שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

בהנדסת רקמות biosensing, את היכולת לשלוט בארגון המרחבי של חלבונים בתאים בסולם מיקרומטר, הפך חשוב יותר ויותר במהלך ארבעת העשורים האחרונים ^{1, 2, 3.} ארגון המרחבי מדויק של חלבונים בתאים אפשר לחוקרים לבחון את יחסי הגומלין בין תאי מצעים המכילים סוגים דומים או שונים של תאים, כדי להדריך את גדילת תאים, וכדי לשתק ביומולקולות עבור הייצור של חיישנים ביולוגיים ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

השיטות הקיימות כיום של חלבונים דפוסים כוללים photopatterning והדפסה microcontact. Photopatterning מנצל חומר רגיש לאור אשר crosslinked בחשיפה ultrאור סגול (UV). אור UV מכוון photomask (מורכב האזורים שקופים עם אזורים כהים כדי למנוע העברת אור UV) גורם crosslinking באזורים ספציפיים אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ההתקשרות הבאה של חומרים ביולוגיים או תאים ^{10, 11.} בעוד תכנית זו היא מאוד מדויקת ומאפשרת שליטה מדויקת של הטופוגרפיה של שטח התרבות, היא מוגבלת ביומולקולות UV הרגיש שניתן בדוגמת ידי קרינת UV ^12. הדפסת Microcontact היא עוד שיטה פופולרית של דפוסי חלבונים ספציפיים ^{13, 14.} בשיטה זו, siloxane פולי-דימתיל (PDMS) חותמת מטופל עם מגוון רחב של חומרים כימיים שינוי פני השטח בטרם ספוג בתמיסה של המצע וביומולקולרית הנבחר. הוא הקיש בעדינות על coverslip זכוכית או משטח אחר כך "הטבעה" את biomolecule על גבי משטח תרבות. הוwever, ביול מוגבל לסוג החומר שניתן להעביר כמו גם יכולת רטיבות של ביומולקולות אל פני השטח של PDMS להחתים ^15.

דפוסים ישירים של תאים יכולים להיות יותר קשים ומסתמכים על שיטות מורכבות כגון מצעים להחלפה, שיטות המבוסס סטנסיל, או דפוסים עם מולקולות הדבקת תא ספציפיות ^{16, 17.} שיטות אלו מוגבלים ביכולתם תאי דפוס בשל חוסר מצעי הידבקות תא תואמים, אי התאמה של התהליך לעבוד עם תאים ואילוצים ביולוגיים רגישים, חוסר עקביות לשחזר את הדפוסים, ומורכבות ההליך. לדוגמא, עם מצעים להחלפה, מצעים מותאמים אישית צריכים להיות מתוכננים עבור כל סוג תא, לעבור דבקותם סוגי תאים מסוימים ללא שפלה בחשיפה לאור UV והחום המשמש בתהליך ^17, < sup class = "Xref"> ^{18, 19, 20.} שיטות דפוסים סטנסיל מבוססות הם צדדים ביכולתם תאי דפוס; עם זאת, קשה לייצר שבלונות PDMS על עוביים המתאים לשימוש ^{16, 21.} הזרקה ישירה של תאים לתוך ערוצי microfluidic PDMS יש כמה יתרונות כגון: 1) להקל על ייצור של ערוצי microfluidic ו -2) והתאמתו תאי מצעים שונים. עם זאת, הנושא הרווחת ללכוד בועות אוויר במהלך תהליך ההזרקה בשל הידרופוביות של PDMS ללא שימוש ניקוי פלזמה, או בשיטות אחרות כדי להקטין בועות אוויר, מקשה ליצור תאים בדוגמת בעקביות על משטחי זכוכית או פלסטיק ^21.

עבודה זו מרחיבה נימי micromolding ^{22, 23,}= ילדה "Xref"> ^{24, 25, 26} ו מדווח שיטה להזריק השעיות חלבון התא לתוך microchannels. השיטה כאן מדגימה את הדפוסים של מצעים ושניהם דפוסים ישירים ועקיפים של סוגי תאים מסוימים. טכניקה זו מתגברת על הידרופוביות הגבוהה של PDMS ומונעת את הנוכחות של בועות במהלך ההזרקה של או מצעים או תאים על ידי ניצול של חדירות הגז של ²⁷ PDMS. מסמך זה מדגים את השימוש בטכניקה עם כמה מצעים שונים סוגי תאים. המאמר מדגיש גם הייצור של תבניות עבור ליתוגרפיה רכה באמצעות photolithography קונבנציונלי וכן פשוטה ושיטת דבק בעלות הנמוכה שימושית משאבי הגדרות מוגבלות ^{28, 29.}

Protocol

הערה: אנא להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. חלק מהכימיקלים המשמשים פרוטוקול זה הוא רעיל ומסרטן. השתמש כל נוהלי הבטיחות המתאים (במנדף, שבתא הכפפות) וציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות) בעת השימוש בחומרים רעילים או חומצה / בסיס.

ייצור 1. של תבניות אב ליתוגרפיה באמצעות ליתוגרפיה Soft

1. צייר את הפריסה של microchannel באמצעות כלי ציור תכנון בעזרת מחשב (CAD).
2. הדפס את הפריסה על צלחת מסיכה אטומה באמצעות סופר מסכת ליזר.
3. לשטוף פרוסות סיליקון 4 אינץ 'עם אצטון ואחריו isopropanol ויבש עם אקדח אוויר חנקן, כדי לוודא ששום ממס נותר על פרוסות סיליקון.
4. מייבש את הפרוסות על ידי אפייה זה על צלחת חמה ב 200 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
5. בחר photoresist שלילית המיועד לגובה הרצוי של microchannels. Fאו למשל, להשתמש photoresist השלילי SU-8 50 להשיג microchannels עם גובה של 50 מיקרומטר.
6. אפשר רקיק להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן ליישר את רקיק על צ'אק של coater ספין.
7. לוותר 4 מ"ל (1 מ"ל / אינץ בקוטר של פרוסות סיליקון) של photoresist שלילית על מרכז של פרוסות סיליקון.
8. ספין המעיל רקיק עם הסחיטה שני שלבים באמצעות הצנטריפוגה. ראשית, להחיל מחזור התפשטות 500 סל"ד עם תאוצה של 100 סל"ד / s עבור 10 שניות. ואז להחיל מחזור סחיטה של 2,000 סל"ד עם תאוצה של 300 סל"ד / s ² למשך 30 שניות כדי לקבל ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist על פרוסות סיליקון.
9. לאפות Soft רקיק בשני שלבים על פלטה חשמלית על פי הנחיות היצרן. לקבלת ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist, הראשון מראש לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות ולאחר מכן מיד תעלי את הטמפרטורה פלטה חשמלית כדי לפרסם לאפות את פרוסות סיליקון ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
10. אפשר רקיק להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן לטעון אתוופל לבמה ליתוגרפיה.
11. יישר את המסכה על פרוסות סיליקון באמצעות aligner מסכה ולחשוף את רקיק לאור UV (על פי הוראות היצרן) בעצימות של 1.5 mW / ² ס"מ על 146 s ליישם את המינון UV כולל של 220 mJ / ² ס"מ הנדרשים 50 מיקרומטר שכבת photoresist עבה.
12. החל לאפות חשיפה לפרסם רקיק בשני שלבים על פלטה חשמלית. לקבלת ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist, ראשון מראש לאפות את הפרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ומייד תעלה את טמפרטורת הפלטה החשמלית כדי לפרסם לאפות אותו על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
13. לפתח את רקיק על ידי השריית רקיק מפתח SU-8 ורועדת בעדינות עד תכונות להתבהר על פרוסות סיליקון. פיתוח רקיק עבור ~ 6 דקות עבור photoresist עבה 50 מיקרומטר.
14. לשטוף מפתח עודף עם isopropanol ואתנול, ולאחר מכן לייבש את הפרוסות עם אקדח אוויר חנקן.
15. קשה לאפות את פרוסות סיליקון על פלטה חשמלית ב 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
16. מניחים אתרקיק ייבוש עם 25 μL של סוכן silanizing tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane.
    הערה: סוכן silanizing הוא מאכל, ולכן יש להשתמש בתוך במנדף חומצה / בסיס, עם ציוד מגן אישי מתאים (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלאים, סגורות נעליים).
17. החל את ואקום במשך 5 דקות ולחשוף את רקיק האדים של silane במשך 30 דקות מבלי לשחרר את הוואקום.
18. מעבירים את פרוסות לתוך צלחת כראוי בגודל פטרי.

ייצור 2. מגיסטר תבניות ליתוגרפיה Soft באמצעות דבק

1. צייר את הפריסה של microchannel באמצעות כלי ציור CAD ולהדפיס את הציור על נייר לבן.
2. נקה שקופיות זכוכית גדולות מספיק כדי להכיל את העיצוב עם isopropanol ולאחר מכן לייבש את השקופית עם רובה אוויר.
3. צרף דבק לשקופית זכוכית לנקות. היזהר שלא מלכודת כל בועות אוויר.
4. קלטת את הצדדים של GLAss להחליק על הנייר עם העיצוב, עם למעלה בצד הקלטת.
5. השתמש אזמל לחתוך את הקלטת בשקופית הזכוכית באמצעות עיצוב נייר כהפניה ולאחר מכן לקלף קלטת מאזורים לא רצויים של שקופיות הזכוכית.
6. יש לשטוף את השקופית זכוכית עם isopropanol ואז יבש עם רובה אוויר. אופה את שקופיות זכוכית בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
7. בעדינות לגלגל את הקלטת עם מכבש גומי כדי להסיר בועות אוויר ולאפשר את השקופית להתקרר לטמפרטורת החדר.

3. ייצור ליתוגרפיה Soft של מכשירי PDMS

1. מערבבי PDMS אלסטומר סוכן הריפוי שלה ביחס של 10: 1 (w: w), מערבב את התערובת במרץ, ולאחר מכן דג את התערובת על ידי צבת אותו לתוך תא ואקום עד שאין בועות אוויר מופיעות התערובת.
2. יוצקים את התערובת על תבנית סיליקון silanized או עובש דבק בצלחת פטרי להשיג ~ 2 מ"מ שכבה עבה של PDMS דגה עד שכל האוויר בועות להיעלם.
3. לרפא את PDMS בתנורעל 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
4. השתמש אזמל לחתוך את שכבת PDMS במרחק של לפחות 5 מ"מ מן התכונות ולאחר מכן לקלף את PDMS נרפא את התבנית באמצעות פינצטה.
5. פאנץ חור כניסת יחיד עם ביופסיה 1 מ"מ אגרוף בכל מקום על microchannel, רצוי בסוף רשת של microchannels כפי שניתן לראות באיור 2a ו -4.
6. נקו את PDMS יצוק עם סרט דביק על מנת להסיר חלקיקי אבק adsorbed על גבי המכשיר. לעקר את המכשיר microchannel PDMS (יצוק PDMS) על ידי שטיפה עם תמיסה של אתנול 70% ואחריו מים סטריליים deionized (DI), ולחשוף את UV למשך 30 דקות.
7. השאר את המכשיר PDMS סטרילי בצלחת פטרי סטרילית עד השימוש.

4. תשתית דפוסים

1. מניחים את PDMS סטרילי יצוק באמצעות פינצטה על coverslip כוס סטרילית או בצלחת פטרי להפעיל לחץ עדין באמצעות קצה של פינצטה.
   הערה: צוות השחקנים PDMS עושה קונפורמי אבל חותם הפיך עם GLcoverslip התחת או בצלחת פטרי להרכיב microchannels ללא שימוש בכל דבק.
2. מניח טיפה (20 - 40 μL) של פתרון המצע על הכניסה לגמרי מכסה את חור המפרצון. תבנית Poly-D- ליזין (PDL) על ידי הצבת אגל 20 μL של PDL חיץ נתרן tetraborate על מפרצון של microchannels.
3. שים את צלחת פטרי בחלל ריק של ~ 254 mmHgA (שווה ערך ל לשכן ואקום במעבדות ביולוגיות) במשך 10 דקות, ולבחון אוויר היוצא של הערוץ בצורת בועות.
4. לשחרר את הוואקום ולבחון את פתרון המצע זורם לתוך microchannel.
5. דגירת הצלחת על התנאים המתאימים דבקות מצע. ראה לוחות 1 ו -2 תנאי דגירה (אלה משתנות בהתאם למצע). לקבלת דפוסי PDL, דגירה של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס.
6. בזהירות לקלף את חותמת PDMS באמצעות פינצטה סטרילית לשטוף את התבנית על coverslip זכוכית שלוש פעמים עם מים די.
7. הוספת אלבומין 1% שור פתרון (BSA) כדי בצלחת פטרי לכסות את התבשיל או coverslip הזכוכית דגירה לילה בשעה 37 ° C.
   הערה: זה יקטין דבקות שאינן ספציפיות באזורים ללא ציפוי.
8. לשאוב את פתרון 1% BSA, ואת המצע בדוגמת עכשיו הוא מוכן לשימוש.

5. דפוסים עקיפים של תאים

1. הכן את ההשעיה תא בינוני תרבות סרום ללא. סוג התא צפיפות התאים מפורטים בטבלה 1.
2. מוסיפים את ההשעיה תא אל צלחת פטרי בדוגמת ובאופן מוחלט לצלול באזור בדוגמת ההשעיה הסלולרי.
3. דגירת צלחת פטרי על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף מצע בדוגמת.
4. לשאוב את השעית התא העודפת מצלחת פטרי לשטוף את התאים בדוגמת שלוש פעמים עם בופר פוספט (PBS) תוך רעד בעדינות במשך 10 שניות כדי להסיר תאים פנויים.
5. להוסיף אמדיום תרבות ppropriate אל בתרביות תאים בדוגמת דגירת התאים בדוגמת ב 37 מעלות צלזיוס CO ₂ באינקובטור.

6. דפוסים ישירים של תאים

הערה: טכניקה זו היא חלופת דפוסי התא העקיף כמתוארים בשלב 5. עם זאת, שלא כמו בשלב 5, בטכניקה זו תאים הם בדוגמת על משטחים בתרבית רקמה עם או בלי ציפוי מצע.

1. לעקר את המכשיר microfluidic על ידי שטיפה עם תמיסה של 70% אתנול ואחריו מים DI.
2. משרים את המכשיר לילה בתמיסה של BSA 1% כדי למנוע את הידבקות התא אל PDMS.
3. לייבש את המכשיר בטמפרטורת החדר וצרף אותו לחלק התחתון של צלחת פטרי שטופלו בתרבית רקמה.
4. הכן את השעית תא תקשורת ותרבות סרום ללא. סוג תא צפיפות תאים מפורטים בטבלה 2.
5. מניחים טיפה (4 - 8 μL) של ההשעיה תא, מספיק כדי למלא אתmicrochannels, על הכניסה לגמרי מכסה את חור המפרצון.
6. שים את צלחת פטרי בחלל ריק במשך 10 דקות ולבחון אוויר היוצא של הערוץ בצורת בועות. לשחרר את הוואקום ולבחון את ההשעיה תא לזרום לתוך microchannel.
7. דגירת צלחת פטרי באינקובטור כדי לקדם את הידבקות תא בהתאם לתנאי הדגירה (תלוי בסוג של תא בדוגמת) ציין בטבלה 2. להוסיף PBS על צלחת פטרי השריית מכשיר PDMS.
8. מקלפים את PDMS בזהירות מעל צלחת פטרי עם פינצטה לשטוף את התבנית עם PBS. הוסף מדיה תרבית תאים כדי בצלחת פטרי ומקום תרבית התאים בחממה.

תוצאות

שיטה זו מאפשרת יצירת הדפוסים של חלבוני דפוסים עקיפים של תאים באמצעות ערוצי microfluidic למבוי סתומים עם ממדים קטנים כמו 10 מיקרומטר וציוד זמין כמעט בכל מעבדות ביולוגיות פעם עובש האמן הוא עשה. טכניקה זו יכולה להיות מנוצלת עם ערוצי microfluidic PDMS נוצרו באמצעות pho...

Discussion

בעוד photolithography הקונבנציונלי היא טכניקה מבוססת היטב ליצירת תבניות עבור ליתוגרפיה רכה, הציוד, חומרים, ואת כישורים דרושים כדי להשתמש photolithography הקונבנציונלי אינם זמינים ברוב המעבדות. למעבדות ללא גישה למשאבים אלה, והצגנו ייצור סרט דביק כשיטה של ​​יצירת תבניות עם תכונות פ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS