A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות הגנטיקה והביולוגיה של המערכות קידמו את הבנתנו את הביולוגיה של טפילי המלריה ברמה המולקולרית. עם זאת, יעיל מלריה טפיל מטרות עבור החיסון ופיתוח כימותרפיה עדיין מוגבלים. הדבר נובע במידה ניכרת מחוסר הזמינות של הרלוונטיים והמעשיים במודלים של זיהום vivo למינים של הפלמודניום האנושי, בעיקר עבור p. falciparum ו p. vivax. לכן, מינים מלריה מכרסמים כבר בשימוש נרחב כמו חלופה מעשית במודלים vivo עבור חיסון נגד מלריה, סמים מיקוד, התגובה החיסונית, ולימודי אפיון פונקציונלי של שימור הגנים הפלסטיות. אכן, דגמי מלריה מכרסמים הוכיחו להיות יסולא בפז, במיוחד עבור חקר שידור יתושים וביולוגיה שלב הכבד, והיה חיוני למחקרים אימונולוגיים. עם זאת, ישנם אי-התאמות בשיטות המשמשות כדי להעריך את פנוטיפים של הטרנסגניים והפראי, מיני ומינית טפילים בשלב הדם. דוגמאות לסתירות אלה הן הבחירה של זיהום בתוך הצפק לעומת הדלקת פנים של מכרסמים עם טפילים בשלב הדם ואת ההערכה של הגבר להלקאה. בזאת, אנו פירוט שיטות ניסיוני סטנדרטית כדי להעריך את פנוטיפים של שלבים מיני ומינית דם בטפילים טרנסגניים ביטוי הכתב-גן או פראי סוג מלריה מכרסם טפיל מינים. כמו כן אנו מפרטים את השיטות כדי להעריך את פנוטיפים של מלריה טפיל שלבים נגד יתושים (gametes, ookinetes, oocysts, ו sporozoites) בתוך אנופלס וקטורים יתושים. שיטות אלה מפורטות ופשוטים כאן עבור זנים קטלניים ולא קטלניים של p. ברגניי ו p. yoelii אבל יכול להיות גם להחיל עם כמה התאמות p. שאבו ו p. ויניקיי מכרסם מיני מלריה.
טפילים מלריה לגרום למאות מיליוני דלקות מלריה בבני אדם ברחבי העולם, עם יותר מ 600,000 מקרי מוות מדי שנה1. זיהומים אנושיים נגרמים על ידי חמש מינים טפיל מלריה, כלומר p. falciparum, p. vivax, p. ovale, פ. מלאריאה, ו p.ה,. רוב מלריה קלינית נגרמת על ידי P. falciparum באפריקה שמדרום לסהרה1. נוסף מלריה אנושית טפיל מינים הגורמת morbidities נרחב ברחבי העולם מחוץ לאפריקה שמדרום לסהרה הוא P. vivax2. שלושת המינים האחרים מוגבלים יותר מבחינה גיאוגרפית וגורמים לדלקות מלריה שפירים, למעט הקטלניים הקטלנית3. אי-הזמינות של מודלים רלוונטיים ומעשיים שאינם אנושיים בvivo של זיהומים היתה תמיד ועדיין הוא מכשול חיסון נגד מלריה ופיתוח התרופה. מוקדם יותר תרופות מלריה פילוח מחקרים מטבולית סמכו בהרחבה על דגמי מלריה העופות כמו p. אבירים ו p. lophurae, הדבקת תרנגולות וברווזים, בהתאמה4. לאחר מכן, מינים מלריה מכרסמים הוכנסו בהדרגה חיסונים שונים ומיקוד הסמים מחקרים כמו במודלים vivo. במהלך השנים, עדויות של קווי הדמיון של הביולוגיה ואינטראקציות מארח-טפיל של שלבים מחזור החיים של מודלים מכרסמים מכרסם למינים מלריה בני אדם צברו.
בפרט, דגמי מלריה מכרסמים היו חשובים מאוד כדי לחקור ולאפיין את הביולוגיה של יתושים ושלבים טרום אריתרופויזיים5. עם זאת, ישנם ארבעה מינים מלריה מכרסמים (p. ברגניי, p. yoelii, p. שאבו, ו P. vinckei) כי יש תכונות ביולוגיות שונות, הבולטים ביותר שנמצאים בשלבי הדם6. מינים מלריה מכרסם שונים ב סינכגניות של שלבי הדם, איפה בשלבים דם של p. שאבו ו p. זנים ויניקאי הם בעיקר סינכרוני, בעוד שלבי הדם של p. ברגניי ו p. yoelii אינם6 , 7. עוד הבדל הבולט הוא הסיווג העצמי של שלבי הדם המתרחשת בזנים מסוימים (למשל, p. yoelii 17x-NL, p. ברגניי NK65, ו p. vinckei lentum), בעוד זיהום הדם של אחרים זנים של אותו מין יכול להיות קטלני אם לא מטופל (p. yoelii 17x-L, p. ברגניי אנקה, ו P. שאבו כמו). יתר על כן, p. yoelii 17x-NL המתח ו p ברגמיי מאמץ מאוד לפלוש לעבר רטיקולולוציטים8,9,10,11, למרות תכונות אלה של P. yoelii ו P. בוני זנים הם לא דרישה הצמיחה קפדנית12,13,14. לכן, העכברים מטופלים עם פנילהיהידראזין לפני זיהום עם שלבי הדם של טפילים אלה כדי להגדיל את הקיפוד ואת gametocytemia הצורך לזיהום יתוש עבור הזן p. ברגאיי אנקה עבור p. yoelii 17 x-NL15,16,17,18,19.
הבדלים בשלבי פיתוח של יתושים קיימים גם בין מינים שונים מלריה מכרסמים, הבולטים ביותר להיות הטמפרטורה ואת הזמן הנדרש עבור פיתוח בשלבים מיטביים יתושים ואת אורך sporozoite5,6, . עשריםדולר בשלבים טרום אריתרופויוטיים של מיני מלריה מכרסמים, ההבדלים כוללים את המינים מכרסם ומסננים כי הם רגישים ביותר מדבקת sporozoite זיהומיות, מספר הספוראוזוטים הדרושים לחיסון למאמץ מכרסם רגיש, ה סוגי תא ממגלית הדרושים לפיתוח בכבד מחוץ לתחום, והזמן להשלמת התפתחות הכבד בשלב5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
למרות היכולות הללו, טפילים מלריה מכרסמים היו מודלים חיוביות מוקדם על היישום של גישות גנטיות הפוכה, כי הם היו פחות זמן-ו לצרוך משאבים עם הסתברות גבוהה של הצלחה31. למעשה, דגמי מלריה מכרסמים היו הדגמים הטובים ביותר, ובמקרים רבים את המודלים היחידים, זמין במשך שנים רבות כדי לאפיין את הגנים באופן פונקציונלי הביע בשלבים יתושים ובכבד.
לאור הפופולריות ואת היכולת ההפוכה של גישות גנטיות הפוכה במודלים של מלריה מכרסמים, מספר מתודולוגיות שונות השתמשו כדי לנתח את פנוטיפים של שלבים מחזור החיים טפיל הטרנסגניים, במיוחד שלבי הדם. עם זאת, חלק ממתודולוגיות אלה אינן עקביות; למשל, השוואת זיהומים של טפילים בשלב הדם בעקבות הזרקת IP (אשר עלולים להיות מנוקז לבלוטות הלימפה הצפק, משם, יכול להיכנס למחזור הדם; לכן, טפילים מוזרק לא לסיים באופן שווה בזרם הדם) , השוואת העברת היתוש של שיבוטים עם מספר שונה של העברות הבמה דם סדרתי או מספר G (אשר יכול להשפיע על gametocytogenesis32,33), או השוואת טפילים טרנסגניים ישירות לסוג פראי נאיבי (WT) טפילים שמעולם לא נחשפו לאלקטרופורציה ולבחירת סמים חיוביים ולהערכות השונות הבלתי מתוקננת של ההלקאה הגברית. לכן, זה חיוני כדי לתקנן פרוטוקולים כי הם פשוט לעקוב אחר ניתוח פנוטיפ של כל סוג של הטרנסגניים או הטפילים מכרסם מכרסמים בדם ביתוש כדי להתאים את היכולות הביולוגי של מלריה מכרסמים מין טפיל.
בזאת, אנו מדווחים על פרוטוקול ניסיוני מפורט מפורטים לניתוח פנוטיפ של דם ויתושים בשלבים מחזור החיים של הטרנסגניים או מסוג פראי p. yoelii ו p. ברגניי טפילים. פרוטוקולים אלה חלים גם על p. שאבו ו p. ויניקאי טפילים.
כל ניסויי בעלי החיים המתוארים כאן נערכו על פי הפרוטוקולים המאושרים של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טוליין וועדת האתיקה של בעלי החיים באוניברסיטת בזועלם. כל הפרוטוקולים הניסיוניים האחרים והשימוש ב-DNA רקומביננטי נערכו על פי הפרוטוקולים המאושרים של ועדת Biosafety טיחות מוסדית (IBC) של אוניברסיטת טוליין.
1. זיהום של עכברים עם דם בשלב טפילים עבור Parasitemia ניתוח וזיהום יתוש Assays
2. קביעת העומס בשלב הדם הטפיל עבור שלבים מיניים ומין
הערה: בסעיף זה, הערכה סטנדרטית פנוטימית שיטות של מלריה טפילים שלבים מפורטים. שיטות אלה שימושיות בהערכת מלריה או מועמדים לחיסונים או אפילו הסתרה גנטית על פיתוח שלבים מיניים ומינית באותם עכברים ניסיוניים. של הערה, p. שאבו ו p. vinckei הם גם אפשרויות הגיוניות מאוד חשוב חלופה עבור סוגים אלה של assays במיוחד בהקרנה סמים.
3. בידוד ועיבוד של דם-טפילים הבמה של אריתרופוציטים מזוהם הכנה מניות קפוא
4. דלקת יתוש באספלי
הערה: היתוש הוא המארח העיקרי של טפילי מלריה שבו הרבייה המינית מתרחשת. הזיהום של עכברים כדי לשדר טפילים מלריה ליתושים מתנהל על ידי הזרקת IV של לפחות 1,000,000 בשלבים דם, ואחריו האכלה עכבר נגוע (מכל גנוטיפ המציג את שיעור ההלקאה הגברי הגבוה ביותר) כדי ל אנופלס יתושים בכלוב ביום 3 לאחר העכבר זיהום. הזרקת IV עם 1,000,000 דם-בשלב טפילים בעכברים מטופלים פנילהיהידראזין יבטיחו התפתחות של זכר ונקבה gametocyte בקצב מהיר וגבוה יותר. יתושים נגועים p. yoelii ו -p. ברגניי מודבטים ב -24 ° c ו 20-21 ° c, בהתאמה, כדי לאפשר את הטוב ביותר האפשרי בשלבים יתוש פיתוח6.
ההצלחה של החלת כלים גנטיים הפוכה וטכניקות לטפילים מלריה יש מהפכה בתחום של מחקר מלריה, עם היכולת להוסיף, למחוק, או לשנות מגזרים גנומית ספציפיים של כמה מינים פלמודניום 39. חשוב מכך, גנומית מקבל לוויתור זוהו והשתמשו בהצלחה כדי להחדיר סמנים חלבון הפלואורסצנט...
למרות הדמיון בביולוגיה הכללית של מחזורי החיים שלהם זה של טפילים מלריה אנושית, מודלים מלריה העכבר גם יש הרבה וני מינים הפלסטיניום האנושי כי היה להגביל את השימוש שלהם אמין במודלים vivo . למשל, למעט טפילים חיים החליש כמו חיסונים, כל לימודי החיסונים עם יחידת ו-DNA וחיסונים אחרים נתן תוצא?...
. למחברים אין מה לגלות
אחמד אלי נתמך על ידי מימון וכלו באוניברסיטת משרד התחבורה התורכי 2015BSV036, ועל ידי מימון שסופקו על ידי בית הספר לבריאות של טוליין של בריאות הציבור ורפואה טרופית, ועל ידי מימון NIH-NIAID עבור R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
RPMI | Gibco | 22400105 | |
DMEM | Gibco | 11995065 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved