An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מחייב Assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים

Summary

כאן אנו מתארים שיווי משקל שיווי משקל מהיר (אדום) שיטה למדוד מחייב סמים כדי caseum מ נגעים שחפת ריאות וחללים. הפרוטוקול משמש גם עם מטריצה ​​קצף הנגזר מקרופאג כי הוא תחליף יעיל caseum.

Abstract

חיסול מחלת השחפת דורש משטרי סמים שיכולים לחדור לשכבות מרובות של נגעים ריאתיים מורכבים. התפלגות הסמים של ליבות המקרה של חללים ו lesions הוא חיוני במיוחד משום שהם הנמל subpopulations של חיידקים סובלני חיידקים גם נפוץ המכונה פרעות. שיטות קיימות למדידת חדירת סמים בשחפת שחלות כרוך יקר זמן רב במחקרים vivo pharmacokinetic יחד עם טכניקות bioanalytical או הדמיה. המדידה במבחנה של תרופה מחייב מקרומולקולות המקרה הוצע כחלופה לטכניקות כאלה מאז מחייב זה מעכב את דיפוזיה פסיבית של מולקולות התרופה באמצעות caseum. דיאליזה מהירה שיווי המשקל היא מערכת מהירה ואמינה לביצוע מחקרים חלבון פלזמה ורקמות מחייב. בפרוטוקול זה, השתמשנו דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) מכשיר למדוד מחייב סמים homogenates של caseum כי הוא excisאד מן הנגעים והחללים של ארנבים נגועים בשחפת. הפרוטוקול גם מתאר כיצד ליצור מטריצה ​​פונדקאית מן השומנים טעון מקרופאגים THP-1 להשתמש במקום caseum. caseum / זה assay מחייב הפונדקאי הוא כלי חשוב לגילוי תרופות לשחפת ניתן להתאים לעזור ללמוד הפצת תרופת נגעים או מורסות נגרמים על ידי מחלות אחרות.

Introduction

הטיפול במחלת שחפת ריאות מחייב הפצה יעילה של תרופות לסוגים שונים של נגעים. נגעים נקרוטיים וחללים מכילים מרכזים קוגניטיביים המאכלסים תת-אוכלוסיות של חיידקים סובלניים או "מתמידים". ^{1 , 2} המחלה cavital קשורה עם שיעורי תרופה נחות ופרוגנוזה גרועה. ^{3 , 4} מחקרים קודמים הראו, באמצעות טכניקות כמותיות והדמיה, כי היכולת לחדור caseum משתנה באופן משמעותי משלב התרופות אחד למשנהו. ^{5 , 6} שיטות אלה, לעומת זאת, דורשים שימוש במודלים זיהום בבעלי חיים כי הם איטיים ומייגעים. ב assay במבחנה כי אמצעים מחייב סמים exum case vivo לשעבר תוכנן. מחייב זה נמצא בקורלציה הפוכה עם חדירת סמים גרנולומה במקרה, ומכאן, הואהמשמש כלי ניבוי. ⁷

שיווי המשקל דיאליזה נחשבת כגישה זהב רגיל למחקרים חלבון פלזמה מחייב. דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) המכשיר מספק מהיר, קל לשימוש מערכת אמינה לביצוע מבחנים כאלה. ⁸ המכשיר מורכב משני מרכיבים: תוספות חד פעמיות, חד פעמיות המורכבות משני תאים המופרדים על ידי גליל אנכי של קרום חדיר למחצה; ואת לוחות בסיס לשימוש חוזר שיכול להכיל עד 48 מוסיף בכל פעם. קרום דיאליזה יש 8 kDa משקל מולקולרי לחתוך (MWCO) כי הוא אידיאלי עבור מחקרים מקרומולקולה תרופה. היחס בין שטח השטח לנפח גדול של תא הממברנה מאפשר דיאליזה מהירה ושיווי משקל. הן התוספות והן צלחת הבסיס אומתו עבור מחייב מינימלי שאינו ספציפי. השילוב של המכשיר האדום עם טכניקות bioanalytical מספק הערכות מדויקות של שברים unbound של תרופות pLasma. ^{8 , 9}

למרות תוכנן במקור למדוד מחלב פלזמה מחייב, המכשיר האדום כבר בשימוש במספר מחקרים מחייב רקמה באמצעות homogenates. ^{10 , 11} בפרוטוקול זה, אנו מודדים את התרופה מחייב caseum, פסולת נקרית נכרת מן נגעים נמק חללים של שפעת נגועים ארנבות. האופי ואת לא כלי הדם של חומר caseous עושה את זה קל homogenize לתוך ההשעיה הומוגנית התואמת assay.

בהתחשב בכך caseum מייגע לייצר וקשה לבוא, הפרוטוקול יש גם תוקף לשימוש עם מטריצה ​​פונדקאית כי הוא מוכן מקרופאגים מקציף. THP-1 מונוציטים הנגזרות מקרופאגים הם המושרה עם חומצה אולאית לצבור מספר רב של גופים השומנים המעניקים להם את המראה "מקציף" שלהם. תאים אלה טעון שומנים נקצרים ומעובד כדי לייצר מטריצה ​​שאנחנו משתמשים בתור תחליף כדי caseum. מחקר זה הוכיח כי התרופה קשורה מטריקס זה פונדקאי מתואם היטב עם מחייב caseum, ביעילות מחקה את תהליך vivo כי מעכב חדירת סמים הליבה המקרה של גרנולומות וחללים.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות באישור ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש NIAID (NIH), Bethesda, MD. כל המחקרים היו מעורבים מ שחפת בוצעו במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3).

1. ארנב דגם זיהום Caseum אוסף

1. להדביק ניו זילנד ארנבים לבנים עם שחפת באמצעות מערכת חשיפת תרסיס אף בלבד כפי שתואר לעיל. ^{12, 13} אפשר זיהום להתקדם במשך 12-16 שבועות. שלווים ארנבים עם 35 מ"ג / ק"ג קטמין 5 מ"ג / ק"ג xylazine לשריר, להרדים את הארנבים עם 0.22 מ"ל / ק"ג נתרן ו פניטואין נתרן pentobarbital לווריד ולהמשיך עם necropsies.
2. באמצעות פינצטה אזמל, להסיר ריאות מן ca החזה. מכל אונה ריאה, לנתח את חללים בודדים גרנולומה נמקית גדולה באמצעות איזמל. בזהירות לגרד את caseum מן החלל ואת הקירות גרנולומה. לשקול, להקליט דגימות החנות ב 2 מ"ל בורג כתרים צינורות ב -20 ° C עד מוכן לשימוש.
3. Gamma- להקרין את דגימות caseum זיהומיות ב 3 MegaRad על קרח יבש כדי להפוך אותם חסרי ובטוח לשימוש במעבדה BSL-2.

2. בשנת הדור גזרתי של Caseum פונדקאי THP-1 תאים

1. לגדול THP-1 מונוציטים ב RPMI 1640 בינוני (2 מ"מ L- גלוטמין 10% בסרום עוברי בסרום) ב T175 צלוחיות תרבות התא (80 מ"ל / בקבוק). דגירה את צלוחיות באווירה 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים.
2. צנטריפוגה התרבות מבקבוק T175 בשני צינורות 50 מ"ל חרוטי ב 150 xg במשך 5 דקות. מחק supernatant ו להשעות את גלולה 10 מ"ל של התקשורת 1640 RPMI.
3. פיפטה 5 μL של תרבות זו לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 45 μL של tכחול. מערבבים היטב לפי pipetting. העברה 10 μL כדי hemocytometer ולספור את מספר monocytes THP-1 קיימא (ללא כתם) באמצעות מיקרוסקופ אור (הגדלה 10X). חישוב מספר תאים קיימא לכל מ"ל של התרבות. לדלל אותו עם התקשורת RPMI לצפיפות הסופית של 1.25 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
4. טען 40 מ"ל של התרבות על צלחת תרבות גדולה התא (50 x 10 ⁶ תאים / צלחת). הוסף 40 μL של 100 מיקרומטר PMA (פורבול 12-myristate13 אצטט מוכן באתנול) ולאפשר לתאים לדבוק לילה בחממה.
   הערה: הריכוז הסופי של PMA הוא 100 ננומטר.
5. מדולל חומצה אולאית טהורה (OA) (0.89 גרם / מ"ל) באתנול לריכוז של 0.1 M ( כלומר 31.7 OA μL ב 968.3 אתנול μL). לדלל את הפתרון הזה טריים מראש חימם מדיה RMPI לריכוז של 10 מ"מ. לדלל את ההשעיה OA ל 0.4 מ"מ (ריכוז עובד הסופי) בינוני RPMI מראש חימם ל 37 מעלות צלזיוס.
6. הסר את המדיה הקיימת ולא אתתאים -adhered מן צלחות תרבית תאים ולהוסיף בעדינות 40 מ"ל של 0.4 מ"מ OA אל מקרופאגים THP-1 (THP-M). לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה לילה.
7. שימוש במיקרוסקופ אור בהגדלה 40x חזותי לאשר הנוכחות של תכלילים גוף שומנים רבים בכל THP-M. הסר את כל מדיום RPMI מן צלחות תרבית תאים בעדינות לשטוף את התאים החסידים פעמים עם בופר פוספט (PBS) בעזרת פיפטה סרולוגיות 50 מיליליטר.
   הערה: גופים ליפידים להופיע קטן, ברור, מבנים כדוריים בציטופלסמה של THP-M.
8. להוסיף 40 מ"ל של 5 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב PBS על כל צלחת. דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
9. הפרידו את מקרופאגים מקציף (FM) על ידי pipetting מעלה שוב ושוב ושוב על פני השטח של צלחת כולו באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 50 מ"ל ומסובב ב XG 150 עבור 5 דקות.
10. Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של PBS (לשטוף PBS השלישי) אnd להעביר צינורות חרוטי טרום שקל 15 מ"ל. ספין למטה שוב ב XG 150 עבור 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant בעזרת פיפטה, נושא הפסולת סרולוגיות.
11. הנושא את כדורי FM כדי 3 מחזורים להקפיא להפשיר כדי lyse תאי דגירה אותם 75 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לפגל חלבונים במטריצה. אחסן את כדורי נייר -20 ° C עד מוכן לשימוש.

Assay 3. דיאליזה ראפיד איזון (RED)

1. כן 10 מניות פתרונות מ"מ של כל תרכובות בדיקת sulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל את 500 מיקרומטר עובד פתרונות DMSO לפני כל assay.
2. לשקול את הצינור המכיל את הגלולה הפונדקאית caseum. הפחת משקל הצינור הריק כדי לגזור את המשקל של הגלולה לבד. להוסיף 2-3 חרוזי מתכת לכל צינור ו, באמצעות homogenizer רקמות בבית 1200 משייכות / min 1 דק ', לשבש caseum או המטריצה ​​הפונדקאית ב PBS (1: 9 w / v) כדי להשיג 10x השעיה מדוללת של כל מטריצה.
3. ספייק 6.5 μL של 500ΜM הפתרון של המתחם הבדיקה לתוך 643.5 μL של homogenate כדי להשיג את הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר (≤ 1% DMSO) ו מערבולת.
4. מניחים את התוספות האדומות בצלחת הבסיס. הוסף 200 μL של מטריקס סמים ממוסגרת לתא התורם (טבעת אדומה) של כל הוספה אדום ו 350 μL של PBS לתוך כל חדר המקלט. הכן 3 מוסיף עבור כל מתחם הבדיקה (דגימות בשלושה עותקים). צלחת חותם עם דבק צלחת דבק ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס על thermomixer ב 200 סל"ד (1 xg) במשך 4 שעות.
5. לאחר הדגירה, לערבב בעדינות את התוכן של התורם ו המקלט חדרים על ידי pipetting מעלה ומטה 2-3 פעמים. פיפטה 20 aliquots μL של homogenate מתאי התורם ולהוסיף 20 μL של PBS נקי בצינור 1.5 מ"ל (1: 1). באופן דומה, פיפטה 20 aliquots μL של דגימות PBS מתאי המקלט ולהוסיף μL 20 של homogenate נקי (התאמה מטריקס). ⁸
   הערה: התאמת מטריקס מבטלת את neעבור 2 עקומות כיול נפרד (ב homogenate ו PBS) כדי להיעשות לצורך ניתוח כמותי. התוכן של החדר התורם עשוי משקעים לאורך זמן. בעדינות לערבב את התוכן על ידי pipetting לפני הסרת aliquots.

4. כימות LC-MS וניתוח נתונים

1. הוסף 160 μL של 1: 1 מתנול: אצטוניטריל המכיל 500 ng / מ"ל ​​diclofenac או 10 ng / מ"ל ​​verapamil (תקן פנימי) על כל צינור ו מערבולת כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 5 דקות למשקע משקע והעברת supernatants לתוך 96 היטב טוב צלחות היטב עבור ניתוח כרומטוגרפי נוזלי ספקטרומטריית מסה (LCMS). ⁷
2. בניית עקומות כיול מ 1-1,000 ננומטר עבור כל מתחם הבדיקה תוך שמירה על הרכב מטריקס זהה הדוגמאות לעיל. לכמת את הריכוז של מתחם הבדיקה בדגימות של התורם ו המקלט חדרים באמצעות שיטה LC-MS.
3. חישוב החלק השבריר ( f _u ) oF התרופה במטריצה מדוללת באמצעות משוואה 1. חשבה את f _u במטריצה חייה באמצעות משוואה 2 (D = דילול פקטור של 10). ¹⁴
   
   
4. בדוק את ההתאוששות (מאזן מסה) של כל מתחם באמצעות משוואה 3 לזהות תרכובות עם יציבות / המטבוליזם / בעיות כריכה הלא ספציפיות.
   הערה: שחזור בדרך כלל נופל בין 70% ו 130%. ¹⁵
   

תוצאות

שימוש בפרוטוקול זה, בדקנו מאות תרכובות פיתוח התרופה שחפת עבור יעילות ניבאו שלהם חודר caseum. איור 1 מציג באופן ויזואלי את המושגים הבסיסיים של assay RED. קרום הדיאליזה של הוסיף RED מאפשר מולקולות קטנות מאוגדות לנטרל מן התורם גם למקלט היטב, ולבסוף השי?...

Discussion

נגעים וחללי נימקי ריאתי בחולים שנדבק בשחפת לכלול תת-אוכלוסיות של חיידקים שנמצאים סרבנים טיפול תרופתי. ליבות caseous של מבנים אלה הן בעיקר אחראיות מחסה persisters אלה בסביבה תאית. ¹⁶ נוחים הפצה של חומרים אנטי-בקטריאליים במיקומים מרוחקים אלה הוא האמין להיות גורם ח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White Rabbits	Covance	-
HN878 Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Animal Health	56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution	Virbac	710101
THP-1 monocytic cell line	ATCC	ATCC TIB-202
175 cm² TC-Treated Flask (T175)	Fisher Scientific	T-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamine	Fisher Scientific	MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated	Fisher Scientific	SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200 mM	Fisher Scientific	SH3003401
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented	Fisher Scientific	T-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Fisher Scientific	BP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Oleic acid	Fisher Scientific	ICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base Plate	Fisher Scientific	PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box	Fisher Scientific	PI-89809
Pierce RED insert removal tool	Fisher Scientific	89812
Adhesive plate seal	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)	Life Technologies	10010-049
DMSO	Sigma	472301
Acetonitrile	Sigma	34998
Methanol	Sigma	34860
Verapamil hydrochloride	Sigma	V4629
Diclofenac sodium salt	Sigma	93484
Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher Scientific	15-250-061
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-451
2010 Geno/Grinder	SPEX SamplePrep	2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads	Fisher Scientific	15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiator	JL Shepard	7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers	Fisher Scientific	22-600-100
Upright Light Microscope	Leica	DM1000
Binary Liquid Chromatography system	Agilent	1260	Multi-compenent
Mass spectrometer	AB Sciex	4000