JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.

Abstract

החשש העיקרי של השתלת היא להשיג סובלנות ספציפי באמצעות אינדוקציה של תאים תקינה. ההבנה של מנגנונים סובלנות דורש מודלים אמינים. כאן, אנו מתארים מודלים של סובלנות להשתלת לב בראט, המושרה המצור של אותות costimulation או על ידי קולטנים upregulation של מולקולות immunoregulatory דרך העברה גנטית. כל אחד המודלים האלה מותר ויוו דור של תאים רגולטוריים כמו בתאי T רגולטוריים (Tregs), תאים B רגולטוריות (Bregs) או התאים מיאלואידית רגולטוריות (RegMCs). כתב יד זה, אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים השתמשו כדי לזהות ולהגדיר במבחנה ויוו תא רגולטורי פעילות כדי לקבוע אחריותם סובלנות אינדוקציה ותחזוקה. ראשית, במבחנה מדכאים assay מותר זיהוי מהיר של תאים עם קיבולת מדכאים על תגובות חיסוניות אפקטור באופן תלוי מינון, יכול לשמש עבור ניתוח נוסף כגון ציטוקין מדידה או cytotoxicity. שנית, העברת המאמצת של תאים מן הנמען המטופלים סובלנית לנמען המושתל לקרינה לאחרונה, הדגיש את המאפיינים tolerogenic של תאים אלה שליטה תגובות חיסוניות שתל ביים ו/או המרה (תאים תקינה חדשה כינה סובלנות זיהומיות). שיטות אלה אינם רק תאים עם סמנים פנוטיפי ידוע, ניתן להרחיב את כל אוכלוסיית תאים. יתר על כן, תורם ביים allospecificity של תאים תקינה (מטרה חשובה בתחום) יכול להיות מוערך על ידי באמצעות צד שלישי תורם תאי או להשתיל או בתוך חוץ גופית או ויוו. לבסוף, כדי לקבוע את הקיבולת tolerogenic ספציפיים של תאים רגולטוריים אלה, אנו מספקים פרוטוקולים כדי להעריך את התגובות ההורמונאלית נוגדן אנטי-תורם והיכולת של המטופל לפתח תגובות ההורמונאלית נגד אנטיגנים מוכרים חדשים או לשעבר. הדגמים של סובלנות המתוארת ניתן לאפיין עוד תאים רגולטוריים, לזהות סמנים חדשים, ומולקולות immunoregulatory, והם וישימה השתלת מודלים או מחלות אוטואימוניות מכרסם או אנושיים אחרים.

Introduction

להשתלת לב בעכברוש הוא מודל השתלת איבר אמין כדי להעריך טיפולים אינדוקציה סובלנות, לפענח את המנגנונים של סובלנות אינדוקציה ותחזוקה, ויש לו פוטנציאל לגרום תאים תקינה מבחינה פונקציונלית המוסמכת ודומיננטית. הפרוטוקולים שלהלן מתארים באופן מלא אי-התאמה הטרוטופי לב השתלה של עכברוש התורם 1W לואיס (LEW.1W, RT1u) לתוך לואיס 1A הנמען חולדה (LEW.1A, RT1). שילוב זה שתל, דחייה חריפה מתרחשת במהירות רבה (עוד 7 ימים), יכול להיות מוערך בקלות על ידי שתל להכות מדידה באמצעות מישוש הבטן. כאן אנו מציעים שלושה פרוטוקולים לזירוז עמידות בפני להשתלת לב בעכברוש. דגמים אלה, סובלנות המושרה ו/או המתוחזקים על-ידי סוגי תאים רגולטוריים שונים. קודם כל, החסימה של CD40 CD40L אינטראקציות עם אדנו קידוד CD40Ig (AdCD40Ig) המושרה הדור של CD8+ Tregs מסוגל גרימת רגישות כאשר adoptively הועבר משני הנמענים המושתל1. יתר על כן, דלדול של CD8+ תאים (עם נוגדנים anti-CD8α) נמענים שטופלו AdCD40Ig שנוצר Bregs ו- RegMCs2. ניתוח עמוק של CD8+ Tregs מאפיינים מודגש התפקיד של מספר מולקולות immunoregulatory כהגדרתו אינטרלוקין-34 (IL-34) ו- Fibroleukin-2 (FGL 2)3,4,5,6 . ואילו ביטוי של IL-34 (עם וקטור AAV) הנגרמת Tregs דרך דור של RegMCs, ביטוי של FGL-2 המושרה Bregs, שבבסיס הרשת מורכב של תאים תקינה.

כי דחייה כרונית מתפתח לאט, הוא ארוך טווח, ניתוח מעמיק נדרש כדי להבחין בין סובלנות נגד דחייה כרונית. שתל בדרך כלל שקובעת חדירה לתא, פיברוזיס, עיבוי של כלי הדם קיר וה משלים C4d תצהיר מאת פראפין7. בעוד שיטות היסטולוגיה דרוש להקריב חיה או להשתיל ביופסיה, כאן אנו מתארים שיטה פשוטה כדי להעריך את תכונות שונות של להשתלת נסבל: הופעתה והתפקוד של תאים רגולטוריים, את תגובות נוגדנים ספציפיים נגד תורם דם דוגמה מאת cytometry זרימה (כאן, השתמשנו תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS)).

תחזוקה של סובלנות להשתלת לאחר מעצרו של הטיפול משויכת בדרך כלל תנאי הגיוס של תאים רגולטוריים8. בעשרות השנים האחרונות, מחקרים התמקדו CD4+Tregs פה אחד מאופיין אותם על ידי הסמנים מפתח Foxp3+CD25גבוהה, CD127–9,10,11. באופן דומה, סמני מספר יוחסו CD8+ Tregs, כמו CD122+, CD28-, CD45RCנמוך, PD1+, הליוס+1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. שנים, ביטוי של GITR, CTLA4 ו ציטוקינים (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) היו קשורים בנוסף Treg פרופיל3,4,6,13, 18,19,20,21. עם זאת, מתעוררים תא רגולטורי אוכלוסיות, כגון Bregs, RegMCs או NKTregs, חסרים סמני ספציפי רלוונטי. אכן, Bregs מדווחים בעיקר בתור לא בוגר CD24 תאים+ , עם ביטוי CD27 רב-משמעי, ולעיתים הייצור של IL-10, TGFβ או granzyme B22,23,24. המורכבות של שושלת התאים מיאלואידית דורשת שילוב של מספר סמנים להגדרת הפרופיל שלהם תקינה או proinflammatory כגון CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a או CD16325,26. לבסוף, כמה סימונים דווחו לזהות את NKTregs כמו CD11b+, CD27+, TGFβ+, אך מחקרים נוספים נדרשים עוד יותר phenotypically לתאר אותם27,28,29 ,30,31,32. לפיכך, עדויות של המדכא פעילות נדרשים להכשיר עוד תיאור פנוטיפי לצורך זיהוי סמנים ביולוגיים חדש, מגשרים חדשים immunoregulatory, וכדי להרחיב את ההיקף לטיפולים תאים חדשים.

אנו מציעים שתי שיטות משלימות כדי להעריך את הפעילות המדכא של תאים. ראשית, השיטה במבחנה מורכב culturing מדכא תאים עם תוויות אפקטור T תאים מגורה על ידי התורם allogeneic אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים)-יחס שונה במשך 6 ימים ולאחר ניתוח אפקטור את תא T התפשטות זה משקף מכוון תורם לדיכוי מערכת החיסון. תאים חולדות שטופלו ניתן להשוות ישירות לתאים של תמים עכברים וחולדות שאינם מטופלים המושתל מדכאים פעילות (או כל האוכלוסייה תא רגולטורי אחרים), בטווח של יחסי משתיק קול: אפקטור. יתר על כן, שיטה זו אינה דורשת כל השתלת, התוצאות מתקבלים שישה ימים. שנית, שיטת ויוו כוללת העברת תאים רגולטוריים המיועד חולדה שטופלו לנמען המושתל לקרינה לאחרונה. בעוד B תאים, התאים מיאלואידית או T תאים מחלון תמימים שאינם מטופלים עכברים לא מצליחות בדרך כלל כדי לעכב דחייה חריפה וכדי להאריך את הישרדות השתל בעת העברה המאמצת, תאים עם potentiated מדכאים פעילות של מטופלים נמענים יש תכונות אלה 1,2,3,4,33. Lymphopenia המושרה על ידי הקרנה של הנמען מומלץ לאפשר הועבר adoptively תאים כדי לא להיות מושפע דם הומאוסטזיס וכדי לשלוט בקלות רבה יותר את תגובות מערכת החיסון נגד התורם. עבור שתי השיטות, ניצול במבחנה של allogeneic צד ג' נגמ שים או ויוו העברה המאמצת של מדכא תאים לתוך נמענים הושתל בלב חיצוני לאפשר ניתוח של התורם אנטי יחודיות. בעוד השיטה ויוו דורש מספר ניכר של תאים, גרוע ייצג תא subpopulations יכול להיות בקלות רבה יותר שקובעת מדכאים פעילות במבחנה33.

ניתן גם למדוד התגובות ההורמונאלית כדי להעריך את המצב של סובלנות ואת השליטה של נוגדן מכוונת התגובות התורם אנטיגנים. אכן, סובלנות יכול להיות מאופיין על ידי העדר תגובה הומוראלית כלפי התורם אבל שימור היכולת לנמענים לפתח תגובה הומוראלית אנטיגנים חדשים ושימור הזיכרון תגובות. ראשית, עקרון alloantibody זיהוי מבוסס על זיהוי של תאי התורם באמצעות נוגדנים הנמען בעקבות דגירה של התורם סוג התא עם סרום מן הנמען המושתל. שנית, ההורמונאלית תגובות מכוונת ל אקסוגניים אנטיגנים ניתן גירוי הבאים המוערך של נמענים סובלנית לטווח ארוך עם חור המנעול מגנטיים המוציאנין (KLH) emulsified עם מלא אדג'וונט של פרוינד. הנוכחות של נוגדנים ספציפיים IgG ו- IgM נגד אנטיגנים ניתן להבחין 4 ו- 13 ימים, בהתאמה, בעקבות חיסון, אנזים מקושרים ImmunoSorbent Assay (אליסה)34. שלישית, שימור זיכרון המערכת החיסונית תגובות יכול להיות מוערך על ידי הזרקה של תאי דם אדומים xenogeneic (RBCs)-ימי-7 ו +3 השתלת RBCs מכתים עם הנמען סרום שנאספו ימים +8, +17 בעקבות השתלת. כל השיטות האלה מאפשרים זיהוי בנוגדנים יחוברו באמצעות נוגדנים ספציפיים משני, ולא רכישה מהירה של תוצאות פחות מ 1.5 h על-ידי FACS מכתים או כמה שעות מאת אליסה.

בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה מיועדים אפיון של השתלת מודלים, והוא יכול להיות, במידה מסוימת, חלה על מודלים מחלות אוטואימוניות. העקרונות של השיטה ניתן משורבב כדי כל המינים.

Protocol

הערה: כל הפרוטוקולים כאן אושרו על ידי ועדת אתית, יש לבצעו בצורה סטרילית.

1. דור של סובלנות במודל של להשתלת לב בעכברוש

  1. LEW.1W לשגרת להשתלת LEW.1A
    1. עזים ומתנגד זכר התורם LEW.1W עכברוש באמצעות אינהלציה איזופלוריין-O2 , בתוספת 1% N2O לאחר 5 דק במקום החיה בתוך חמצן הגבי, ולחטא את הבטן עם betadine לבצע ניקור (כלומר, חתך לתוך פלאורלי חלל החזה).
      1. מהדק את נחות והסופריור וריד נבוב, קשירה אותם, לחתוך אותם. ואז חתך את עורק הריאה, אבי העורקים, להציל את השתל תוך קר 0.9% NaCl.
    2. עזים ומתנגד 250 גרם זכר LEW.1A הנמען חולדה (של 8-12 שבועות) באמצעות אינהלציה איזופלוריין-O2 , בתוספת 1% N2O לאחר 5 דק למקם את החיה חמצן הגבי, לחטא את הבטן עם betadine לבצע פתיחה של הבטן xyphopubic (כלומר, חתך גדול מן הסרעפת כדי symphysis ערווה).
      1. להחצין את המעיים, מהדק את כלי הדם בבטן, לבצע השקה termino-לרוחב (קרי, חיבור בין סוף ערוץ אחד על הקיר של האחר) בין שתל אב העורקים העורק הראשי ובין את הריאות עורק בטן הנבוב לבין הסר מלחציים.
    3. תפר את המטוס שרירי ועור, ולחטא עם betadine.
    4. להזריק, מתאדון, נאלבופין (כאבים) 6 מ"ג/ק"ג subcutaneously (ש), oxytetracycline (אנטיביוטיקה) intramuscularly (i.m.), ומניחים את החיה תחת מנורת חימום עד החיה מתעורר. להזריק הבופרנורפין (אופיואידים) (50 µg/kg) i.m. ו- meloxicam (בתרופות אנטי-דלקתיות nonsteroidal) (0.3 מ"ג/ק"ג) ש ביום של השתלת, יום אחד לאחר.
  2. אינדוקציה של סובלנות מאת המצור על אינטראקציות costimulatory
    1. בצע את שלבים 1.1.1. ל 1.1.2.
    2. באזור A2 מסווג של המתקן בעלי חיים, למהול 2 x 1010 חלקיקים זיהומית של AdCD40Ig (אדנו קידוד CD40Ig, מולקולה chimeric החוסמת האינטראקציות CD40-CD40L) בתמיסת רינגר לקטט להגיע נפח סופי של 150 µL להזריק 3 נקודות (3 x 50 µL) של קיר חדרית השיא של השתל.
    3. בצע את שלבים 1.1.3 ל 1.1.4.
      הערה: טיפול AdCD40Ig יכול להיות משויך CD8α-נגד, נגד-ICOS או אנטי-CD28 נוגדן זריקות2,35,36.
  3. אינדוקציה של סובלנות על ידי ביטוי של חלבון רקומביננטי
    1. למהול 1 x 1012 אפידמיולוגיה של עכברוש AAV IL34-רקומביננטי של תמיסת רינגר לקטט להגיע נפח סופי של 100 µL. עזים ומתנגד חולדה LEW.1A 150 גר' עם איזופלוריין-O2 שאיפת ולהזריק לווריד (עירוי) את תקחי את הפין.
    2. חודש אחד לאחר ההזרקה AAV-IL34, לבצע השתלה LEW.1W על הנמען LEW.1A לפי פרוטוקול 1.1.

2. הערכת במבחנה של פעילות מדכא תאים ידי לימפוציטים מעורבת תגובות (mlrs בחיל התותחנים)

הערה: יש להשוות מדכאים פעילות של תאים שטופלו חולדות סובלנית עם האוכלוסייה המקבילה syngeneic נמענים המושתל או חולדות תמים.

  1. בידוד של נגמ שים allogeneic: plasmacytoid תאים דנדריטים (שיתפקדו)
    1. עזים ומתנגד של עכבר זכר של תורם תמים LEW.1W באמצעות אינהלציה איזופלוריין-O2 , בתוספת 1% N2O לאחר 5 דק למקם את החיה חמצן הגבי, לחטא את הבטן עם betadine לבצע שתלך. להסיר את הטחול על ידי transecting בכלי הדם, להציל את הטחול קר 1 X באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), תפר את החיה.
    2. להעביר את הטחול בקערה, להסיר 1 X PBS ו perfuse 5 מ של 0.2% collagenase ד כדי לשפר את אנזים העיכול, הטחול לחתיכות קטנות, דגירה 15 דקות ב 37 º C.
    3. להוסיף 500 µL של 0.1 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), להעביר את החלקים הטחול לתוך מסננת ולרסק את הטחול עם הבוכנה של מזרק מביצועם התאים. העברת לתוך צינור ולשטוף את התאים עם 15 מ"ל של 1 X PBS. צנטריפוגה 10 דקות-430 x ג למחוק את תגובת שיקוע.
    4. כדי לחסל את RBCs טסיות דם, resuspend בגדר splenocyte 10 מ ל תמיסת היפוטוניק, דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לשטוף עם 1 X PBS, צנטריפוגה 10 דקות ב- g 190 x. להשליך תגובת שיקוע.
    5. הסר את סיבי קולגן על-ידי סינון על מסנן רקמה 100 מיקרומטר. לספור את התאים כדי להתאים את ריכוז תא 5 x 107 תאים למ"ל בנסיוב 1 X PBS/2% עגל עוברית (FCS) / 0.5 מ מ EDTA.
      הערה: המספר של splenocytes צריך להיות בין 4 x 108 ו- 7 x 108 תאים.
    6. להעשיר עבור תאים עניין לפי בחירה שלילי לפני מיון תא. דגירה 15 דקות ב 4 ° C עם 2 µg/mL מטוהרים נוגדנים ספציפיים בתאי T (שיבוט anti-TCRαβ, שיבוט R7/3 ו- anti-TCRγδ, V65), תאים B (anti-CD45RA, OX33 שיבוט) של תאי NK (אנטי-CD161, 3.2.3 כפיל), לשטוף עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA, צנטריפוגה 10 דקות ב 430 x g . למחוק את תגובת שיקוע.
    7. לשטוף עם beads מגנטי 3 פעמים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA. השתמש 3.5 µL חרוזים/106 splenocytes, לרחוץ על-ידי הוספת 30 מ ל 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA, מקום 1 דקות על המגנט, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על פעמיים. Resuspend את החרוזים 10 כרכים של 1 מ מ X PBS/2% FCS/0.5 EDTA (לדוגמה, חרוזים µL 35 הוא מדולל ב 350 µL 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA).
    8. להסיר תאים לא רצויים על-ידי ערבוב של splenocytes עם החרוזים מגנטי 10 דקות ב 4 ° C תחת עצבנות, למקם את הצינורית על המגנט עבור 1 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. חזור על פעמיים. לספור את התאים ולהתאים את הריכוז תא 5 x 107 תאים/מ ב- 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA.
      הערה: המספר splenocytes מועשר צריך לנוע בין 5 x 107 ו- 9 x 107.
    9. כתם התאים באמצעות נוגדנים שכותרתו לצורך מיון נוסף של בקר קבוצת מחשבים ראשי: אי כלילה שנותרו תאי T (anti-TCRαβ, שיבוט R7/3) או בתאי B (anti-CD45RA, OX33 שיבוט) ומיין CD4+ (anti-CD4, שיבוט OX35) CD45R+ תאים (anti-CD45R, His24 גומי). חרוזים תווית עם כל Ab להקים מטריצה פיצוי על FACS. דגירה 15 דקות ב 4 ° C, לשטוף עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA.
    10. Resuspend התאים-ריכוז של 5 x 107 תאים/mL, מסנן מסנן 60 רקמות מיקרומטר, ויסמנו תאים מתים על-ידי הוספת דאפי-ריכוז סופי של 0.1 µg/mL. מיין תאים עם סדרן התא זרבובית מיקרומטר 70, לפי gating על דאפי–TCR–CD45RA–CD4+CD45R+ כפי שמוצג באיור1.
  2. בידוד של המשיב אפקטור T תאים (CD4 + CD25 תאי T – )
    1. הקציר הטחול מעכברוש LEW.1A שאינם מטופלים תמים שאינו הושתל ולשמור אותו קר 1 X PBS.
    2. להעביר את הטחול בתוך מסננת מניחים בקערה ולהוסיף 10 מ"ל של 1 X PBS. לרסק את הטחול עם הבוכנה של מזרק מביצועם התאים. העבר את התאים לתוך צינור 50 מ ל, לשטוף עם 1 X PBS, צנטריפוגה 10 דקות ב- g 430 x. להשליך תגובת שיקוע.
    3. כדי לחסל את RBCs טסיות דם, resuspend בגדר splenocyte 10 מ ל תמיסת היפוטוניק במשך 5 דקות ב RT, ואז תשטוף 1 X PBS, צנטריפוגה-g 190 x. 10 דקות לבטל את תגובת שיקוע.
    4. הסר את סיבי הקולגן על-ידי סינון על מסנן רקמה 100 מיקרומטר. לספור את התאים כדי להתאים את הריכוז תא 5 x 107 תאים/מ ב- 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA.
      הערה: המספר של splenocytes צריך להיות בין 3 x 108 ו- 5 x 108 תאים.
    5. להעשיר את התאים עניין לפני מיון. דגירה 15 דקות ב 4 ° C עם 2 µg/mL מטוהרים נוגדנים ספציפיים תאי CD8 (anti-CD8α, OX8 גומי), תאים B (anti-CD45RA, OX33 גומי), תאי NK (אנטי-CD161, 3.2.3 כפיל), התאים מיאלואידית (אנטי-CD11b/c, OX42 שיבוט), גמא דלתא תאי (anti-TCRγδ, V65 גומי). לאחר מכן לשטוף עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA וזורקים צנטריפוגה 10 דקות-430 x ג את תגובת שיקוע.
      הערה: כדי למיין CD8 טבעי+ Tregs מן תמים חולדות באותו זמן כמו CD4+ אפקטור T תאים, אל תוסיף אנטי-CD8α Ab במהלך דלדול.
    6. לשטוף את החרוזים מגנטי 3 פעמים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA כפי שמתואר בשלב 2.1.7.
    7. להסיר תאים לא רצויים על-ידי ערבוב splenocytes עם החרוזים מגנטי 10 דקות ב 4 ° C תחת עצבנות, ולאחר מכן למקם את הצינורית על המגנט עבור 1 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. חזור על פעמיים. לספור את התאים ולהתאים את הריכוז תא 5 x 107 תאים/מ ב- 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA.
      הערה: המספר splenocytes צריך לנוע בין 5 x 107 ו- 8 x 107 תאים.
    8. הוסף תווית נוגדנים לסוג CD4+CD25 תאי T– : אנטי-TCRαβ (שיבוט R7/3), אנטי-CD4 (שיבוט OX35), אנטי-CD25 (OX39 שיבוט) דגירה 15 דקות ב 4 º C. למיון בו זמנית CD8 +CD45RCנמוכה Tregs, להוסיף אנטי-CD45RC Ab (שיבוט OX22). תווית חרוזים עם כל Ab להגדיר מטריצה פיצוי עבור עיבוד נוסף על cytometry זרימה. לשטוף את התאים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA וזורקים את תגובת שיקוע.
    9. Resuspend לתאים 5 x 107 תאים/mL, מסנן מסנן 60 רקמות מיקרומטר, ויסמנו תאים מתים על-ידי הוספת דאפי-ריכוז סופי של 0.1 µg/mL. למיין את התאים עם סדרן התא זרבובית מיקרומטר 70 gating-TCR דאפי –+CD4+CD25– תאים כתאי למשיב (ואם צריך TCR דאפי –+CD4–CD45RCנמוך כמו CD8+ Tregs מדכא תאים) כמוצג באיור2.
  3. בידוד תאי מדכאים
    הערה: לחלק את הטחול ב- aliquots שני: מיון אחד על B תאים, התאים מיאלואידית, ואת תאי NK, והשני -CD4+ ו CD8 + CD45RCנמוך T תאים, כדי להעריך את תפקידם מדכאים.
    הערה: עבור העברה לתא המאמצת, שמור splenocytes8 עונה 1 פרק 10 כדי לשמש שליטה חיובית של סובלנות בהעברה המאמצת, במידת הצורך.
    1. מיון של B תאים, התאים מיאלואידית, ותאי NK
      1. פעלתי לפי הנהלים 2.1.1 כדי 2.1.5
      2. דגירה 15 דקות ב 4 ° C עם 2 µg/mL תא T ספציפי ללא תווית נוגדנים (anti-TCRαβ, שיבוט R7/3 ו- anti-TCRγδ, V65 שיבוט), תשטוף עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA, צנטריפוגה 10 דקות ב- g 430 x. להשליך תגובת שיקוע.
      3. לשטוף עם beads מגנטי 3 פעמים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA כפי שמתואר בשלב 2.1.7.
      4. מערבבים את splenocytes עם החרוזים מגנטי כדי להסיר תאים לא רצויים, תקופת דגירה של 10 דקות ב 4 ° C תחת עצבנות, ואז למקם את הצינורית על המגנט עבור 1 דקות להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. חזור על פעמיים. לספור את התאים ולהתאים את הריכוז תא 5 x 107 תאים/מ ב- 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA.
      5. להוסיף splenocytes כדי למיין תאים עם חשד מדכאים פעילות כגון התאים מיאלואידית (אנטי-CD11b/c, OX42 גומי), תאים B (anti-CD45RA, OX33 שיבוט) או תאי NK שכותרתו נוגדנים (anti-CD161, שיבוט 3.2.3). תווית את החרוזים עם כל Ab להקים מטריצה פיצוי על FACS. דגירה 15 דקות ב 4 ° C, לשטוף עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA.
      6. Resuspend התאים-ריכוז של 5 x 107 תאים/mL, מסנן מסנן 60 רקמות מיקרומטר, ויסמנו תאים מתים על-ידי הוספת דאפי-ריכוז סופי של 0.1 µg/mL. למיין את התאים עם סדרן התא זרבובית מיקרומטר 70 gating על דאפי–CD11b/c+ עבור התאים מיאלואידית, CD45RA+ בתאי B, CD161+ עבור תאי NK כמוצג באיור3.
    2. מיון של CD4 + ו CD8 + CD45RC נמוך T תאים
      1. פעלתי לפי הנהלים 2.2.1 ל 2.2.4
      2. לבחירה שלילי על עמודה מגנטי, דגירה התאים 15 דקות ב 4 ° C עם 2 µg/mL מטוהרים נוגדנים ספציפיים לתאי B (anti-CD45RA, OX33 גומי), תאי NK (אנטי-CD161, 3.2.3 כפיל), התאים מיאלואידית (אנטי-CD11b/c, OX42 שיבוט), גמא דלתא T תאים ( anti-TCRγδ, V65 גומי), לשטוף אותם עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA, צנטריפוגה 10 דקות ב- g 430 x. להשליך תגובת שיקוע.
      3. לשטוף את החרוזים מגנטי 3 פעמים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA כפי שמתואר בשלב 2.1.7.
      4. להסיר תאים לא רצויים על ידי ערבוב של splenocytes עם החרוזים מגנטי 10 דקות ב 4 ° C תחת עצבנות, ולאחר מכן למקם את הצינורית על המגנט עבור 1 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. חזור על פעמיים. לספור את התאים ולהתאים את הריכוז תא 5 x 107 תאים/מ ב- 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA.
      5. הוספת נוגדנים שכותרתו לתאים כדי למיין Tregs: אנטי-TCRαβ (שיבוט R7/3), אנטי-CD4 (שיבוט OX35), אנטי-CD45RC (OX22 שיבוט). תווית את החרוזים עם כל Ab להקים מטריצה פיצוי על FACS. דגירה 15 דקות ב 4 ° C, לשטוף עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA.
      6. Resuspend התאים-ריכוז של 5 x 107 תאים/mL, מסנן על טישו מיקרומטר 60, ויסמנו תאים מתים על-ידי הוספת דאפי-ריכוז סופי של 0.1 µg/mL. למיין את התאים עם סדרן התא זרבובית מיקרומטר 70 gating על דאפי–TCR+CD4 +CD45RCנמוך כמו CD4+Tregs, דאפי–TCR+CD4–CD45RC נמוך כמו CD8+Tregs ( איור 4).
        הערה: Ab אנטי-CD8α (OX8 שיבוט) יכול לשמש במקום Ab אנטי-CD4 אם תאי T הם הפלתה של CD4+-T תאים על-ידי תיוג אנטי-TCR. עודף של CD4+Tregs מיון לקראת מות תאים בשל תיוג תא התפשטות צבע (שיקגו).
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) תיוג של המשיב תאים כדי למדוד את התפשטות
    1. לאחר התא למשיב מיון, לשטוף פעמיים את התאים עם 1 X PBS.
    2. Resuspend התאים-ריכוז של עונה 1 פרק 107 תאים למ"ל ב- 1 X PBS, דגירה עם 0.5 מיקרומטר CFSE במשך 5 דקות ב RT בחושך. לעצור את התגובה על-ידי הוספת FCS-1.5 X האחסון, צנטריפוגה 10 דקות ב g 430 x-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
    3. לשטוף פעמיים את התאים בינונית מלאה, ולספור את התאים.
      הערה: מצפה 30% מוות תאים בשלב זה.
  5. רופאות תיוג של CD4 + Tregs עבור assay מדכאים על CD4 + אפקטור תאים
    הערה: שלב זה נדרש כדי להפלות CD4 CFSE–+Tregs מן CFSE– מתרבים למשיב CD4+תאי T-יום 6 של coculture על ידי gating בתאי רופאות– .
    1. לאחר CD4+ Tregs תא מיון, לשטוף פעמיים את התאים עם 1 X PBS.
    2. Resuspend התאים-ריכוז של עונה 1 פרק 107 תאים למ"ל ב- 1 X PBS, דגירה עם 10 מיקרומטר של רופאות V450 כעשרים דקות ב RT בחושך.
    3. לשטוף פעמיים את התאים בינונית מלאה, ולספור את התאים.
      הערה: מצפה 30% מוות תאים בשלב זה.
  6. עצה coculture
    1. השתמש תרבות בינונית הכוללת: בינוני RPMI 1640 בתוספת בטא-mercaptoethanol (5 x 10-5 מ'), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (0.1 mg/mL), נתרן פירובט (1 מ מ), גלוטמין (2 מ מ), מאגר HEPES (1 מ מ), חומצות אמינו שאינן הכרחיות (1 X), FCS ( 10%).
    2. התרבות התאים ב- 96-ובכן U למטה צלחות.
    3. הוסף תאים לפי הסדר הבא: מדכא תאים, התאים למשיב ותאים allogeneic.
    4. לשמור את המספר של המשיב T תאים, נגמ שים allogeneic קבוע ולבדוק מספר מגוון של Tregs. לדוגמה, יחס 4:4:1, 5 x 104 תאים מדכאים, המשיב 5 x 104 תאים ו- 1.25 x 104 תאים allogeneic יחס 2:4:1, 2.5 x 104 תאים מדכאים, המשיב 5 x 104 תאים ו 1.25 x 104 allogeneic תאים.
    5. לשמור על היחס של 5 x 104 תאים למשיב עבור בינוני µL 200/טוב....
    6. עבור פקדים, כוללים כמה בארות עם המשיב T תאים ללא allogeneic נגמ שים (בקרה שלילית) ותאים למשיב T עם נגמ שים allogeneic ללא תאים תקינה (בקרה חיובית) עבור CFSE gating ביום 6 (ראה שלב 2.7.6.).
  7. FACS מכתים וניתוח לאחר 6 ימים של coculture
    הערה: ההתפשטות של תאים אפקטור יכול להידרש במספר נקודות זמן. שימו לב כי התפשטות מעריכית: כמו עליות חלוקת התא, יכול להיות שנצפו הבדלים נוספים בין התנאים מדכאים שליטה שלילי.
    1. העבר את התאים האו 96-ובכן לוחות למבקרים 96-ובכן למטה צלחות, צנטריפוגה 1 דקות ב- g x 1,200 ב 4 º C.
    2. שמור את תגובת שיקוע בצלחת החדשה ב-20 ° C למדידת רמות ציטוקינים, במידת הצורך.
    3. לשטוף את התאים עם 200 µL 1 מ"מ X PBS/2% FCS/0.5 EDTA לכל טוב, צנטריפוגה 1 דקות ב- g 1,200 x ב 4 º C.
    4. הוספת נוגדנים לתאי לשער נוסף על המשיב T תאים: אנטי-TCRab (שיבוט R7/3) ו- anti-CD4 (שיבוט OX35). דגירה 15 דקות ב 4 ° C, לשטוף פעמיים עם 200 µL 1 מ"מ X PBS/2% FCS/0.5 EDTA לכל טוב. למחוק את תגובת שיקוע.
    5. להוסיף 100 µL של דאפי מדולל ב 0.1 µg/mL ב- 1 X PBS ולקרוא את הצלחת עם מנתח FACS.
    6. לנתח את הפרופיל CFSE ידי gating על דאפי שלילי (תאים חיים) רופאות שלילי (הלא-CD4+Tregs) TCR+CD4+ תאים. למגיב unstimulated תאים יש בהירות מירבית CFSE כפי שמוצג באיור 5 היסטוגרמה השמאלי התחתון. בנוכחות allogeneic נגמ שים, התאים למשיב יש התפשטות מקסימלי CFSE מינימלי בהירות (למטה, באמצע). בנוכחות allogeneic נגמ שים, תאים רגולטוריים, התאים אפקטור יש התפשטות בינוני ובהירות CFSE (למטה, מימין).

3. הערכת in Vivo של הפעילות מדכא תאים על ידי העברה לתא המאמצת בלב הושתל נמען

הערה: הקרנה נחוץ כדי לחסל את התאים מארח וחסדך התורם תא engraftment והתפשטות.

  1. להאיר את הנמענים שתל מוקדם ביום שלפני השתל כדי precondition את הנמען. עזים ומתנגד חולדות עם i.m. הזרקה של חריגות השירותים הווטרינריים (8 מ ג/ק ג)-קטמין (80 מ ג/ק ג), להאיר אותם במינון של Gy 4.5 עם קרני X.
  2. פעלתי לפי הנהלים 2.3 כדי לבודד תאים עניין
    הערה: שמור splenocytes8 עונה 1 פרק 10 כדי לשמש פקד חיובית של סובלנות בהעברה המאמצת, במידת הצורך.
  3. 12 שעות לאחר הקרנה (יום לפני השתל, בערב), עזים ומתנגד החולדות באמצעות אינהלציה של 4% איזופלוריין-O2 וטוענת התאים (5.0 x 107 T תאים, 3.0 x 107 B תאים, 3.0 x 107 התאים מיאלואידית או 1.50 x 108 splenocytes של הפקד חיובית של סובלנות בהעברה המאמצת) העירוי בווריד הפין.
    הערה: מספר התאים הנדרש לסובלנות על-ידי העברת המאמצת תלוי הפעילות המדכא של התאים.
  4. למחרת, לעקוב אחר הפרוטוקול 1.1 לבצע את להשתלת בצע את האבולוציה השתל על ידי מישוש דרך הבטן.

4. זיהוי נוגדנים ספציפיים התורם

הערה: אג תגובות מופנה כלפי התורם שתל נמדדות המקננת התאים מהתורם עם סרום של הנמען. להחסיר את הרקע המושרה על ידי צביעת ישירה של תאים LEW.1W B על ידי המקננת התאים עם סרום LEW.1W syngeneic.

  1. הקציר דם מן העכברים, צנטריפוגה 15 דקות ב g 1,200 x ב 4 º C. שמור את הנסיוב. סרום יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C או שימוש באופן מיידי. בטל את משלים סרה על ידי המקננת למשך 30 דקות ב- 56 ° C.
  2. הקציר הטחול מעכברוש LEW.1W התורם ולשמור אותו קר 1 X PBS. בצע את השלבים 2.2.1. כדי 2.2.4. להוסיף 2 x 105 תאים/טוב בצלחת התחתונה V 96-ובכן. צנטריפוגה 1 דקות ב- g x 1,200 ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
  3. לדלל את שרה באופן סדרתי מ- 1/10 עד 1/270 ב 1 X PBS (4 דילולים דוגמה). דגירה את התאים עבור h 1 ב 4 ° C עם 25 µL של סרום מדולל/טוב. צופים את המספר של IgG תורם ספציפי יחוברו (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) תגובות מערכת החיסון כדי לנתח עבור דגימה (1 סרום x 4 דילולים x 4 IgG תת). לשטוף את התאים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA וזורקים את תגובת שיקוע.
  4. דגירה התאים עם כל סוג IgG אנטי חולדה העכבר אלב fluorochrome שכותרתו למשך 30 דקות ב 4 ° C, סוג/טוב.
    הערה: אם התווית על-ידי fluorochrome אנטי חולדה Ig Ab אינן זמינות, זה אפשרי להשתמש בעכבר ללא תווית מטוהרים אנטי חולדה IgG סוג Ab התווית על-ידי fluorochrome משני אנטי עכבר השתמשנו Depending על fluorochromes הזמינים ואת תצורת cytometer, תתי סוגים של IgG אנטי חולדה שונים יכול להיבדק היטב אחד עם ההגדרות המתאימות.
  5. לשטוף את התאים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA פעמיים וזורקים את תגובת שיקוע.
  6. להוסיף 100 µL של דאפי מדולל ב 0.1 µg/mL ב- PBS ולקרוא את הצלחת עם מנתח FACS.
  7. קרא את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) מסוג IgG אנטי חולדה המשנה ש-ab המסומנת fluorochrome על כל התאים דאפי– . להחסיר את MFI המתקבל עם סרום LEW.1A תמימה על תאים LEW.1W (רקע מכתים, למטה משמאל) MFI המתקבל עם שרה כל נמען על תאים LEW.1W-דילול המתאים (תחתונה התיכון עבור נמענים הדחיה לא מטופל זה להציג מקסימלי MFI והתחתון נכון עבור נמענים סובלנית שטופלו המציגים MFI ביניים) (איור 6).

5. הערכת התגובות ההורמונאלית ל אקסוגניים אנטיגנים (נאיבי וזיכרון)

הערה: סרום של חולדות לפני השתלת, וטיפול, חיסונים אמור לשמש כפקדי שלילי של התגובות ההורמונאלית. אחרת, ניתן לחסן שאינו תמים חולדות. סרום נמענים immunocompetent, קרי, נמענים לחסן exoantigen, שדחו המושתלים, משמשים כפקדי חיובית של התגובות ההורמונאלית.

  1. היכולת לפתח תגובה הומוראלית אנטיגן חדש (איור 7)
    הערה: שיטה זו היא כימות היחסי של התגובות ההורמונאלית כמו זה אינו כולל תקן. כימות מוחלטת Ig יהיה אפשרי על-ידי הוספת מגוון רחב של דילולים של עכברוש IgG או IgM anti-KLH Ab עם ריכוז ידוע בשלב 5.1.6.
    1. Emulsify 50 µg של KLH ב 200 µL של שלמה פרוינד של אדג'וונט להזריק בזנבו של נמענים רב-לשרוד/סובלנית, לשלוט נמענים הדחיה לא מטופל, או חולדות תמים כמו שליטה חיובית של התגובות ההורמונאלית.
    2. הקציר דגימות דם ב 4 ו- 13 ימים לאחר חיסון, צנטריפוגה 15 דקות ב g x 1,200 ב 4 º C. שמור השלב העליון זה הסרום. לקצור את הסרום של חולדות ללא חיסון עבור פקד שלילי. סרום שיכול להיות קפוא ב-20 ° C עד וזמינותו אליסה.
    3. מעיל חומרי ניקוי (בתחתית שטוח) עם µL 50/טוב KLH מדולל-µg/mL 10 ב- PBS X 1 לילה ב 4 º C. ודא כי הפתרון ציפוי מכסה כל הבארות.
    4. להסיר את עודף KLH ללא ציפוי על ידי שטיפה. לשטוף, להוסיף 150 µL טוב לשטוף מאגר (1 X PBS המכיל 0.1% Tween), פליק.
    5. בלוק איגוד לא ספציפי של Ig של המטופל על ידי המקננת עבור h 1 ב 37 ° C עם µL 100/טוב של שטיפת מאגר המכיל 10% FCS. לשטוף פעם אחת.
    6. לדלל את סרה הנמען במאגר שטיפת החל 1/40 1/512 באופן סדרתי, מוסיפים µL 50/טוב כפילויות של דילול טורי לצלחת מצופה, תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. שמור מספר בארות ללא סרום עבור פקד שלילי. לשטוף פעמיים.
    7. להוסיף 50 µL של µg/mL 1 של ביוטין-מצומדת אנטי חולדה IgM Ab בבארות המכיל את הנסיוב נקצרו יום 4 הנמענים, או µL 50 של ביוטין-מצומדת אנטי חולדה IgG בבארות המכיל את הנסיוב נקצרו יום 13, דגירה h 1-37 מעלות צלזיוס. לשטוף פעמיים.
    8. להוסיף µL 50/טוב של streptavidin מצומדת HRP-1 µg/mL למשך 45 דקות ב 37 º C. רחץ 3 פעמים.
    9. להוסיף 50 µL של 3, 3′, 5, המצע יונקות-Tetramethylbenzidine (שוייץ) עבור < 30 דקות ב- RT ולהפסיק את התגובה עם 25 µL של חומצה גופרתית 2 מ' כאשר חיובי פקדים רוויים.
    10. לקרוא את ספיגת-405 ננומטר. השווה הצפיפות האופטית שהושג עם סרום המטופל לזו שהושג עם הסרום בקרת עכברים תמים.
  2. הערכה של קיבולת זיכרון תגובה הומוראלית (איור 8)
    1. 7 ימים לפני ההשתלה, להזריק עירוי 109 xenogeneic RBCs מדולל ב µL 800 ל- 1 X PBS העכברושים תמים. RBCs ניתן כבשים, סוסים או כל מינים אחרים.
    2. לבצע את השתלת ולפקח על הטיפול tolerogenic.
    3. 3 ימים לאחר השתל, להזריק שוב i.v.109 RBC מעורבבת עם µL 800 ל- PBS 1 X נמענים שתל, חולדות ללא הושתל.
    4. הקציר דם דגימות 5 ו- 14 ימים לאחר חיסון שנייה צנטריפוגה 15 דקות ב g 1,200 x ב 4 ° C כדי לשחזר את השלב העליון סרום. סרום יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C או שימוש באופן מיידי. בטל המשלים בעכברוש סרה על ידי המקננת 30 דקות ב- 56 ° C לפני השימוש.
    5. להוסיף 2 x 105 RBC/טוב של צלחת התחתון V 96-ובכן. צנטריפוגה 1 דקות ב- g 1,200 x ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה על ידי השאיפה.
    6. באופן סדרתי לדלל את סרה קיפול כפול 1/10-1/1280 ב 1 X PBS (8 דילולים דוגמה). דגירה את התאים עבור h 1 ב 4 ° C עם 25 µL של סרום מדולל/טוב. לשטוף את התאים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA וזורקים את תגובת שיקוע.
    7. דגירה של תאים עם RBC מינים-הספוחה אנטי-העכברוש IgG או IgM יחוברו המסומנת fluorochrome למשך 30 דקות ב 4 ° C, סוג/טוב. להעריך את החולדה IgG ו- IgM anti-RBC בנסיוב שנקטפו 5 ו 14 ימים לאחר חיסון, בהתאמה. לשטוף את התאים עם 1 X PBS/2% FCS/0.5 מ מ EDTA פעמיים וזורקים את תגובת שיקוע.
      הערה: אם התווית על-ידי fluorochrome אנטי חולדה Ig Ab אינן זמינות, זה אפשרי להשתמש בעכבר ללא תווית מטוהרים אנטי חולדה IgG סוג Ab ועכבר התווית על-ידי fluorochrome משני אנטי-Ab.
    8. להוסיף 100 µL של דאפי מדולל ב 0.1 µg/mL ב- 1 X PBS ולנתח את התאים עם מנתח FACS.
    9. מייצגים את MFI כפונקציה של הדילול עבור כל קבוצה.

תוצאות

ההערכה של המדכא פעילות בעקבות מיון של נגמ שים (איור 1), המשיב תאים Tregs בו זמנית (איור 2), או בנפרד (איור 4), אחרים בשם רגולטוריות תאים (איור 3), יכול להיות בוצע ויוו על ידי הזרקה ישירה של תאים רגולטוריים, במב?...

Discussion

העברה המאמצת של splenocytes הכולל אל נמען לאחרונה המושתל הוא דרך יעילה כדי לזהות הנוכחות של תאים תקינה הנגרמת או potentiated על ידי טיפול. הקרנה-induced lymphopenia ארעי מארח מקדמת תא ההישרדות לאחר העברת והקמת סובלנות. יתר על כן, הקרנה תת קטלני משאיר זמן עבור תאים עם מאפיינים tolerogenic כדי להמיר תאים רגולטוריים ח?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו מומש בהקשר של הפרויקט Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) המהווה חלק מנוהל על ידי את ANR (ANR-11-LABX-0016-01) על ידי IHU-צ'סטי הפרוייקט ממומן גם על ידי התוכנית ממשלת צרפת "Investissements d'Avenir" " תוכנית ממשלת צרפת Investissements d'Avenir", מנוהלים על ידי הצרפתי הלאומי מחקר סוכנות (ANR) (ANR-10-IBHU-005). פרויקט IHU-צ'סטי נתמך גם על ידי נאנט Métropole Région פיי דה לה לואר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
animals
LEW.1W and LEW.1A ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
BN third party donor ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
namecompanycatalogue numbercomments
reagents
AdCD40IgViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
IL34-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
FGL2-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
anti-TCRabHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KR7/3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX39 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX8 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RAHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX33 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K3.2.3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/cHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX42 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgdHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KV65 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RCHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX22 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX35 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RBD Biosciences, Mountain View, CA#554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#112-096-071
anti-rat IgG1Serotec#MCA 194
anti-rat IgG2aSerotec#MCA 278
anti-rat IgG2bSerotec#MCA 195
anti-rat IgM-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#115-095-164
streptavidin HRPBD Biosciences, Mountain View, CA#554066
KLHSigma Aldrich, St. Louis, USA#9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher Scientific Inc, USAPhosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20Sigma, Saint-Louis, USA#9005-64-5
TMB substrate reagent kitBD Biosciences, Mountain View, CA#555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kitThermo Fisher Scientific Inc, USA#C34554
RPMI 1640 medium 1XThermo Fisher Scientific Inc, USA#31870-025
penicilline streptomycineThermo Fisher Scientific Inc, USA#15140-122
Hepes BufferThermo Fisher Scientific Inc, USA#15630-056
non essential amino acidsThermo Fisher Scientific Inc, USA#11140-035
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific Inc, USA#11360-039
2 beta mercaptoethanolSigma, Saint-Louis, USA#M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 CellThermo Fisher Scientific Inc, USA#65-0842-85
GlutamineSigma, Saint-Louis, USA#G3126
DAPIThermo Fisher Scientific Inc, USA#D1306
Collagenase DRoche Diagnostics, Germany#11088882001
EDTASigma, Saint-Louis, USA#E5134
NaCl 0.9%Fresenius Kabi#B230561
Magnetic dynabeadsDynal, Invitrogen#11033Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeadsEbiosciences, San Diego, USA#01-1111-42
BetadineRefer to the institutional guidelines
IsofluraneRefer to the institutional guidelines
NaplbuphineRefer to the institutional guidelines
TerramycineRefer to the institutional guidelines
BuprenorphineRefer to the institutional guidelines
MeloxicamRefer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
RompunRefer to the institutional guidelines
Ringer lactateRefer to the institutional guidelines
KetamineRefer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solutionDilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase DDilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
namecompanycatalog numbercomments
equipments
falcon 50mlBD Biosciences, Mountain View, CA#227261
falcon 15mlBD Biosciences, Mountain View, CA#188271
sieve
Corning plastic culture dishesVWR, Pessac#391-0439
100µm and 60µm tissue filtersSefar NITEX, Heiden, Switzerland#03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning#353077
96 wells V bottom plates for FACS stainingThermoScientifique, Danemark#249570
96 wells flat bottom ELISA platesNunc Maxisorb
seringue for spleen crushBD Biosciences, Mountain View, CA#309649
ELISA readerSPARK 10M, Tecan, SwitzerlandSPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiatorLincolshire, EnglandFaxitron CP160
solar agitator
FACS Canto IIBD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria IIBD Biosciences, Mountain View, CA
magnetThermo Fisher Scientific Inc, USA12302D

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, &. #. 2. 0. 1. ;., Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126TregsBregsRegMCsalloantibody

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved