RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

Summary

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Abstract

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Introduction

תאי CD4 ⁺ T הם Orchestrators חיוני של התגובה החיסונית אדפטיבית. תאים נאיבי CD4 ⁺ T המסוגלים להתפתח לתאי T מפעיל שונים (למשל Th1, Th2, TH17, וכו '), כל אחד עם סט משלו של ציטוקינים מאפיין גורמי שעתוק, תלוי במיקרו-סביבה מקומיים ^1. החלטות השושלת תאי T להפוך הן קריטיות עבור שני החסינויות וסובלנות עצמיות. תאי TH17 הם תת-קבוצה אחת של תאי T הידועים להילחם חיידקים ופטריות תאיים, אבל התגובות הפסולות שלהם הן מעורבות גם בפתוגנזה של מחלות מרובות אוטואימוניות ודלקתיות כגון טרשת נפוצה ופסוריאזיס ^{2, 3.} ניתן להפיק תאי TH17 אדם מתאי נאיבית CD4 ⁺ T במבחנה על ידי מתן אותם עם סביבת מקטב מתאימה ^4. Vario לנו שילובים של ציטוקינים IL-1β, IL-23, TGFβ, ו- IL-6 שימשו לפיתוח תאי TH17 האנושי. תאי האדם TH17 להביע CCR6, קולטן chemokine כי הוא נפוץ לזהות אוכלוסיית התא הזה ומוגדרים על ידי הביטוי של גורם השעתוק העיקרי שלהם, RORγt (המקודדים על ידי RORC) ^{5, 6.} יש TH17 התאים את היכולת להביע ציטוקינים מרובים, אך IL-17A הוא ציטוקין מפעיל-המגדיר בשושלת מיוצר על ידי תאים אלה. בחנו את הביטוי של כל שלושת הסמנים הקשורים TH17 (CCR6, RORγt, IL-17A) כדי להעריך את החוסן של assay בידול במבחנה ב TH17 האנושי שלנו. בנוסף, אנו בתרבית תאים מסוג CD4 ⁺ T אנושיים בתנאים בלתי-מקטב, שבו אין ציטוקינים או נוגדנים חוסמים נוספו התקשורת והתרבות להשתמש כביקורת שלילית מאז הביטוי של סמנים TH17 אלה צריכים להיות מאוד נמוך או נעדר.

ve_content "> דרך אחת ללמוד פיתוח T תא אנושי נורמלי ביולוגיה היא לתפעל ביטוי גנים במהלך ההתפתחות שלהם. קצר מפריעים RNA (siRNA) הם מולקולות רנ"א קטנות כי למקד תעתיקי המקודדים חלבונים והוא יכול להיות מנוצל כדי להפחית ביטוי גנים ספציפיים . מיקרו RNA (miRNAs) הוא אנדוגניים ללא קידוד RNA הקטן הידוע לווסת ביטוי גנים לאחר תעתיק. miRNAs הוכח לשחק תפקיד חשוב הן בעכברי ביולוגיה של תא T אנושי, לרבות TH17 תא ^{7, 8, 9.} זה חשוב לי שיטות אמינות של מניפולצית פעילות RNA קטנה תא T אנושי ללמוד והשפיע על ביטוי גנים, ובסופו של דבר על הביולוגיה של תאי T אנושי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קל לשימוש, עקבי ואמין שפתחנו עבור החדרה RNAs סינטטי קטן וחומצות גרעין נעול (LNAs, שינוי כימי חומצות גרעין עם יציבות מוגברת)לתוך תאי מערכת חיסון, ובאופן ספציפי לתאי TH17 אנושיים.

ישנן מספר שיטות חלופיות של החדרת RNA הקטן לתוך תאי יונקים, אשר בדרך כלל מתחלקים לקטגוריות כימיות, ביולוגיות, או פיסיות ^10. בשימוש נפוץ שיטות כימיות, כולל transfections שומנים מבוססי transfections וסידן-פוספט, להסתמך על יצירת מתחמים הכימי-DNA, כי הם יותר נלקחים ביעילות על ידי תאים. באופן כללי, שיטות כימיות אינן יעילות כמו עבור transfection של תאי T העיקריים. השיטה הביולוגית הנפוצה ביותר היא להשתמש וקטור ויראלי (רטרו-וירוס למשל או lentivirus), אשר מוסיף RNA זרות ישירות לתוך שורה כחלק מחזור השכפול הטבעי שלה. תמרת ויראלי בדרך כלל לוקחת יותר זמן כדי להשלים, במיוחד כאשר אחד גורמים בזמן שיבוט מולקולרי של פלסמידים proviral. בנוסף, וקטורי תמרת ויראלי יכולים להיות מזיקים חוקרים אנושי. Electroporation הוא מ פיזיתethod של גרימת הקרום permeabilization ידי העמדה לתאים פולסי מתח גבוה, המאפשרת חומצות גרעין להיכנס לתוך התא זמני שבו הם יכולים לפעול על היעד שלהם. מכשירי electroporation מסורתיים היו לא יעילים עבור transfecting לימפוציטים העיקרי. עם זאת, electroporation הדור הבא אופטימיזציה הוכיח להיות מסוגל transfecting תאי T ביעילות גבוהה מאוד, במיוחד כאשר החומר להיות transfected הוא RNA הקטן. הדור הבא המונח משמש באופן רופף להבדיל שני הפלטפורמות החדשות יותר (למשל, הניאון, Amaxa) ממכונות electroporation מסורתיות. בנוסף, שיטה זו היא להרחבה בקלות עבור מסכי תפוקה מתונים עם עד כ 120 RNA הקטנים בניסוי אחד, לעתים קרובות באמצעות ריאגנטים סינטטיים תוקף. חשוב לציין, ניתן להשיג transfections מוצלח קטן כמו 16 שעות לאחר הפעלת תא T. החסרון של שיטה זו, לעומת זאת, הוא שזה לא לגרום incorporati גנומי יציבעל, ולכן הוא חולף. לפיכך, זה שווה את המאמץ הנוסף כדי ליצור מבנה ביטוי יציב שיכול להיות ארוז לתוך וקטור ויראלי והביע בהצלחה בתאי T במקרים בם ביטוי לטווח הארוך של RNA קטנה נדרש.

השתמשנו transfection הדור הבא (למשל, ניאון) כדי לספק כלי RNA או LNA oligonucleotide יחידים או פעמים התקועות סינטטיים מגוונים למטרות שונות ^{11, 12, 13.} התערבות RNA יעילה יכולה להיגרם עכבר עיקרי ותא T אנושי באמצעות RNA דו-גדילים קצרי מפריעים (siRNA). פרוטוקול זה מתאר מצבים מותאמים לשימוש בטכניקה זו בתאי TH17 אנושיים. בנוסף siRNAs, מחק מירנה סינטתית זמינה מסחרי מעכבים יכולים לשמש כדי ללמוד רווח מירנה ואובדן התפקוד. מחקה מירנה הן מולקולות RNA דו-גדילים דומות מאוד siRNAs, אבל designeד עם רצף של miRNAs בוגרת אנדוגניים. מעכבי מירנה הם כימית-modified RNA ו / או LNA מבוסס oligonucleotides תקועים אחד אשר נקלטות על ידי miRNAs יליד להרגיז את תפקידם. מצאנו כי כל הכלים האלה יכולים לשמש ביעילות לימפוציטים מסוג T העיקרי מתורבתים, לרבות אך לא רק תאי TH17 אנושיים.

Protocol

פרוטוקול זה פועל לפי ההנחיות של UCSF לאתיקת מחקר אנושי.

1. הכנת תרבית תאי T, הבידוד של תאים מסוג CD4 ⁺ T, ואת קיטוב TH17

1. ביום 0, צלחות תרבות מעיל רקמה 6-היטב עם 1.5 מ"ל לכל טוב של CD3 אנטי אנושי (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C.
   1. לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm.
2. הכן את התאים mononuclear דם טבורי (CBMCs) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות לפי הוראות היצרן.
   זהירות: עבוד בזהירות ולוודא ציוד מגן אישי מתאים (PPE) הוא משוחק בעת טיפול דם אנושי כדי למנוע כל סיכון של חשיפה לפתוגנים שמקורן בדם.
3. ברגע שתאי mononuclear בודדו ורחץ, לבצע בידוד תא אנושי CD4 ⁺ T על ידי Sele גודל שליליction באמצעות ערכת תא מסחרית האנוש CD4 ⁺ T.
   הערה: אם יש זיהום תא דם אדום לאחר בידוד תא mononuclear, הגידול ימס כדוריות דם אדום אופציונאלי עשויות להתבצע לפני צעדי בידוד תא CD4 ⁺ T. Resuspend התאים mononuclear ב 1 מ"ל של חיץ בידוד (2% FBS ב PBS). מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת lysing 1x. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 5 מ"ל של חיץ צנטריפוגות בידוד XG 300 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
   1. Resuspend התאים mononuclear בצפיפות של 50 x 10 ⁶ לכל 500 μL במאגר הבידוד בצינור 5 מ"ל חדש.
   2. הוספת 100 μL של FBS ו 100 μL של מיקס נוגדן לכל צינור דגירה אז כל צינור בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על שייקר מסלולית לערבב היטב.
   3. לאחר דגירה, להוסיף 3-4 מ"ל של חיץ בידוד לשטוף את התאים. צנטריפוגה התאים XG 300 8 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. בזהירות לשאוב Supernatant.
   4. במהלך ספין זו, טרום לשטוף את החרוזים המגנטיים. מעביר את הכמות הרצויה של חרוזים מגנטיים לתוך צינור חדש (בשימוש ב- 1: 1 עם התאים) ולהוסיף נפח שווה של חיץ בידוד כדי לשטוף את החרוזים. מערבבים היטב באמצעות micropipette מ"ל 1 ולאחר מכן למקם את הצינורית שואבת דק 1 לפחות. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend החרוזים המגנטיים בהיקף הזהה הועבר בתחילה לפני הכביסה.
   5. Resuspend התאים בצינור אחד עם 500 μL של חיץ בידוד ולהוסיף 500 μL של חרוזים מגנטיים מראש שטף.
   6. דגירה התאים עם חרוזים מגנטיים עבור 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) לערבב היטב.
   7. לאחר דגירה, ביסודיות pipet התאים באמצעות micropipette 1 מ"ל לפחות 10 פעמים. ואז להוסיף 3-4 מיליליטר של חיץ בידוד ומקום כל צינורית השואבת 2 דקות.
   8. להעביר בזהירות את התאים באופן שלילי שנבחרו CD4 ⁺ T הנמצאיםאת supernatant לצינור חדש.
4. לאחר CD4 ⁺ T בידוד תא יושלם, לספור את התאים עם hemocytometer ולשמור תאים על קרח.
5. לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 1.5 מ"ל של 2x תערובת של TH17-מקטב התקשורת היטב כל: אנטי-אנושי IFNγ (20 מיקרוגרם / מ"ל), אנטי אנושי IL-4 (20 מיקרוגרם / מ"ל), TGFβ אדם (10 ng / mL), אדם IL-1β (40 ng / mL), אדם IL-23 (40 ng / mL), IL-6 אדם (50 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 10 HEPES מ"מ, 1 מ"מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol).
   הערה: Transfection והפרעה RNA עושה עבודה בתקשורת סרום המכיל. מטרת השימוש בסרום ללא מדיה עם פרוטוקול זה היא להשיג ייצור IL-17A טוב יותר.
6. צנטריפוגה תאי CD4 ⁺ T האנושיים XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת תאים. בזהירות לשאוב supernatנְמָלָה. ואז resuspend התאים בתקשורת בסיס סרום ללא צלחת התאים בצפיפות של 3 x 10 ⁶ ב 1.5 מ"ל לכל היטב כך נפח הסופי הוא 3 מ"ל לכל טוב וציטוקינים מקטב כיום בריכוז סופי 1x.
   1. מניחים את הצלחות ב 5% ₂ CO, 37 ° C חממה במשך יומיים.

2. Electroporation של במבחנת תאי TH17 אנוש Polarized

1. ביום 2, צלחות תרבות 48-היטב רקמות מעיל עם 250 μL לכל טוב של אנטי אנושי CD3 (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C.
   1. לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm.
2. כן RNA הקטן עבור transfection. במשך כל transfection, aliquot 1 μL של פתרון המניות 5 מיקרומטר של siRNA לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. כלול contr RNA קטן כימית בהתאמה המתאימהol. שמור את כל הצינורות על קרח.
3. לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 500 μL של 1X TH17-מקטב התקשורת היטב כל: IFNγ האנטי-אנושית (10 מיקרוגרם / מ"ל), אנטי אנושי IL-4 (10 מיקרוגרם / מ"ל), אדם TGFβ (5 ng / mL), אדם אִי- 1β (20 ng / mL), אדם IL-23 (20 ng / mL), IL-6 אדם (25 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 10 HEPES מ"מ, 1 מ"מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol).
4. לאחר הצלחות תרבות ריאגנטים transfection מוכנים, להשעות את התאים עם pipetting 1 מ"ל micropipette, בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. פינת התאים לתוך צינור צנטריפוגות חרוטים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °.
   הערה: עבור תקופות תרבות יותר מאשר פרוטוקול ארבעה ימים המוצגת כאן, התאים צריכים להיות טרנספקציה בערך כל 3 ימים באמצעות בפרוטוקול הזה. שלב 20.4 מן ראוי לשנות זאת מאז התאים שטופלו RNA הקטן שונה לא צריכים להיות ונקווה. כל התנאים הנבדקים יש לאסוף, נספר בנפרד טרנספקציה.
5. בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים לפחות 1 מ"ל של PBS לשטוף. ספירת תאי TH17 החיים (למשל עם hemocytometer באמצעות הרחקה הכחולה Trypan להעריך כדאיות) ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור microcentrifuge.
6. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
7. בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים באמצעות חיץ resuspension סיפק מן ערכת מערכת transfection 10 μL בצפיפות של 2.5-4 x 10 ⁷ תאים לכל מ"ל. שמור תאים בטמפרטורת החדר.
   הערה: ככלל מנחה, ולנסות להכין רק כמו תאים רבים ככל שניתן טרנספקציה בתוך 30 דקות. ניתן להשוות קבוצות מרובות.
8. להוסיף 9 μL של תאים 1 μL של RNA קטנים בכל microcצינור entrifuge. Pipet פעם לערבב את התאים RNA קטנים עבור transfection מכן לטעון לתוך קצה האלקטרודה פיפטה המסופקים.
   הערה: בדרך כלל, להוסיף 9.5 μL של ההשעיה התא כדי להבטיח שיש מספיק מהתערובת על מנת למנוע יצירת בועות קצה האלקטרודה pipet לפני transfection.
9. מלאו קובט מסופק עם 3 מ"ל של E. חוצץ אלקטרוליטי בטמפרטורת החדר מקום קובט בתוך תחנת פיפטה ואז למקם את פיפטה לתוך העמדה בתוך קובט.
10. מייד electroporate כל תמהיל 10 μL של תאים ו- RNA הקטן באמצעות הפרמטרים הבאים: מתח דופק 1,500-1,550 V, רוחב דופק 10 ms, ו 3 פולסים הכוללים במכשיר transfection.
11. לאחר electroporation יושלם, ישירות מוסיף את תערובת תא 500 μL של 1X TH17-מקטב תקשורת בארות מוכנות של צלחת תרבות. צלחות מקום בתוך CO 5% _2, 37 ° C חממה במשך יומיים נוספים.
    הערה: לשטוף את קצה האלקטרודה פיפטה ידי pipettingמעלה ומטה PBS בין כל transfection.

3. תאי קציר האנוש TH17

1. Resuspend התאים התקשורת והתרבות עם micropipette, pipetting בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. הכן את התאים עבור מבחני ביטוי תפקודיים ו / או גן.
   הערה: שגרה, מספיק תאי ניב מבאר אחת של תאי TH17 טרנספקציה לשמש לניתוח הזרימה cytometric של סמן משטח גורם ציטוקינים ותמלול תאיים מכתים או להכנה של RNA עבור ניתוח ביטוי גנים.

תוצאות

הצעד הראשון כדי לפתח מערכת אמינה של electroporating בהצלחת תאים אנושיים TH17 היה לייצר חזק בתרביות תאי TH17 אנושיות המובחן במבחנה. תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 הביע את הקולטן chemokine CCR6 ואת גורם שעתוק RORγt (איור 1A, שמאל). סמנים אלה לא באו לידי ביטוי ...

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור המשלוח של RNA הקטן לתוך תאי TH17 אנושיים. למרות תאים אנושיים TH17 שימשו כאן, שיטה זו של electroporation עם RNA קטנים יכולים לשמש עם תת T מסייעים האנושי העיקרי אחרים, כגון Th1, Th2, ו Tregs. זה לא עבד היטב עבור תאים נאיביים CD4 ⁺ T כך התאים חייב להיות מופעל ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use