JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר ראוי Vibrio cholerae טכניקות תחזוקה בנוסף סדרה של מבחני ביוכימי, מנוצל קולקטיבית עבור הבחנה מהירה ואמינה בין קליני וסביבתי V. ביו-טיפוסים של כולרה במעבדה.

Abstract

החיידק הגרימי שלילי של גראם הוא Vibrio cholerae הוא הסוכן האטיולוגי של כולרה זיהומית זיהומית. בשל השכיחות והחומרה הגלובלית של המחלה, V. Cholerae נחקרה בהרחבה הן בהגדרות סביבתיות והן במעבדה, המחייבת תחזוקה נאותה וטכניקות טיפוח. קלאסי ואל טור הם שני ביו-טיפוסים עיקריים המרכיבים את ה- V. Cholerae O1 serogroup, שכל אחד מהם מציג מאפיינים גנוטיפיים ופנוטיפיים ייחודיים המספקים מנגנונים אמינים לאפיון ביוטיפ, ודורשים ארסיות מובהקות הגורמות לתרבות. ללא קשר לביוטיפ של זן סיבתי עבור כל זיהום או פרוץ מסוים, הטיפול הסטנדרטי עבור המחלה כולל טיפול rehydration בתוספת משטר של אנטיביוטיקה. עם זאת, סיווג ביוטיפ עשוי להיות נחוץ ללימודי מעבדה ועלולות להיות השפעות רחבות יותר בתחום הביו-רפואי.בתחילת שנות האלפיים, זוהו הבדידות הקליניות, אשר הציגו תכונות גנוטיפיות ופנוטיפיות הן מהביוטיקים הקלאסיים והן מהאל-טור. ההיברידיות שזוהו לאחרונה, המכונה אל וריאציות של אל-טור, גרמו לקליניקה ולסביבה לזהות בידוד ביו-טיפוסי כדי להיות מורכבות יותר מאשר בפרוטוקולי זיהוי מסורתיים בודדים. בנוסף לתיאור V. Cholerae תחזוקה כללית ו culturing טכניקות, כתב היד הזה מתאר סדרה של גנים ספציפיים ( ctxB ו tcpA ) מסכי PCR מבוססי PCR ו מבחנים פנוטיפי (התנגדות polyyxin B, מטבוליזם ציטראט, פעילות proteolytic, פעילות hemolytic, תנועה, ומטבוליזם גלוקוז באמצעות Voges- Assay Proskauer) השתמשו באופן קולקטיבי לאפיין ו / או להבדיל בין ביוטוסים קלאסיים לאל טור. יחד, מבחני אלה מספקים גישה שיטתית יעילה לשמש חלופה, או בנוסף, יקר, ניסויים עתירי עבודה ב characterizaשל V. Cholerae קליני (וסביבתי) מבודד.

Introduction

כולרה היא מחלה של המעי הדק הרחוק שנגרם על ידי הצריכה של מזון מזוהם או מים המכילים את החיידק הגראמי שלילי חיידקים Vibrio cholerae. תסמינים של כולרה כוללים הקאות ושילשול מימי בלתי נשלט, מה שמוביל להתייבשות קשה, אשר אם לא מטופלים כראוי, יביא למוות. אשר Cholerae יכול להיות מחולק ליותר מ 200 serogroups מבוסס על המבנה של משטח התא lipopolysaccharide O- אנטיגן. עם זאת, רק 2 serogroups, O1 ו O139, הראו מגיפה או פוטנציאל מגיפה 1 , 2 . יתר על כן, serogroup O139 היה מבודד בעיקר בדרום מזרח אסיה 3 , 4 , בעוד serogroup O1 מופץ ברחבי העולם. יתר על כן, ניתן לחלק את הסרוגרופוס O1 לשני ביו-טיפוסים עיקריים: קלאסית ואל טור. הביוטיפ הקלאסי היה אחראי על מגיפת הכולרה הראשונהS בין 1817 ו 1923. המגיפה השביעית המתמשכת היא תוצאה של ביוטיפ אל טור, אשר גלשו באופן גלובלי את הביוטיפ הקלאסי בסביבה 5 , 6 , 7 . לאחרונה נוצרו זנים המכילים מאפיינים ייחודיים של ביו-טיפוסים קלאסיים ואל-טוריים 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 ומאז נקראו אל וריאנטים של אל טור 13 , 17 . כמה גרסאות של אל-טור הראו יכולות ארסיות גבוהות עם התקדמות מחלה מהירה וחמורה יותר ממה שנצפתה קודם לכן, והדגישהצורך בגישה מקיפה יותר לזיהוי סוכן ומניעת מחלות וטיפול 8 , 9 , 18 . בעוד הזיהוי של ביו-טיב אינו מכתיב מיד טיפול, התקדמות נוספת בפיתוח החיסונים ובסוכני הטיפול העתידיים עשויה להפיק תועלת מהבחנה ביו-טייתית.

הסדרה הראשונה של הפרוטוקולים המפורטים כאן תאפשר לחוקרים לשמור כראוי V. Cholerae זנים במעבדה הגדרה. עקביות וניתוח שלאחר מכן דורש הכנת מלאי וצמיחה של מבודדים, אשר אינו תלוי ביו-טיב. עם זאת, כדי לגרום באופן אופטימלי ביטוי גנים ארסיות, ביוטיפ עצמאית טכניקות culturing ספציפיים נדרשים 19 . בנוסף, הכנה לבדיקות גנטיות וביוכימיות שונות מתוארים בכתב יד זה.

כולרה רעלן (CT) ואת רעלן שיתוף reגלוטן gulated (TCP) הם שני הגורמים העיקריים ארסיות נשלט על ידי הרגולטור הראשי ToxT בשני biotypes של V. Cholerae O1 serogroup 20 . CT הוא רעלן דו-חמצני המורכב מחמש CtxB תת יחידות המקיפות יחידה אחת של CtxA, ואחראית על אובדן אלקטרוליטים מהיר הקשור לכולרה. TCP הוא סוג IV פילוס מקודדים על ידי tcp operon ( tcpABqCRDSTEF ), והוא מעורב בהתקשרות ו קולוניזציה של המעי הדק הרחוק. TcpA הוא הגן הראשון של אופרון tcp אשר מקודד את יחידות יחידת הפרט Pilin חיוני לבנייה של הפילוס 8 . רצף הגן עבור ctxA נשמר לחלוטין בין ביוטיקים קלאסיים אל Tor, בעוד ctxB ו tcpA נבדלים על פני שני biotypes אבל נשמרים בתוך כל ביוטיפ 8 . CtxB נשמר לחלוטין בין biotypes למעט שתי posi בסיסTions (115 ו 203). ב biotype אל Tor, thymine מתגורר בנקודות הבסיס 115 ו 203, בעוד הביוטיפ הקלאסי מכיל ציטוזין בבסיסים אלה. Tcpa נשמר לחלוטין בתוך כל ביוטיפ, אך נבדלים בסיסים מרובים בין biotypes. הבדלים גנטיים אלה משמשים כסימני זיהוי ביו-טיים ראשוניים, ולאחר סידור תגובת תגובת שרשרת הפולימרז (PCR), כולל אלה, ניתן לבודד רצפים מבודדים עם O395 או WT El N1696 הקלאסית מסוג Wild-type כדי לקבוע את הרקע הביוטיפי של CT ו- TCP, בהתאמה, ב V. cholerae נתון לבודד.

פרוטוקולים רבים פותחו על מנת לאפיין את ההבחנות הפנוטיפיות בין הביוטיקים הקלאסיים לאל טור , 21 , 22 , 23 . Polymyxin B הוא אנטיביוטיקה פפטיד כי compromises את יושרה של קרום התא החיצוני ב- Gram שלילי bacTeria, ואת התנגדות polyixxin B יכול להיות דמיינו דרך assay התנגדות polymyxin B 21 . ציטרט הוא המצע העיקרי של מחזור של Kreb, ואת היכולת metabolize ציטרט כמקור פחמן יחיד ניתן לקבוע באמצעות assay מטבוליזם ציטראט 22 . HapR מקודד הרגולטור העולמי ו הרגולטור חישה המניין קוורום ב V. cholerae, HapR, אשר נקשר לאזורים שונים האמרגן מסדיר ביטוי הגן האופרה 24 . כמה זנים פתוגניים של V. cholerae יש באופן טבעי מוטציה משמרת מסגרת בגן hapR שגרם זה צפיפות תלויה תקנה של ביטוי גנים ארסיות לאיבוד 24 , 25 . מדידת פעילות פרוטאז HAPR-regulated באמצעות מדיה אגר חלב מאפשר החוקר כדי לזהות אם לבודד מסוים מכיל HAPR תפקודית 23 . הבדיקות המוליזה של המעי הגס על יכולתו של מתח להפריש אנזימים hemolytic כי lyse תאי דם אדומים; את מידת המוליזה יכול להיות דמיינו על צלחות אגר דם 23 . תנועתיות קשורה לעיתים קרובות עם ארסיות V. cholerae וניתן לנתח באמצעות לוחות אגר התנועה 23 . מבחני ה- Voges-Proskauer בודקים את יכולתו של זן להסיס את הגלוקוז כמקור פחמן יחיד ומייצרים את התוצר האסייתי 21 . עם הופעת גרסאות אל Tor, קשה לחזות את התוצאות של assay פנוטיפי נתון ללא בדיקות genotypic נרחב, ולפני deducing את הרקע של ביוטייפ של V. Cholerae מבודד, מומלץ לבצע את הרכבה זו של מבחני 23 ולהשוות את התוצאות זנים התייחסות כמו בטבלה 2 .

כאן, יש לנו סדרה מתקדמת של פרוטוקולים, באופן קולקטיבי ניצול foreeeהבחינו genotypic ו מבחני פנוטיפי לגישה מקיפה יותר לאפיון V. ביוטכנולוגי כולרה . יתר על כן, יש לנו תיאר את ההבחנה גנוטיפי פנוטיפי של V ידוע. Cholerae אל Tor וריאנטים (MQ1795 ו BAA-2163), בהשוואה זנים התייחסות ביוטיפ נפוץ (WT קלאסי O395, WT אל Tor C6706, ו ​​WT אל Tor N16961, טבלה 1 ). הופעתה של גרסאות אל Tor הציגה אתגרים האמינות של המועסקים בעבר פרוטוקול יחיד אפיון ביו-טיוב אפיון; עם זאת, זה מספר רב של מערכת זיהוי assay יאפשר אפיון אמין יותר של קליני וסביבתי V. כולסטרס מבודד.

Protocol

הערה: שיקולי זמן עבור כל assay חייב להיעשות כמו ההכנות התקשורת הפרט דורשים פעמים שונות. לדוגמה, מוצק התקשורת צלחת אגר צריך להיות מותר מספיק מגניב ויבש (1-2 ימים). שיקולי זמן נוספים ( כלומר מושבה אחת וצמיחה תרבותית בין לילה) מפורטים תחת כל פרוטוקול ומצויים בטבלה 2 .

1. הכנת מדיה

  1. 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS)
    1. לשקול 4.0 גרם NaCl, 0.1 גרם KCl, 0.72 גרם Na 2 HPO 4 , ו 0.12 גרם KH 2 PO 4 . שלב את המרכיבים של בקבוק 1 L Erlenmeyer, להתאים את עוצמת הקול ל 500 מ"ל עם מים deionized, להתאים את ה- pH 7.2 באמצעות מד pH והוספת drop drop HCL לפתרון, החיטוי או לסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. 1x PBS ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.
      זהירות: HCl היא חומצה מרוכזת ויש לטפל בה בהתאםלתקנות מוסדיות, מקומיות, מדינה ופדרליות. לקבלת הנחיות טיפול מתאימות, עיין בגיליון נתוני הבטיחות שמספק היצרן.
  2. לוריא-ברטאני (LB)
    1. שוקל 5.0 גרם טריפטון, 2.5 גרם שמרים לחלץ, ו 2.5 גרם NaCl. שלב את המרכיבים בבקבוק 1 L, להתאים את עוצמת הקול ל 500 מ"ל עם מים deionized, החיטוי, ואת החנות בטמפרטורת החדר למשך עד 6 חודשים. עבור biotype קלאסית ארסיות גרימת התנאים, להתאים את ה- pH 6.5 באמצעות HCl לפני החיטוי.
  3. AKI בינוני המכיל 0.03% (w / v) NaHCO 3
    1. עבור רכיב 1 (בינוני AKI): לשקול 7.5 גרם peptone, 2.0 גרם שמרים לחלץ, ו 2.5 גרם NaCl. שלב את המרכיבים בבקבוק 1 L, להתאים את עוצמת הקול ל 450 מ"ל עם מים deionized ו החיטוי. המדיום AKI ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר למשך עד 6 חודשים.
    2. עבור רכיב 2 (NaHCO 3 ): לשקול 1.5 גרם NaHCO 3 , ולהתאים את עוצמת הקולל 50 מ"ל עם מים deionized ב שלפוחית ​​סטרילית. מסנן לעקר NaHCO 3 באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. NaHCO 3 חייב להיות מוכן מיד לפני השימוש.
    3. לשלב את שני הרכיבים באופן אקספטי יצירת יחס 1:10 על ידי סינון רכיב 2 לתוך Component 1 לפני השימוש.
  4. Luria-Bertani (LB) אגר צלחות
    1. לשקול 5.0 גרם טריפטון, 2.5 גרם שמרים לחלץ, 2.5 גרם NaCl, ו 7.5 גרם אגר. שלב את המרכיבים בבקבוק 1 L Erlenmeyer, להתאים את עוצמת הקול ל 500 מ"ל עם מים deionized, החיטוי, ולהכין בגודל סטנדרטי בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ מנות סטרילי פטרי. מדיה מצופה יכול להיות מאוחסן עטוף פלסטיק עד 6 חודשים, מכסה בצד למעלה ב 4 ° C.
  5. LB אגר צלחות מוסף עם Polymyxin B
    1. עבור רכיב 1 (אגר LB): לשקול 5 גרם טריפטון, 2.5 גרם שמרים לחלץ, 2.5 גרם NaCl, ו 7.5 גרם אגר. שלב את המרכיבים של בקבוק 1 L Erlenmeyer, להתאים את עוצמת הקול ל 500 מ"ל wiמים מאויירים וחיטוי.
    2. עבור רכיב 2 (polymyxin B): להמיס polymyxin B במים deionized צינור סטרילי 2 מ"ל microcentrifuge לריכוז של 50,000 IU / μL ו מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    3. לאחר רכיב 1 הוא מגניב למגע, אך לא מוצק עדיין, aseptically להוסיף 500 μL של רכיב 2 כדי רכיב 1 יצירת ריכוז סופי של 50 IU / μL ומערבבים היטב. להתכונן בגודל סטנדרטי 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי סטרילי על ידי שפכו התקשורת אגר מעורב לתוך צלחות פטרי. מדיה מצופה יכול להיות מאוחסן עטוף פלסטיק עד 3 חודשים, מכסה בצד למעלה ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. מינימלי ציטראט בינוני אגר צלחות
    1. עבור רכיב 1 (אגר עם כחול bromothymol): לשקול 7.5 אגר אגר ו 0.02 גרם bromothymol כחול. שלב את המרכיבים של בקבוק 1 L Erlenmeyer, להתאים את עוצמת הקול ל 450 מ"ל עם מים deionized ו החיטוי התערובת.
    2. עבור רכיב 2 (10x VBMM): שקול 1.0 גרם MgSO 4 7H 2 O, 10.0 גרם חומצה לימון H 2 O, 50.0 גרם נטול מים K 2 HPO 4 , ו 17,5 גרם NaNH 4 HPO 4 4H 2 O. לשלב את המרכיבים בבקבוק 1 L Erlenmeyer, להתאים את עוצמת הקול ל 500 מ"ל עם מים deionized ו החיטוי או לסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. 10x VBMM ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
    3. הוסף 50 מ"ל של רכיב 2 כדי רכיב 1 ולהכין בגודל סטנדרטי בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי סטרילי על ידי שפכו התקשורת אגר מעורב לתוך מנות פטרי. מדיה מצופה יכול להיות מאוחסן עטוף פלסטיק עד 6 חודשים, מכסה בצד למעלה ב 4 ° C.
  7. לוחות אגר חלב
    1. עבור רכיב 1 (חלב): שוקל 8.0 גרם מיידי יבש חלב nonfat בבקבוק 1 L Erlenmeyer, להתאים את עוצמת הקול ל 200 מ"ל עם מים deionized ו החיטוי.
    2. עבור רכיב 2 (אגר עם אינפוזיה בלב המוח): לשקול 3.68 גרם לב המוח אינפוזיה ו 6.0 גרם אגר. שלב את conStituents בקבוק 500 מ"ל Erlenmeyer, להתאים את עוצמת הקול ל 200 מ"ל עם מים deionized ו החיטוי.
    3. שלב את שני הרכיבים על ידי לשפוך רכיב 2 לתוך רכיב 1, לאחר החיטוי ומערבבים היטב. הכן 150 מ"מ x 15 מ"מ מנות סטרילי פטרי. לוחות חלב ניתן לאחסן עד שבוע עטוף פלסטיק, המכסה בצד למטה ב 4 מעלות צלזיוס. הכן 150 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי סטרילי על ידי שפכו התקשורת אגר מעורב לתוך צלחות פטרי.
  8. לוחות אגר
    1. עבור רכיב 1 (אגר LB): לשקול 5 גרם טריפטון, 2.5 גרם שמרים לחלץ, 2.5 גרם NaCl, ו 2.0 גרם אגר. שלב את המרכיבים בבקבוק 1 L Erlenmeyer, להתאים את עוצמת הקול ל 500 מ"ל עם מים deionized ו החיטוי.
    2. עבור רכיב 2 (1% (w / v) triphenyltetrazolium כלוריד, TTC): שוקלים 0.25 גרם TTC. כוונן את עוצמת הקול ל 25 מ"ל עם מים deionized ב שלפוחית ​​סטרילית מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. חנות עד 6 חודשים בטמפרטורת החדר עטוףב לסכל כדי למזער את החשיפה לאור.
    3. הוסף 2.5 מ"ל של 1% (w / V) סטרילי TTC מדיה autoclaved.
    4. יוצקים התקשורת עבה ככל האפשר (≥ 50 מ"ל / צלחת) לתוך 150 מ"מ x 15 מ"מ מנות סטרילי פטרי. מדיה מצופה ניתן לאחסן עטוף פלסטיק עד שבוע אחד, מכסה בצד למעלה ב 4 ° C. הכן 150 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי סטרילי על ידי שפכו התקשורת אגר מעורב לתוך צלחות פטרי.
  9. Voges-Proskauer (סגן נשיא)
    1. עבור רכיב 1 (Methyl Red-Voges-Proskauer מרק, MR-VP): לשקול 1.7 גרם MR- סגן נשיא בבקבוק ארלנמאייר 500 מ"ל, להתאים את עוצמת הקול ל 100 מ"ל עם מים deionized ו החיטוי. ניתן לאחסן במרקר סטרילי MR-VP בטמפרטורת החדר למשך עד 6 חודשים.
    2. עבור רכיב 2 (5% (w / v) אלפא (α) naphthol): לשקול 1.0 גרם α-naphthol שלפוחית ​​סטרילית ולהתאים את עוצמת הקול ל 20 מ"ל עם אתנול 95%. Α-naphthol ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד שבוע 1 עטוף בנייר כדי למזער expOsure.
    3. עבור רכיב 3 (40% (w / v) הידרוקסיד אשלגן, KOH): שוקלים 20.0 גרם KOH ב שלפוחית ​​סטרילית, להתאים את עוצמת הקול ל 50 מ"ל עם מים סטרילי deionized. KOH ניתן לאחסן עד 6 חודשים בטמפרטורת החדר בכלי פלסטיק.

2. תחזוקה וצמיחה של V. Cholerae זנים

  1. הכנה ושימוש תרבויות מלאי קפוא
    1. גלולה 1.8 מ"ל של תרבות לילה נוזלי במשך 2 דקות על ידי צנטריפוגה (≥ 8,600 x ג ') צינור סטרילי 2 מ"ל microcentrifuge, להסיר supernatant, ולהשעות מחדש את גלולה התא 900 μL של מרק LB טרי על ידי pipetting.
    2. הוסף 900 ​​μL של סטרילי 60% (v / v) גליצרול לתרבות ומערבבים על ידי vortexing.
    3. מעבירים את התערובת לצינור סטרילי 2 מ"ל קריוגני ולאחסן ללא הגבלה ב -80 מעלות צלזיוס.
    4. כדי להשתמש, להסיר כמות קטנה של מלאי קפוא באמצעות לולאה inoculating סטרילי ופס עבור מושבות בודדות על LB AGלוחות. מיד להחזיר מלאי קפוא ל -80 מעלות צלזיוס לאחר השימוש כדי למנוע תרבויות מן ההפשרה לחלוטין. דגירה צלחות מכסה בצד למטה במשך 12 עד 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. גידול תרבויות לילה במדיום נוזלי
    1. פס עבור מושבות בודדות (לפי סעיף 2.1.4) ממלאי קפוא על גבי לוחות אגר LB. דגירה צלחות מכסה בצד למטה במשך 12 עד 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. לחסן 4 מ"ל של מרק LB נוזלי בצינור תרבות סטרילי 10 מ"ל עם מושבה אחת על ידי נגיעה פני השטח של המושבה בודדת עם מקל המוליך סטרילית והעברת המושבה לתוך מרק נוזלי.
    3. דגירה עם אוורור בחממה שאכר בסל"ד 225 במשך 12 עד 16 שעות ב 37 ° C.
  3. עקומת הצמיחה
    1. הכן תרבות לילה LB נוזלי מרק כאמור לעיל בפרוטוקול 2.2.
    2. לעשות דילול 1: 100 של תרבות לילה על ידי העברת 250 μL של תרבות לילה ל 25 מ"ל של מרק LB טרי של בקבוק סטרילית 250 מ"ל Erlenmeyer.
    3. למדוד את הצפיפות האופטית של תרבויות נוזלי ב 600 ננומטר (OD 600 ) כל שעה מתחילה בזמן החיסון (T 0 ).
    4. דגירה דילול 1: 100 של תרבות לילה עם אוורור בחממה שייקר בסל"ד 225 עד 30 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, או עד התרבות מגיע צפיפות מקסימלית.
    5. גרף את ה- OD 600 לעומת הזמן והשתמש ברגרסיה ליניארית כדי לקבוע את זמן הכפלת הזמן המשוער עבור כל זן.
  4. אלטר ביוטיפ
    1. פס עבור מושבות בודדות ממלאי קפוא על גבי לוחות אגר LB. דגירה צלחות מכסה בצד למטה, במשך 12 עד 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. לחסן 10 מ"ל של מדיום AKI המכיל 0.03% (w / v) NaHCO 3 עם מושבה אחת.
    3. דגירה התרבות ללא אוורור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3.5 שעות.
    4. הסר 7 מ"ל של התרבות דגירה הנותרים 3 מ"ל של cultuמחדש עם אוורור בחממה שייקר בסל"ד 225 עבור 4 שעות נוספות.
  5. קלאסי ביוטיפ
    1. פס עבור מושבות בודדות ממלאי קפוא על גבי לוחות אגר LB. דגירה צלחות מכסה בצד למטה במשך 12 עד 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. לחסן 4 מ"ל LL נוזלי מרק (pH 6.5) עם מושבה אחת.
    3. דגירה עם אוורור בחממה שאכר בסל"ד 225 במשך 12 עד 16 שעות ב 30 מעלות צלזיוס.
  6. כביסה תא גלולה ב 1x PBS
    1. גלולה 1.8 מ"ל של תרבות לילה במשך 2 דקות על ידי צנטריפוגה (≥ 8,600 xg) בצינור microcentrifuge סטרילית 2 מ"ל ולהסיר supernatant באמצעות פיפטה. Re- להשעות תא גלולה ב 1.8 מ"ל 1x PBS ידי pipetting.
    2. חזור על הליך הכביסה שלוש פעמים ואחריו resuspension הסופי 1.8 מ"ל 1x PBS.

3. אפיון V. ביולוגים של כולרה

  1. עמ 'CR מבוסס גנטי מסכי באמצעות ctxB ו tcpA
    1. עיצוב קבוצה של primers, אשר anneal כ 50-70 BP במעלה או במורד הזרם של התחנה להתחיל אתרי להפסיק של ctxB ו tcpA , בהתאמה.
    2. הכן תרבות לילה LB נוזלי מרק כאמור לעיל בפרוטוקול 2.2.
    3. בידוד DNA כרומוזומלי באמצעות ערכת זמין מסחרית המיועדת חיידקים שלילי גרם. DNA מטוהרים כרומוזומליות ניתן לאחסן ללא הגבלת ב -20 מעלות צלזיוס. בידוד דנ"א כרומוזומלי באמצעות ערכות זמין מסחרית בדרך כלל לקחת כ 4 שעות.
    4. השתמש ספקטרופוטומטר נפח מיקרו כדי להבטיח את הדגימה DNA כרומוזומלית היא באיכות גבוהה (A 260/280 > 1.8).
    5. עבור כל בידוד דנ"א כרומוזומלי, להכין תגובת שרשרת פולימראז (ים) (PCR) על קרח סטרילית 200 μL צינור PCR (ים) ו להגביר אזורים של ctxB ו tcpA באמצעות רכיבי PCR סטנדרטיים: פולימרז Taq ו buFfer (או שווה ערך), פתרון dNTP, ו primers קדימה / לאחור. השתמש בפרמטרים סטנדרטיים PCR (~ 3 שעות). לדוגמה, השתמש בפרוטוקול הבא:
      1. מחלוקות ראשונות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 120 שניות.
      2. דחה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 60 s.
      3. פריימרים אנאליות ב 60 מעלות צלזיוס במשך 45 s.
      4. להאריך ב 72 מעלות צלזיוס במשך 90 s.
      5. חזור על שלבים 3.1.5.2 עד 3.1.5.4 עבור 34 מחזורים.
      6. סיומת סופי 72 מעלות צלזיוס עבור 600 s.
      7. אינסופי להחזיק ב 4 ° C.
    6. צבע 5 μL של המוצר PCR בהתאמה (ים) באמצעות ג'ל 6x תקן העמסת ג'ל, לטעון כ 10 μL של סולם 1 קילו ו 10 μL של מוצר ה- PCR על ג'ל agarose 1% 1x Tris-Borate-EDTA (TBE) בַּלָם.
    7. הפעל ג'ל אלקטרופורזה ב 130 V עד חזית צבע מגיע לסוף, אבל לא הנחה, של ג'ל (כ 90 דקות). ניטור מתמיד מומלץ כמו מתח פעמים פועל יכול להשתנות בהתאם לציוד.
    8. עם אימות שלהגברה מוצלחת PCR בגודל הצפוי, לטהר את המוצר הנותר 45 μL PCR (ים) באמצעות דנ"א זמין מסחרית נקי & ערכת concentrator.
    9. רצף ניקה מוצר PCR (ים) באמצעות פריימרים אותו המשמש הגברה PCR, ולהכין לכל הנחיות מתקן רצף המקומי.
    10. השווה את פורמט FASTA של רצפי גנים מכל אחד מבודד לרצף שפורסם זמין באתר האינטרנט של NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), על ידי חיפוש מספרי ההצטרפות הבאים בתיבה שאילתת החיפוש.
    11. CtxB : (קלאסי) אזור בין VC0395_A1059 ל VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456
    12. TcpA : (קלאסי) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
  2. מבחני פנוטיפ עבור סיווג ביוטיפ באמצעות איתור
    1. הכן תרבות לילה LB נוזלי מרק כאמור לעיל בפרוטוקול 2.2.
    2. שטפו את התא גלולה (ים) כמפורט בפרוטוקול 2.6.
    3. השתמש פיפטה לנקודה 1 μL של תרבות שטף על המדיום בהתאמה. עבור בחירת בינונית ודגירה דגמים, עיין בטבלה 2.
  3. Assay תנועתיות
    1. הכן תרבות לילה (ים) במרק נוזלי LB כאמור לעיל בפרוטוקול 2.2.
    2. שטפו את התא גלולה (ים) כמפורט בפרוטוקול 2.6.
    3. לחסן לוחיות אגר ארוג על ידי הוספת inoculating דקירה לתוך התרבות נוזלים שטף "דקירה" אנכית לתוך התקשורת. בין כל חיסון, לעקר את חוט דקירה באמצעות מבער Bunsen, וכאשר דקירה אגר, להבטיח דקירה inoculating לא להתכופף, כמו זה יכול לשנות את התוצאות.
    4. דגירה צלחות מכסה בצד במשך 14 עד 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 14 שעות, לפקח על לוחות התנועה מקרוב כדי למנוע overgrowth של תרבויות.
  4. Voges-Proskauer (סגן נשיא) Assay
    1. הכן תרבות לילה (ים) במרק נוזלי LB כאמור לעיל בפרוטוקול 2.2.
    2. לחסן 4מ"ל של מתיל אדום Voges-Proskauer, או MR- סגן מרק, על ידי pipetting 10 μL של תרבות לילה שהוכנו בעבר לתוך 4 מ"ל MR-VP סגן בתוך צינור תרבות סטרילית דגירה עם אוורור בחממה שייקר בסל"ד 225 עבור 12 עד 16 שעה ב 37 ° C.
    3. הוסף 150 μL של 5% (w / v) α-naphthol ו 50 μL 40% (w / v) KOH ל aliquots 1 מ"ל של MR- סגן נשיא לילה תרבות צינורות סטרילי, בהתאמה.
    4. מערבולת קצרה ולתת לעמוד בטמפרטורת החדר עד 4 שעות עד שינוי צבע מתפתח.

תוצאות

עבור תחזוקה נאותה ושימוש בכל זן חיידקי, מומלץ לדעת את זמן הכפלה של זן (ים) של עניין. הנה, את שיעורי הצמיחה המשתנים של V נפוץ. זנים cholerae הודגמו דרך עקומת הצמיחה, ואת זמני הכפלה משוער חושבו באמצעות רגרסיה ליניארית. WT El Tor N16961 ו El Tor וריאנט MQ1795 הוכיחו פע?...

Discussion

של מעל 200 מזוהה V. Cholerae serogroups, רק O1 ו O139 יש פוטנציאל מגיפה. ניתן לחלק את הסרוגרופ O1 לשני ביו-טיפוסים: קלאסית ואל טור. עם זאת, זנים היברידיים, הנקראים אל ור גורפים 13 , 17 , התברר כי בעלי רקע ביוטיפ אל Tor, ומאפיינים קלאסיים הנמל 8...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר נתמך על ידי ניו המפשייר- INBRE באמצעות פרס פיתוח מוסדי (IDeA), P20GM103506, מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של NIH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb DNA LadderNew England BiolabsN3232Shttps://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% GlycerolCalbiochem356352http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
AgarBecto, Dickinson and Co.214030http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agar with brain-heart infusionBecto, Dickinson and Co.237500http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
AgarosePeqlab732-2789https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Anhydrous K2HPO4Fisher ScientificP288-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Blood Agar PlatesRemelR01200Store at 4 °C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Boric AcidFisher ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymol BlueFisher ScientificB388-10https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Cirtric acid ·H2OFisher ScientificS72836-3https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deoxynucleotide (dNTP) Solution KitNew England BiolabsN0446SStore at -20 °C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodium EDTAFisher ScientificS311-500https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Clean & Concentrator™ -25 KitZymo ResearchD4007http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Nucleic Acid StainBiotium41005https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS SpectrophotometerThermo Scientific840-208100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Yeast/Bact. KitQiagen158567https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HClFisher ScientificA144-212Corrosive;  https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KClFisher ScientificP217-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH2PO4Fisher ScientificP285-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOHFisher ScientificP250-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le LoopDecon Labs Inc.MP190-25http://deconlabs.com/products/leloop/
Le StabDecon Labs Inc.MP186-5http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4·7H2OFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio Rad Labs1704406http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP BrothDifco216300http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaClFisher ScientificS271-10https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3Fisher ScientificS233-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4·4H2OFisher ScientificS218-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
NanoDrop Lite SpectrophtometerThermo ScientificND-LITE-PRhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Nonfat dry milkNestle CarnationN/AN/A
PeptoneBecto, Dickinson and Co.211677http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
Petri Dishes (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Petri Dishes (150 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875714https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Polymyxin B sulfate saltSigma-AldrichP1004-10MUStore at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=US
Taq DNA PolymeraseNew England BiolabsM0273SStore at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Reaction BufferNew England BiolabsM0273SStore at -20 °C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™ Bio Rad Labs1840148http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Triphenyltetrazolium chlorideAlfa AesarA10870https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Tris BaseFisher ScientificBP152-1https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
TryptoneBecto, Dickinson and Co.211705http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Yeast ExtractBecto, Dickinson and Co.212750http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
α-naptholMP Biomedicals204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189

References

  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
  5. Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved