גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Summary

בשיטה זו, תאי השריר העיקריים של האדם מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים ושיעורי ספיגה של גלוקוז נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות [ ³ H] 2-deoxy-D גלוקוז.

Abstract

שריר השלד הוא הפיקדון הגדול ביותר גלוקוז ביונקים תורמת במידה רבה גלוקוז הומיאוסטזיס. הערכה של רגישות לאינסולין של תאי שריר היא רלוונטית משמעותית עבור כל המחקרים המוקדש לחקר מטבוליזם גלוקוז בשרירים ואפיון שינויים מטבוליים. בתאי שריר, חלבונים מסוג 4 גלוקוז מסוג 4 (GLUT4) מתורגמים לממברנת הפלסמה בתגובה לאינסולין, ובכך מאפשרים כניסה מסיבית של גלוקוז לתא. היכולת של תאי שריר להגיב לאינסולין על ידי הגדלת שיעור ספיגת הגלוקוז הוא אחד readouts תקן לכמת רגישות תאי שריר לאינסולין. מיוטובין ראשוני האדם הם מתאימים במודל חוץ גופית , כמו התאים לשמור על תכונות רבות של פנוטיפ התורם, כולל רגישות לאינסולין. מודל זה במבחנה מתאים גם למבחן של כל תרכובות שעלולות להשפיע על היענות האינסולין. מדידות של שיעור ספיגת הגלוקוז במיטובים מובחנים משקפיםרגישות לאינסולין.

בשיטה זו, תאי שריר ראשוניים אנושיים מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים, ושיעורי ספיגה של גלוקוז עם גירוי אינסולין ובלי נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת שיעורי העברה גלוקטיבית פסיבית פעילה באמצעות [ ³ H] 2-deoxy-D-Glucose [ ³ H] 2dG). שיטות חישוב ניתנים לכמת פעיל basal ו אינסולין מגורה שיעורי, כמו גם גירוי לקפל.

Introduction

שריר השלד הוא הפיקדון הגדול ביותר גלוקוז ביונקים תורמת במידה רבה גלוקוז הומיאוסטזיס. זו רקמת תגובה אינסולין הוא האתר העיקרי של ספיגה הגלוקוז כי מופעלת על ידי גירוי אינסולין ¹ .

בסוכרת מסוג 2, עמידות לאינסולין נצפתה במספר רקמות, כולל שריר השלד, ומובילה לריכוז גבוה יותר של גלוקוז בדם. לכן, יש חשיבות רבה לקביעת רמת הרגישות לאינסולין של רקמה זו ותאייה, בין אם המטרה היא לאפיין פגם בנושא או להעריך את היעילות של טיפול המיועד לשפר אותו. בבעלי חיים אנושיים או בבעלי חיים, טכניקת הזהב סטנדרטית להעריך רגישות לאינסולין הוא מהדק hyperinsulinemic-euglycemic. הוצג על ידי DeFronzo בשנת 1979 ² ו שונה מאז ^{3 , 4} אז, השיטה מאפשרת לכמת את כל הגוףNd רקמות התגובה האינסולין נמדד כמו שיעור גלוקוז להיות perfused תחת גירוי אינסולין לשמור על ריכוז גלוקוז בדם רגיל.

בדיקת רגישות לאינסולין יכולה להתבצע גם ברמת התא באמצעות מודלים של שריר במבחנה , ומדידת שיעורי ספיגת הגלוקוז נותרת כלי יעיל ואמין לכמת התגובה הביולוגית של התא לגירוי אינסולין ^{5 , 6 , 7} . ואכן, מדידת ספיגת הגלוקוז מכמתת את התגובה הביולוגית של התא לגירוי אינסולין, מהכריכה של אינסולין לקולטן שלה לטרנסלוקציה של שלפוחית ​​GLUT4 מועשר, כולל איתות תאיים ומפלצי זרחון ⁸ .

זה עניין מרכזי עם דגימות אנושיות, כמו myotubes מובחן לשמור על תכונות רבות של פנוטיפ התורם, כולל trueat מטבוליתIes והפרעות שנצפו בחולה ^{9 , 10 , 11 , 12} . המיאוטובס מציג קווי דמיון מבניים, מטבוליים ופנוטיפיים לשרירי השלד ^{13 , 14} , כולל הביטוי של מובילי גלוקוז ¹⁵ ומנגנון האינסולין הסלולרי ¹⁶ . לפיכך, מדידה של ספיגה הגלוקוז ב myotubes העיקרי הוא רלוונטי לאפיון פנוטיפ השריר של התורם, או לחקור את ההשפעה של התערבות (סמים, תזונה, או פעילות גופנית) על רגישות האינסולין בתא השריר.

המדידה של ספיגה גלוקוז על המיאוביים תרבותיים גם הוא כלי אמין בעת ​​ביצוע ניסויים לשנות רגישות לאינסולין ^{17 , 18} . במבחנה מתאים למבחן של כל תרכובות שיכולות לשפר את היענות האינסולין, או למנוע או לבטל את התנגדות האינסולין שנרכשה או המושרה ^{, 19 , 20 , 21 , 22 , 23} .

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתרבות להבדיל מיוטוב האדם למדוד את שיעורי ספיגת גלוקוז התא. השיטה מתאימה לכל מקור של תאים מבשר שרירים אנושיים, בין אם הם באים מתוך ההכנות במעבדה, שיתוף פעולה או ספקים זמינים מסחרית. שורות תאים שרירים מונצחים, כמו C2C12 ו- L6, בהתאמה ממקור עכבר ומ חולדה, יכולים לשמש גם למדידת ספיגה של גלוקוז עם פרוטוקול זה.

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות radiolabeled [ ³ H] 2dG. Tהוא משתמש אנלוגי גלוקוז שכותרתו מאפשר קביעת מדויקת של כניסת גלוקוז עם חומר מופחת החל, מצב שכיח בעת עבודה עם תאים ראשוניים. מולקולה גלוקוז שונה אינו מסוגל להיכנס נתיבים מטבוליים, ולכן, מצטבר בתוך התא, המאפשר כימות אמין באמצעות רדיואקטיביות התא הכולל. תנאי הניסוי כוללים את השימוש של מעכב גלוקוז תחבורה (cytochalasin B), ומדידות מבוצעות עם וללא אינסולין. שילוב זה מאפשר לקבוע את ערכי הכניסה הפעילים לגלוקוז, כמו גם את חישוב השינוי לקפל עבור אינדקס התגובה לאינסולין. השיטה מוצגת עם מנה אחת של אינסולין במהלך זמן הדגירה יחיד, אבל הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה עבור התגובה מינון או קורס זמן ניסויים ¹² .

Protocol

1. הכנת תרבות תאים מדיה ופתרונות

1. הכנת מדיה תרבותית
   1. הכן בינוני שגשוג על ידי תוספת של F-10 בינוני עם גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / מ"ל ​​סופי), 2% עגל סרום בסרום (FCS) ו 2% תחליף בסרום.
   2. הכן בינוני בידול (DM) על ידי הוספת Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) עם גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / מ"ל ​​סופי), ו FCS 2%.
2. הכנת פתרונות ספיגת גלוקוז
   זהירות: טיפול בחומרים רדיואקטיביים מותר רק באזור מוגבל ומבוקר על-ידי כוח מורשה. יש לטפל בחומר ובפסולת בהתאם לנהלים, להנחיות ולחקיקה המקומית.
   1. כדי להכין X-DPBS של X-DBSBCo שנאגרו מלוחים (X-DPBS), לעשות פתרון של DPBS המכיל 0.2% (w / v) (ריכוז סופי)(BSA). סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C.
   2. כדי להכין קר 2-deoxy-D- גלוקוז (2dG) פתרון, לשקול 16.4 מ"ג של 2dG ו solubilize ב 10 מ"ל מים מזוקקים כדי לקבל פתרון 10 מ"מ. חנות ב 4 ° C.
   3. הוסף 600 μL של 2dG קר 6 μL של radiolabeled [ ³ H] 2dG ל 5400 μL של X-DPBS כדי להשיג את הפתרון 2dG radiolabeled (2dG *).
      הערה: הריכוז הסופי הוא 1 מ"מ 2 מ"מ ו תיוג הוא 1 μCi / מ"ל.
      1. להפריש 20 aliquot μL (TC20) של פתרון 2dG radiolabeled *.
3. הכנת תערובות הדגירה
   1. עבור תערובת cytochalasin B, להוסיף 2 μL של 20 מ"מ cytochalasin B ל 2 מ"ל של פתרון 2dG radiolabeled *.
      הערה: פתרון מלאי של cytochalasin B הוא ב 10 מ"ג / מ"ל ​​ב dimethyl sulfoxide (DMSO).
   2. עבור תערובת DMSO, להוסיף 4 μL של DMSO ל 4 מ"ל הנותרים של הפתרון 2dG radiolabeled *.

2. התרבות של תאי שריר ראשוניים של האדם

1. זריעה של 6-צלחות היטב עם תאי שריר אנושיים
   הערה: השתמש ב-בית (ראה התייחסות ²⁴ לפרטים) או בתאים מסחריים שרירים זמינים מסחרית מ בקבוקון קפוא (המכיל 250,000 תאים). ההליך הבא ניתנת עבור 250,000 תאים על מנת להשיג אחד 6-היטב צלחת הכרחי למדידת ספיגת גלוקוז במצב אחד.
   1. להפשיר במהירות בקבוקונים קפואים של הבית ²⁴ או הכנות מסחריות של תאי שריר האדם בתאים מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) עד רק גוש קרח קטן נשאר הבקבוקון.
   2. יוצקים ישירות לתוך צינור פלסטיק 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של חימם מראש (37 מעלות צלזיוס) PM.
   3. צנטריפוגה 5 דקות ב 500 xg וזורקים supernatant.
   4. בעדינות resuspend גלולה התא עם 18 מ"ל של מראש חימם PM (להשיג 42,000 תאים לכל3 מ"ל של המדיום). מפיצים 3 מ"ל בכל היטב של צלחת 6-היטב (9.6 ס"מ ² ).
      הערה: שש הבארות הבודדות של צלחת נדרשות לבצע מדידה כפולה של ספיגה של גלוקוז לתנאים הבאים: מעכבי תחבורה פסיבית (בארות 1 ו -2), קצב בסיסי (בארות 3 ו -4) ושיעור מגורה לאינסולין (בארות 5 ו -5) 6). חזור כמו צלחות 6-היטב כמו טיפולים נפרדים נדרשים.
   5. דגירה בתנאי תרבות רגילה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ) עד תאים להגיע מפגש 90%.
      הערה: שלב זה לוקח בין 48 - 72 שעות בהתאם אצווה התא. אל תשנה מדיום במהלך שלב זה.
2. דיפרנציאציה של תאי שריר
   1. הסר PM (לאחר 48-72 שעות) ולהחליף עם מראש חימם DM (3 מ"ל לכל טוב). לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ .
      הערה: Differentiation לוקח חמישה ימים כדי להגיע למצב יציב שבו תאים מיושרים polynucleated. בדרך כלל, הראשיMyotubes הם מתורבת בינוני 1 גרם / גלוקוז L. לכן, כדי למנוע דלדול הגלוקוז במהלך התרבות, למלא את הצלחת עם בינוני 3 מ"ל על מנת להבטיח כי מספיק גלוקוז המצע זמין עבור התאים בכל עת.
   2. החלף מדיום DM מדי יומיים.
      הערה: מנקודה זו, המוטובוסים יציבים עד 7 ימים ללא כל שינוי משמעותי מדידת ספיגת גלוקוז יכול להתבצע בכל עת.
3. טיפול בתאי שריר (אופציונלי)
   הערה: ניתן לטפל בטיפולי מיוטובס ראשוניים במשך מספר ימים כדי לגרום לשינוי (בדיקת סמים, מעכבים / מפעילי נתיב איתות וכו ' ) לפני גירוי אינסולין ומדידות ספיגה של גלוקוז. תאי שריר יכולים להיות מוגשים לכל טיפול שעשוי להשפיע על הרגישות לאינסולין, ומדידת ספיגת הגלוקוז תכשיר את ההשפעה הזו. לדוגמה, הדגירה של תאי שריר עם חומצה שומן רווי palmitate מקדם עמידות לאינסולין, תאים להציג מופחת אניNsulin מגורה ספיגת גלוקוז.
   1. הכן 12 מ"ל של DM בתוספת 10% BSA (חומצת שומן חינם) ו 0.5 מ"ל palmitate (PALM). הכן 12 מ"ל של DM בתוספת 10% BSA (חומצת שומן חינם) בלבד.
   2. הכינו שתי צלחות 6-היטב עם myotubes העיקרי האנושי, תרבות אותם כפי שמתואר בסעיפים 2.1 ו 2.2 (עם 5 ימים של הבחנה).
   3. ביום 5, לשטוף היטב עם 2 מ"ל של PBS. כדי צלחת אחת, להוסיף 2 מ"ל של DM המכיל PALM. כדי צלחת אחרת להוסיף 2 מ"ל של BSA רק המכיל DM.
   4. לדגור על 48 שעות ב 37 ° C, 5% CO ₂ .

3. גירוי אינסולין

1. לשטוף תאים שריר מובחנים פעמיים עם 2 מ"ל PBS.
2. הסר PBS בזהירות דגירה עם 3 מ"ל של DM ללא FCS במשך 3 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ) עבור דלדול בסרום.
3. החלף את התקשורת בכל הבארות עם 3 מ"ל של DM ללא FCS. הוסף 100 ננומטר אינסולין לבארות 5 ו 6.
4. דגירה התרבות מיוטוב האדם עבור1 שעות (37 ° C, 5% CO ₂ ).

4. ספיגת גלוקוז

1. לאחר 1 שעות של גירוי אינסולין, לשטוף בארות פעמיים עם X-DPBS (1 מ"ל לכל לשטוף).
2. הוסף 1 מ"ל של תערובת cytochalasin B לארות 1 ו -2, ו 1 מ"ל של תערובת DMSO לבארות 3 - 6. דגירה במשך 15 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ). בסוף הדגירה, מיד למקם את הצלחת על הקרח.

5. תא תמוגה

1. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של קרח קר PBS.
2. Lyse התאים היטב כל עם 600 μL של 50 מ"מ NaOH. דגירה על הקרח במשך 5 דקות ומערבבים בעדינות עם סיבוב אוראלי אטי.
   הערה: אם lysate הוא צמיג מדי, לדלל עם עד 1.5 מ"ל NaOH.
3. באמצעות פיפטה, resuspend ולאסוף lysate התא.

6. קביעת גלוקוז Radiolabeled

1. שים 400 μL של lysate התא בכל נוזל נצנץ ספירת בקבוקון. הכן בקבוקון שליטה שלילית עם 400ΜL של 50 מ"מ NaOH, בקבוקון שליטה חיובית עם 20 μL של TC20 (משלב 1.2.3.1).
2. הוסף 4 מ"ל של תמיסת נצנץ נוזלי לכל בקבוקון. סגור את המכסה ומערבבים כל בקבוקון ביסודיות (1-2 s).
3. מכניסים לכל בקבוקון נוזל נצנץ ומודדים את הרדיואקטיביות בהתאם להוראות היצרן. שיא סעיפים לדקה (CPM) עבור כל בקבוקון scintillation במשך 10 דקות.
   הערה: CPM = "התפרקות לדקה" x "ספירת היעילות".

7. שיעור ספיגת גלוקוז

1. השתמש lysate הנותרים (200 μL, משלב 5.2) כדי למדוד את ריכוז החלבון. לקבוע את ריכוז החלבון של lysate תא באמצעות ברדפורד ²⁵ או שיטה המקבילה. חישוב כמות החלבון הכולל (Q) במ"ג עבור כל טוב.
2. כדי לקבל TC1 (הערך עבור 1 μL של 2dG radiolabeled *), מחלקים את הערך לאלף הופעות של TC20 על ידי 20.
3. עבור כל בקבוקון, לחשב tהוא שיעור ספיגת גלוקוז כדלקמן:
   
   הערה: R נמדד ב- pmol / mg / min. ממוצע של R עבור בארות 1 - 2 נותן קצב תחבורה פסיבי, R _p . ממוצע של R עבור בארות 3-4 נותן קצב התחבורה הכולל הבסיסי, R _BT . ממוצע של R עבור בארות 5-6 נותן אינסולין מגורה שיעור התחבורה הכולל, R _זה .
   1. חישוב קצב התחבורה הבסיסי הפעיל (R _ba ) כדלקמן:
      
   2. חישוב האינסולין מגורה המפעילים שיעור תעבורה פעיל (R _ia ) כדלקמן:
      
      הערה: בתאי התגובה האינסולין כמו myotubes, שיעורי ספיגת גלוקוז מיוצגים בדרך כלל על ידי שלושה ערכים: R _Ba , R _ia , ואת קיפול אינסולין גירוי כמו _RIA / R _Ba .

תוצאות

ביום 3, myoblasts להגיע מפגש ( איור 1 א ). את myoblasts בשלב זה הם בדרך כלל mononucleated. בינוני השתנה ביום 8, הבחנה הושלמה ( איור 1 ב ) (פרוטוקול סעיף 2). לאחר 5 ימים של הבחנה, מיוטובים מיושרים ו polynucleated בדרך כלל. מיוטובים ראשוניים של האדם היו...

Discussion

ספיגת גלוקוז היא מדידה ביולוגית מפתח לבדיקת actators או מעכבי על תרבות התא וכיצד הם משפיעים על השימוש בגלוקוז, ואת היכולת של התא להגיב לאינסולין. השיטה המתוארת כאן הוכחה כמהירה ואמינה ונמצאה בשימוש נרחב במחקרים רבים באמצעות מיוטובים ראשוניים של חולים בריאים ו / או מט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human primary muscle cell	In house preparation from human skeletal muscle biopsies	In house preparation from human skeletal muscle biopsies	If not available, use commercial source
Human primary muscle cell	Promocell	C-12530	Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate	Corning	356400	BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10	Dutscher	L0145-500	1 g/L glucose
Glutamine	Dutscher	X0551-100
penicilin/streptomycin 100x	Thermo fisher scientific	15140122
Serum substitute UltroserG	Pall France	15950.017	serum substitute in text
DMEM low glucose	Dutscher	L0064-500	1 g/L glucose
Fetal Calf Serum	Eurobio	CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Dutscher	L0625-500	Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278
2-deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D6134
Albumin bovine	euromedex	04-100-812-E
fatty acid-free BSA	Roche	10,775,835,001
palmitate	Sigma-Aldrich	P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]	PerkinElmer	NET328A001MC	Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL	PerkinElmer	6000192
ultima gold MW CA	PerkinElmer	6013159	scintillation liquid
bêta counter	PerkinElmer	2900TR