוב של C ₄ או C ₈ שלבים נייחים מבוסס סיליקה לבין שלב נייד חומצי. ⁶ עם זאת, בתנאים כאלה יכולים להוות אתגר הטיהור של הפפטיד. הנקודה איזואלקטרית הנמוכה של הפפטיד Aβ (PI כ 5.5) ⁷ כלומר בתנאים חומציים, צבירת פפטיד הוא גדל וכתוצאה מכך רחבות, שאינו נפתרו פסגות HPLC כי הם לעתים קרובות קשים לבודד מיוצרים (איור 2 א). יתר על כן, פסגות רחבה כל כך בדרך כלל מכילות זיהומים היכולים להשפיע על פרופיל אגרגציה של הפפטיד, ובדרך כלל דורשים סיבובים הבאים של טיהור אשר יכול באופן דרמטי להשפיע על כמות פפטיד המיוצר.

פולי (סטירן / divinylbenzene) בשלב נייח, PLRP-S, מייצג אמצעים חלופיים תחנותפפטידים הידרופובי יינג. השלב נייח הועסק בתחום הטיהור של מספר חלבונים שונים וחומצות ריבונוקלאית שליח (mRNA). ^{8, 9} השלב נייח-S PLRP לא דורש ליגנד אלקיל נוספות עבור הפרדת פאזות הפוכה, ויותר מכך הוא יציב מבחינה כימית ב- pH גבוה אשר מוביל deaggregation של הפפטיד. ⁷ בזאת, אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 פפטידים (Aβ40).

Protocol

1. preparative טיהור HPLC של Aβ40 או פפטיד Aβ42

1. הכן את החוצצים הבאים לטיהור HPLC.
   1. הכן חיץ (20 מ"מ NH ₄ OH) על ידי הוספת 1.3 מ"ל של NH ₄ OH (פתרון 28%) 1,000 מ"ל מים ultrapure.
   2. הכן חיץ B (אצטוניטריל 80% עם 20 מ"מ NH ₄ OH) על ידי הוספת 1.3 מ"ל של NH ₄ OH (פתרון 28%) לפתרון של 800 מ"ל של אצטוניטריל HPLC כיתה ו -200 מ"ל מים ultrapure.
   3. הכן חיץ פירוק מדגם (0.1% NH ₄ OH) על ידי הוספת 100 μL של NH ₄ OH (פתרון 28%) ל -100 מ"ל של מים ultrapure.
2. הגדרת מכשיר HPLC כפי שמוצג באיור 1.
   1. התאימו את בקבוקי ממס המכילים חיץ A ו- B חיץ אל פתחי הכניסה של המשאבה HPLC באמצעות צינורות פולימר. צרף צינורות הפולימר למשאבת HPLC עם הולם מקשה אחת. ודא כי צינורות פולימר שלחיץ כל מצויד שסתום היניקה של המכשיר נכה. התאימו את המשאבה HPLC עם מסלק גזים.
   2. זוג המשאבה HPLC כשהמפרצון הטור preparative 300 8 מיקרומטר 25 מ"מ х 300 מ"מ (איור 1 ב ', כה בעמודה השמאלית, ראה רשימת חומרים) באמצעות צינורות פולימר.
      1. צרף צינורות הפולימר לעמודת preparative עם הולם מקשה אחת אצבע חזק. ודא כי בעמודת הפולימר היא מכוונת בצורה הנכונה.
         הערה: השלב הנייח של טור preparative מורכבת פולי (סטירן divinylbenzene) חלקיקים. את הכיוון הנכון של טור הפולימר מסומן על המארז החיצוני עם חצים כיוונית יחידים.
   3. חבר היציאה של העמודה לגלאי הגל הכפולים באמצעות צינורות פולימר מפעיל את גלאי גל 214 ננומטר ו -280 ננומטר.
      1. לשנות את אורך הגל על ​​ידי שינוי הפרמטרים גל איתור באפשרות שיטת מכשיר ההתקנה שלהתוכנה המובנית HPLC.
   4. צרף צינורות הפולימר אל המפרצון של גלאי הגל עם הולם מקשה אחת אצבע חזק. צרף צינורות פולימר אל שסתום הפלט של גלאי גל. צרף צינורות הפולימר שסתום היציאה של גלאי HPLC עם הולם מקשה אחת אצבע חזק. זה יהיה צינורות אוסף המדגם.
      הערה: עדר כרומופור חזק על הפפטיד Aβ מכתיב כי 214 ננומטר לשמש סגול העיקרי (UV) גל לאיסוף שיא.

איור 1: התקנה ניסיונית של המכשיר HPLC המשמש לטיהור של פפטידים בטא עמילואיד. (א) משאבת HPLC הרביעון המצויד מסלק גזי גלאי גל משתנים מוגדרים 214 ננומטר ו -280 ננומטר; (ב) HPLC עמודות המשמשות לטיהור של פפטידים בטאו עמילואיד, ממשמאל לימין, 25 x 300 מ"מ ² טור preparative, 7.5 x 300 מ"מ ² טור preparative למחצה ו -4.6 x 250 מ"מ ² טור אנליטי; (C) מזרק ידני עם 20 μL לולאת הזרקת נירוסטה המשמשת HPLC אנליטי; (ד) מזרק ידני עם 10 לולאת הזרקת חלד מיליליטר פלדה המשמשת לטיהור preparative preparative למחצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. לתכנת את התוכנה HPLC להפעיל את שיטת טיהור כפי שמוצג בטבלה 1. הזן את שיטת טיהור על ידי שינוי פרמטר הזמנים ממס (באפשרות שיטת מכשיר ההתקנה מובנה בתוך התוכנה HPLC). הפעל את משאבת HPLC על ידי לחיצה על הכפתור "על" על תוכנת HPLC.
   הערה: המשאבה תתחיל לספק יחס להתנעת חיץ חיץ B דרך ההכנהטור arative ואת מכשיר HPLC.
   1. השארת המערכת במשך 30 דקות כדי לאזן באופן מלא.

זמן / min	% של הצפה	% של ב B הצפת	ד קצב הזרימה / min מ"ל -1
0	80	20	6
45	75.5	24.5	6
45.01	80	20	6
52.01	80	20	6
52.02	73	27	6
85	73	27	6
92	5	95 ג	6

טבלה 1: לוח זמנים עבור טיהור של פפטידים Aβ42 ו Aβ40 שימוש בעמודה פולימר מ"מ 25 × 300. ^חיץ A - H ₂ O עם 20 מ"מ NH ₄ OH; ^ב 80% MeCN / 20% H ₂ O עם 20 מ"מ NH ₄ OH; רן ^צלזיוס למשך 15 דקות לשטוף את העמודה לפני הזריקה הבאה של מדגם; ^ד כדי להפעיל בקצב זרימה של 6 מ"ל / דקה על המכשור HPLC, מגבלת הלחץ צריך להיות מופחת עד 200 בר.

4. טיהור של מדגם הפפטיד Aβ
   הערה: פפטיד הגולמי הושג באמצעות סינתזת פפטיד מוצק שלב אוטומטית. ¹⁰
   1. ממיסים 3 מ"ג של הפפטיד Aβ גולמי 4 מ"ל של חיץ פירוק המדגם. Sonicate המדגם במשך 30-60 שניות בטמפרטורת החדר ואת בתדר של 40 kHz לסייע פירוק.
   2. להזריק את המדגם על הטור HPLC באמצעות מזרק פלסטיק 5 מ"ל מצויד 16-מדמחט נירוסטה. הפעל את שיטת טיהור כפי שמתואר-צעד משנה 1.3.
      הערה: המערכת מאפשרת הזרקה מדגמת להיעשות באמצעות מזרק ידני מצויד עם לולאת הזרקת נירוסטה 10 מיליליטר (1D איור). הפפטיד Aβ הרצוי יהיה elute בין 72 ו -74 דקות בתור שיא נפתר חדה (איור 2 ג).
   3. אסוף המדגם לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל. אשר את זהותו של שיא Aβ באמצעות ספקטרומטריית מסה הזרקה ישירה של eluent שנאספו. ¹¹ אחסן את eluent עד 12 שעות ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: אחסון של הפתרון לפרקי זמן ארוכים יותר מ -12 שעות לא מומלץ בשל פוטנציאל החמצון של הפפטיד.
   4. לבודד את הפפטיד מטוהרים על ידי פלאש הקפאת aliquot שנאספו / aliquots של הפפטיד Aβ בחנקן נוזלי Lyophilize. בצע lyophilization ידי ייבוש בהקפאה המדגם בטמפרטורה של C ° -60 וכן presבטוח של 20 mTorr לתקופה של 24 שעות.
   5. הפעל את פרוטוקול HPLC אנליטי כמפורט להלן כדי לקבוע את הטוהר של הפפטיד Aβ. פפטידים חנות בצורה lyophilized שלהם ב -20 מעלות צלזיוס למשך תקופה של עד 6 חודשים.

2. ניתוח HPLC אנליטי של חלבון Aβ מטוהרים

1. כן מאגרי HPLC כפי שמתואר בסעיף קטן 1.1. של הפרוטוקול הנ"ל.
2. הגדר את HPLC אנליטי לפי צעד 1.2.1 וכפי מתואר באיור 1 עם טור אנליטית 4.6 × 250 מ"מ (איור 1 ב ', כה בעמודה ימנית) ואת המזרק הידני עם 20 μL לולאת הזרקת נירוסטה (תרשים 1C) מצויד כלי.
3. לתכנת את תוכנת HPLC כדי להפעיל את השיטה האנליטית כפי שמוצג בטבלה 2 שלהלן הוראות דומות לאלו בשלב 1.3.

זמן /דקות	% של הצפה	% של ב B הצפת	זרימת דקות דרג / מיליליטר -1
0	95	5	1
30	50	50	1

טבלה 2: לוח זמנים לניתוח טוהר HPLC של הפפטיד Aβ. ^חיץ A - H ₂ O עם 20 מ"מ NH ₄ OH; ^ב 80% MeCN / 20% H ₂ O עם 20 מ"מ NH ₄ OH.

4. ניתוח טוהר הפפטיד Aβ
   1. הכן פתרון 1 מ"ג / מ"ל ​​של הפפטיד מטוהרים באמצעות פירוק של הפפטיד בפתרון חיץ המדגם.
      הערה: ניתן למצוא את מתכון החיץ בסעיף קטן 1.1. ריכוז החלבון נקבע על ידי מדידת ספיגת חלבון 280 ננומטר (א _280nm). ¹² מ ' מקדם הכחדה olar (ε) המשמש לקביעת ריכוז הוא ε = 1,490 dm ³ mol ^{-1 -1} ס"מ. ¹³
   2. להזריק 20 μL של 1 מ"ג / מ"ל ​​(222 מיקרומטר) פתרון על הטור HPLC ולהפעיל את השיטה האנליטית כי היה ההתקנה בשלב 2.3.
      הערה: הפתרון הנותר לא נעשה שימוש לצורך הניתוח אפשר להקפיא פלאש בחנקן נוזל lyophilized להתאושש הפפטיד Aβ. ניתן למצוא את פרטי Lyophilization בסעיף קטן 1.4.4. הפפטיד Aβ יהיה elute מהעמודה אנליטית בין 16 ו -18 דקות (איור 2 ד). השתמש בתוכנת ניתוח אינטגרציה מובנית המלווה את מכשיר HPLC כדי לקבוע את הטוהר של הפפטיד Aβ. טוהר נקבע על ידי שילוב כל פסגות הפרט על ספקטרום חישוב שטח אחוז פפטיד-שיא. בדרך כלל, טיהור של> 95% יש לוודא.

"איור 2" src = "/ files / ftp_upload / 55,482 / 55482fig2.jpg" />
איור 2: עקבות HPLC נציג של Aβ42. (א) מסורתית C ₄ טיהור סיליקה, תנאים: חיץ: H ₂ O עם 0.1% trifluoroacetic חומצה (TFA), מאגר B: MeCN (אצטוניטריל) עם 0.1% TFA, שיפוע: 20 עד 27% חיץ B למעלה מ -40 דקות לאחר מכן על ידי B 27% חיץ isocratic; (ב) טיהור preparative שימוש בעמודה פולימר ² 25 x 300 מ"מ, תנאים: הצפת: H ₂ O עם 20 מ"מ NH ₄ OH, B חיץ: 80% MeCN / 20% H ₂ O עם 20 מ"מ NH ₄ OH, שיפוע : 20 עד 27% חיץ B מעל 70 דקות ולאחריה B חיץ isocratic 27%; (C) אופטימלי טיהור preparative שימוש בעמודת פולימר 25 x 300 מ"מ ^2, תנאים מתוארים בטבלת 1 ממוקמת בסעיף קטן 1.3 של טקסט תיאור פרוטוקול; (ד) HPLC אנליטי שימוש בעמודת פולימר 4.6 x 250 מ"מ ^2, המנצחitions: הצפת: H ₂ O עם 20 מ"מ NH ₄ OH, B חיץ: 80% MeCN / 20% H ₂ O עם 20 מ"מ NH ₄ OH, שיפוע-5 עד 50% חיץ B למעלה מ -30 דקות. עבור חלקים A, B ו- C השיא המתאים Aβ42 מסומן בכוכבית. אוסף של שיא Aβ42 מסומן בחלק ג חושפת טוהרת> 95% כפי שמוצגת חלק ספקטרומטריית ד Mass שמש כדי לקבוע את זהותו של שיא Aβ42. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוצאות

הטיהור של הפפטיד Aβ42 באמצעות שילוב של השלב הנייח PLRP-S לבין תוצאות שלב ניידות גבוהה pH ביצירת פסגה חדה, נפתרה לייצור הפפטיד Aβ בכל זמן שמירה בין 72 ו -74 דקות (איור 2 ג). אישור של זהות שיא נעשה באמצעות ספקטרומטריית מסה הזרקה ישירה של eluent שנאספו. Eluent נ...

Discussion

טיהור HPLC של הפפטיד Aβ תלויה מאוד על הבחירה של שני השלב הנייח המועסקים בתחום הטיהור בשלב הנייד נבחר כדי elute הפפטיד. הנקודה איזואלקטרית הנמוכה של הפפטיד ואת הנטייה גבוהה עבור צבירה לדקלם תנאי chromatographic מסורתיים להפרדת חלבונים הידרופובי (C4 או בשלב נייח C8 מצמיד עם eluent הניי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump	Agilent	G7111B	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector	Agilent	G7114A	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop	Agilent	0101-1232	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop	Agilent	G1328C	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket	Agilent	1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical)	Agilent	PL1512-5501	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide			Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution)	Fisher Scientific	A669-500
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea	Sigma-Aldrich	Z227250
Normject 5 cc sterile syringe	Fisher Scientific	1481729
16 Gauge SS Needle	Rheodyne	3725-086