השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

Summary

Immunolabeling שיטות כדי לנתח אוכלוסיות נפרדות של microtubules במוח דג זברה המתפתח מתוארים כאן, אשר חלים באופן נרחב לרקמות אחרות. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה ממוטב עבור immunolabeling microtubules יציבה ודינמית. פרוטוקול השני מספק שיטה כדי התמונה ולכמת nascent microtubules במיוחד.

Abstract

Microtubules (MTs) הם דינמיים ושבירה במבנים מאתגר התמונה ויוו, בפרט העוברים בעלי. החוליות. שיטות Immunolabeling מתוארים כאן ולנתח אוכלוסיות נפרדות של MTs בצינור העצבי המתפתח של העובר דג זברה. כאשר המוקד הוא על רקמה עצבית, מתודולוגיה זו ישימה בהרחבה לרקמות אחרות. ההליכים ממוטבים מוקדם עד אמצע-somitogenesis-שלב עוברי (1 somite כדי 12 somites), אולם הם יכולים להיות מותאמים למגוון שלבים אחרים עם התאמות קלות יחסית. הפרוטוקול הראשון מספק שיטה להעריך את התפוצה המרחבית של MTs יציבה ודינמית ולבצע ניתוח כמותי של אוכלוסיות אלה עם תוכנות עיבוד תמונה. גישה זו משלימה הכלים הקיימים כדי התמונה microtubule dynamics והפצה בזמן אמת, באמצעות קווים הטרנסגניים או בביטוי ארעית של בונה מתויגות. ואכן, כלים כאלה הם מאוד שימושי, אולם הם אינם ברצון מבחינים בין MTs דינמית ויציבה. היכולת תמונה ולנתח אוכלוסיות נפרדות microtubule אלה יש השלכות חשובות על מנגנונים ההבנה שבבסיס תא קיטוב, מורפוגנזה. פרוטוקול השני מתאר טכניקה כדי לנתח nascent MTs במיוחד. זו מושגת על-ידי לכידתו של מאפייני הצמיחה דה נובו MTs לאורך זמן, בעקבות microtubule depolymerization עם nocodazole הסמים ותקופת ההתאוששות לאחר שטיפה סמים. טכניקה זו לא הוחל עדיין במחקר של MTs בדג זברה עוברי, אבל וזמינותו יקר על חקירת הפונקציה ויוו של חלבונים מעורבים microtubule הרכבה.

Introduction

Microtubules (MTs) הם פולימרים של α - ו β-טובולין. זה להרכיב לתוך protofilaments ליניארית, כמה מהם לשלב כדי ליצור צינור חלול^1,2. MTs הם מבנים מקוטב, עם בצמיחה מהירה פלוס מסתיים, הגדלים לאט מינוס מסתיים שמעוגנים את centrosome או אחרים ארגון microtubule center (MTOC)³. דה נובו היווצרות MT הוא שיזם התגרענות בγ-טובולין. הטבעת מורכבת (γ-TURC), אשר מספק תבנית עבור הרכבה MT⁴. בתא נתון כלשהו, שתי האוכלוסיות של MTs ניתן להבחין את הפניה הזאת מעל בקצב שונה. MTs דינמי לחקור את הסביבה התאית שלהם על ידי מיתוג בין שלבי צמיחה הצטמקות בתהליך המכונה יציבות דינאמית⁵. בניגוד MTs דינמי, MTs יציב שאינו גדל, יש מחצית חיים ארוך יותר מאשר MTs דינמי⁶.

עשורים של מחקר ב ביולוגיה של התא יש מספק מערך מתוחכם של כלים ללמוד MT מבנה ותפקוד וכתוצאה גוף גדול של ידע על אלה אלמנטים cytoskeletal. למשל, MTs לשחק תפקיד המרכזי ובשימור תא קוטביות, אשר לא רק לייחס קוטביות מהותי שלהם, אלא גם כלפי ההתפלגות subcellular דיפרנציאלית של יציבה לעומת דינמי MTs^{7, 8}. לעומת זאת, הרבה פחות מובנת על אדריכלות MT ותפקוד בסביבות מורכבות יותר תלת-ממדיים (3-D), כגון העובר חוליות, בחלקו בשל האתגר של הדמיה של שלד התא MT ברזולוציה גבוהה. למרות מגבלה זו, הדור האחרון של GFP-הבעת הטרנסגניים קווים שהמדבקה MTs או ארעי ביטוי מתויג fluorescently MT סמני גדל ההבנה שלנו של השינויים הדינמיים MTs עוברים וסלולר שלהם, תפקיד התפתחותי העובר דג זברה. הרשת MT יכול לדימות הטרנסגניים שורות אילו טובולין מתבצע ישירות פולימרים⁹ או טובולין עם תוויות מסומנות באופן עקיף באמצעות חלבונים הקשורים MT Doublecortin-כמו-קינאז (Dclk) או Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. קווים אחרים (וגם בונה) נוצרו לאפשר הערכה של קוטביות מהותי MT על-ידי תיוג במיוחד הר plus מסתיים או centrosome-מעוגן מינוס מסתיים^{11,12,13, 14}. הכוח של כלים אלה טמון ביכולת בחקר דינמיקה MT ב live, פיתוח אורגניזמים. מחקרים גילו, לדוגמה, התפלגות מרחבית ודינאמי של MTs אוכלוסיות תאים מסוים, כיוון mitotic spindles ברקמות שעברו מורפוגנזה (אינדיקטור של המטוס של חלוקת התא), את הקוטביות של הפולימר MT ככל שהוא מתייחס לתהליכים כגון התארכות התא, הגירה, קצב הצמיחה MT נקבע על ידי שביט מהירות^9,13,15. המגבלה של כלים אלה היא כי הם לא ברצון להפלות בין אוכלוסיות MT יציבה ודינמית.

ציור מן הספרות ביולוגיה התא עשיר, שיטות immunolabeling תמונה יציבה ודינמית MTs ב העובר דג זברה מתוארים כאן, אשר הם משלימים על השימוש הטרנסגניים קווים. השימוש הנרחב של כזה שיטות immunolabeling דג זברה יש כבר הקשו במידת מה על ידי הקושי בשימור תקינות MT במהלך ההליך קיבעון. פרוטוקול 1 מתאר שיטה ממוטב עבור סך immunolabeling, דינמי, וחצו MTs יציב ב סעיפים hindbrain המתפתח דג זברה. יתרה מזאת, שיטה פשוטה באמצעות מסחרית התוכנה הזמין מתואר לכמת אוכלוסיות אלה MT. MTs יציב נבדלים MTs דינמי המבוסס על מספר שינויים post-translational של α-טובולין, כגון acetylation ו- detyrosination, אשר מצטברים MTs יציבה לאורך זמן^16,17. העובר דג זברה, acetylation חל על MTs ciliary, עצב אך לא על יציבה לאטמוספרה MTs¹⁸, הגבלת את התועלת של סמן זה לתת-ערכה של MTs מיוצב. לעומת זאת, detyrosination מופיע כך שיתרחשו MTs יציבה כל העובר דג זברה¹⁸. שינוי post-translational זה חושף את חומצה גלוטמית carboxy-מסוף של α-טובולין (detyrosinated טובולין)¹⁸ , ניתן להבחין באמצעות אנטי-Glu-טובולין¹⁹. למרות detyrosination מעדיפים מתרחש MTs יציב, ראיות מציין את השינוי post-translational הוא תוצאה של, יותר מאשר גורם לחוסר יציבות MT¹⁶. האוכלוסייה MT הדדיים, המורכב MTs דינמי, מזוהה באמצעות נוגדן, אנטי-Tyr-טובולין, זה במיוחד מזהה את הצורה tyrosinated של α-טובולין¹⁹. בעקבות immunolabeling עם סמנים אלה קונאפוקלית הדמיה, ניתן לבצע ניתוח כמותי של MTs (אורך, מספר ושפע היחסי) באזורים מוגדרים של הצינור העצבי המתפתח. שיטה יעילה מסופק כאן לביצוע ניתוח זה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה תלת-ממדית. בשיטה זו ניתן להחיל על שאלות בנוגע מורפוגנזה לבין הממסד או ההבשלה של התא קוטביות²⁰. אכן, לפתח של מערכים מקוטב של MTs יציב מלווה אירועים התפתחותיים רבים, כולל מורפוגנזה קולט אור²¹, epithelialization של תאים בפיתוח שפופרת פגמים בתעלה¹⁸ ו האקסון היווצרות⁸.

פרוטוקול 2 מתאר ויוו עיבוד של assay ביולוגיה התא כדי לנתח MTs במהלך שלהם הרכבה שלב (התגרענות/anchorage וצמיחה)^22,23. MTs המתהווה nucleated-centrosome, לאחר מכן מעוגנת תוספות subdistal של אמא צנטריול²³. מתוארת שיטה לנתח nascent לצמיחה מחודשת MT בעקבות depolymerization. פרוטוקול זה מספק פרטים על הטיפול nocodazole depolymerize MTs, ההליך שטיפה סמים ואת תקופת ההחלמה שלאחר הטיפול. MT מחדש את הצמיחה מנוטר על מרווח קבועs שטיפה פוסט מאת immunolabeling עם סמנים עבור MTs הכולל (אנטי-β-טובולין) לצד סמני centrosome (אנטי-γ-טובולין) ואת גרעין (4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)), על פי כללי בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול 1. השלב depolymerization MT של פרוטוקול זה חיוני כפי שהיא מאפשרת הערכה של דה נובו MT צמיחה ולא סיומת של MTs שישנו. טכניקה זו ולכן היא נבדלת הליכים אחרים שפורסמו למדידת שיעורי צמיחה MT (בהעדר depolymerization) באמצעות סמן קצה פלוס כגון end מחייב חלבון 3 דבוקה חלבון פלואורסצנטי ירוק (EB3-GFP), כפי שמוצג טראן. et al., 2012¹¹. יתר על כן, וזמינותו זה שימושי במיוחד עבור ניתוח עוברי פגומים בהרכבה דה נובו MT, כגון המוטציות NEDD1 שדווחה בעבר שבו גיוס של γ-טובולין כדי centrosome פגום, וכתוצאה מכך לא שלם היווצרות שפופרת פגמים בתעלה, ליקויים עצביים²⁴.

Protocol

אתיקה במשפט: ההליכים המתוארים להלן בצע של אוניברסיטת הנחיות טיפול בבעלי חיים במחוז בולטימור מרילנד.

1-ניתוח של ויציבה דינמי MTs באמצעות Immunolabeling (פרוטוקול 1)

1. dechorionation ידני של העוברים לפני קיבוע
   1. קבל טרי הוליד העוברים על ידי לשפוך את המים העודפים מערכת, לאחר מכן איסוף העוברים הנותרים לתוך פלסטיק פטרי (עיין טבלה של חומרים).
   2. הסר כל פסולת מערכת מים, העברת העוברים על תבשיל חדש מלא עם העובר בינוני (עיין טבלה של חומרים) כדי להבטיח כי העוברים לפתח בסביבה נקייה.
   3. לאפשר את העוברים לפתח. כדי השלב הרצוי חממה מבוקרי טמפרטורה-28.5 ° C.
   4. עוברי המקום צעיר יותר 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) בקערת זכוכית לפני dechorionation.
      הערה: Dechorionate העוברים לפני קיבוע כדי להגדיל את החדירה המהירה של שלמות MT מקבע ומשמרות. שימוש בינוני העובר במקום מערכת מים כדי לספק את נוספים Ca ^{2 +} הדרושים במהלך dechorionation.
   5. להסיר באופן ידני את chorions עוברי בעוד פטרי, באמצעות מלקחיים בסדר תחת מיקרוסקופ ויבתר.
      1. לצבוט אזור קטן ב chorion עגול, שקוף המקיף את העובר עם זוג מלקחיים ובעדינות למשוך מלקחיים בנפרד כדי ליצור קרע בקרום.
      2. להגדיל את הפתח בעדינות ממבט על chorion קרע באמצעות מלקחיים. להיזהר לא לגעת העובר עם המלקחיים כפי פריר.
2. קיבוע העובר בשלבים
   1. העברת מבוים, dechorionated עוברי ל 1.5 mL צנטריפוגה צינורות. להסיר כמה שיותר בינוני העובר ככל האפשר באמצעות כוס פסטר פיפטה.
      הערה: לבצע קיבוע וטיפולי סמים על עוברי יאנג (אמצע-somitogenesis), לפני הקמת המרכזים העצביים תיווכה תחושת הכאב, אשר דורשים אין הליך נוספים כדי להקל על הכאב במהלך המתת חסד. שלבים התפתחותיים הם כמשמעותם קימל et al., 1995 ²⁵. השלבים somite 4-5, 11-12 שימשו כדי להשיג כמה תמונות של דמויות 2 ו- 3-
   2. להכין 4% paraformaldehyde (PFA) /MT הרכבה מאגר (MAB) מקבע (עיין טבלה של חומרים) על ידי שילוב של 1 מ ל 8% מחברים לכל 1 מ ל 2 X MAB והוספת 2 µL 100% טריטון X-100 לכל 1 מ"ל של הנפח הכולל.
      התראה: ללבוש כפפות בעת טיפול פתרונות המכילה מחברים, טריטון X-100, אשר גירוי העור.
   3. תיקון עוברי 1 מ"ל 4% מחברים/MAB לשבועיים למשך 5 דקות ב- 28.5 ° C. לשאוב לשבועיים עם פיפטה, להחליף אותו עם מקבע טרי 1 מ"ל ולאחר תקופת דגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT) על כיסא נדנדה.
      הערה: דוגמאות יש לתקן במהירות בטמפרטורה שלהם ביולוגי (28.5 ° C עבור דג זברה) כדי למנוע תלוית טמפרטורה MT depolymerization.
3. תשאף מקבע ולהוסיף 1 מ"ל 1 x באגירה טריס תמיסת מלח עם NP40 מאגר (TBS-NP40). בעדינות להתסיס ב RT-רוקר שלוש פעמים במשך 5 דקות. לאחסן עוברי ב 4 ° C 1 מ"ל טרי 1 X TBS-NP40 עבור לא יותר מ- 7 ימים-
   התראה: ללבוש כפפות בעת טיפול פתרונות המכיל NP-40, מגרה העור.
Agarose
4. Sectioning עוברי עבור immunolabeling
   1. נקודת התכה נמוכה של RT חום 4% (LMP) הטבעה בינוני במיכל סגור עד הפתרון נעשה ברור באמצעות צלחת חמה מוגדר כ- 50 ° C בקרבה מיקרוסקופ ויבתר . להשאיר את המיכל סגור בין דגימות ומחוממים לאורך כל תהליך ההטבעה (צעדים 1.4.4-1.4.6).
   2. העברת העוברים מ 1.5 mL צנטריפוגה צינורות על צלחת פטרי באמצעות פיפטה מזכוכית ולמלא אותו 1 X TBS-NP40.
   3. להסיר את התאים חלמון גדול מעוברים שלב somitogenesis (4-5, 11-12 somites) בצלוחית הפטרי באמצעות מלקחיים בסדר תחת ההגדלה של מיקרוסקופ ויבתר ²⁶. להחזיק את העובר על ידי ניצן הזנב עם זוג מלקחיים, הקילוף התאים חלמון עם הזוג אחרים על מנת לשמר את הרקמה hindbrain. להעביר את העוברים דה-yolked שטח של הפטרי ללא החלמון פסולת.
      הערה: להטביע עוברי כייר מלא agarose בנפרד למניעת התקשות מוקדמת של agarose LMP.
   4. מילוי אחד 12 מ"מ x 5 מ מ x 3 מ"מ טוב של העובש אופטים עם 200 µL נמסה LMP agarose משתמש של micropipette. בצע את השלבים 1.4.5.-1.4.6. במהירות (תוך 20 s של מילוי העובש) כדי להטביע את העובר לפני agarose LMP מתקררת כדי RT ומחזקים.
   5. להשתמש מלקחיים בסדר כדי להעביר עובר דה-yolked על-ידי tailbud מ הפטרי כייר מלא agarose לקראת סופו מחודדות תחת מיקרוסקופ ויבתר.
   6. מלקחיים בסדר להשתמש אוריינט העובר לתבנית כך vibratome חתכים במישור הרצוי. ליצור מקטעים רוחבי על ידי המכוונת העובר כך הרקמה hindbrain מקביל באורך התבנית עם פני השטח הגבי שלו מול הקצה, פני השטח הקדמי שלו מול בקצה אזור מחודדות. חזור על צעדים 1.4.4-1.4.6 העוברים הנותרים.
   7. אפשר agarose ההטמעה שבמהלכו למשך 5 דקות ב- RT.
   8. 40 ליצור מקטעים מיקרומטר של הציר הגבוה של agarose מוטבע עוברי (צעדים 1.4.1-1.4.7) באמצעות vibratome של המנה אופטים מלא 1 x TBS-NP40. להעביר חלקים עניין צלחת 24-ובכן ב- 500 µL 1 x TBS-NP40 באמצעות מלקחיים משובחים. מקם את המקטעים של עובר אחד בלבד לכל טוב.
      הערה: עיין הפניה ¹⁸ לקבלת פרטים נוספים. ודא כי סעיפים להישאר hydrated בבית כל הזמן, לפחות 250 µL של המאגר ורוק במהירות נמוכה (10-25 סל ד) עבור השלבים הנותרים למנוע הפרדה מלהטביע agarose. דטרגנטים להציג החסימה, פתרונות כביסה צריך להפחית את מתח הפנים של המדיום הנוזלי ולאפשר ועלייתו של הסעיפים. בדוק כי סעיפים יישארו בתוך הבארות במהלך ואחרי כל המניפולציות. שימוש באזהרה כדי למנוע בטעות ביטול סעיפים במהלך שוטף.
5. להסיר את המאגר ולהוסיף 500 µL של חסימת פתרון. רוק לפחות שעה-RT.
   הערה: השתמש פתרון חסימה המכיל סרה 5% של המארח מינים של כל נוגדן משני כדי לשמש (עיין טבלה של חומרים).
6. Incubate ב 300 µL הראשית נוגדנים מדולל במאגר חסימה של 36-72 h-4 מעלות צלזיוס על כיסא נדנדה. תשטוף פעמיים ב 600 µL 1 x TBS-NP40 על כיסא נדנדה למשך 30 דקות כל אחת, ב- RT.
   הערה: סעיפים כפול-התווית על-ידי המקננת ב ראשי נוגדנים נגד MTs הכולל (אנטי-β-טובולין, או אנטי-α-טובולין) ו MTs יציב (anti-Glu-טובולין) או MTs דינמי (אנטי-Tyr טובולין). בחר ראשי נוגדנים הועלו במינים שונים המארח תיוג זוגי כולל ו post-translationally שינוי אוכלוסיות α-טובולין. עיין בטבלה של חומרים עבור דילולים נוגדן.
µL
7. Incubate ב 300 fluorophore מצומדת נוגדנים משניים מדולל במאגר חסימה על כיסא נדנדה עבור 16-24 h, 4 ° C בחושך. תשטוף פעמיים ב 600 µL 1 x TBS-NP40 על כיסא נדנדה למשך 30 דקות כל אחת, ב- RT.
   הערה: לעטוף את המנה רב טוב המכיל נוגדנים משניים בנייר מנקודה זו ואילך, לאחר כל מניפולציה כדי למנוע שכבתה. בחר נוגדנים משניים כי מגיבים עם אימונוגלובולינים המארח של נוגדן ראשוני. בחר fluorophores נוגדנים משני בעלי ספקטרום הפליטה נפרדים, שאינם חופפים. עיין בטבלה של חומרים עבור דילולים נוגדן.
8. דגירה העוברים ב 500 µL של דאפי פתרון על כיסא נדנדה למשך 30 דקות, בשטיפת RT. שלוש פעמים ב- TBS-NP40 נדנדה-RT למשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: תיוג גרעיני מספק הסלולר ההקשר עבור כימות MT שבוצעה בשלב 1.12.
9. במקום טיפה של הרכבה בינונית עם סוכן אנטי-עמעום על המרכז של שקופית ללא אבק. להשתמש מלקחיים בסדר כדי להעביר מקטעי ה-droplet בינוני הרכבה. המקום coverslip ללא אבק על המדגם. לאחסן שקופיות במקום יבש, חשוך וקריר, עטופה בנייר כסף, עד מבוצעת הדמיה-
   הערה: חגים הסעיפים בחלק האחורי של השקופית באמצעות סמן קבוע שקצהו בסדר לפני הדמיה תסייע לזהות חלקים כאשר באמצעות המיקרוסקופ.
10. הדמיה קונאפוקלית
    1. הר מקטעים לייזר הפוכה מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בהדבקת השקופית לבמה עם coverslip מול המטרה. לקבוע את אופטיקה המתאים (המטרה, לייזר והגדרות ערוץ כגון לקבל והיסט) בשקופית שליטה ולשמור אותם עקבית בין דגימות ²⁷. להימנע oversaturating את הפיקסלים כדי למנוע אובדן נתונים.
    2. ללכוד תמונות קונאפוקלית Z-במחסן באמצעות הגדרות הערוצים עבור fluorophores נוגדנים משניים שנבחר ולשמור את קבצי התמונה ²⁷. לרכוש Z-במחסן עבור כל מקטע.
       הערה: לשכפל את הפרמטרים נהגה לרכוש את התמונות דמויות 2 ו- 3 באמצעות ההגדרות הבאות רכישה: מצב = XYZ; ההגדלה אובייקטיבי = 63 X עדשה טבילה שמן; מפתח נומרי אובייקטיבי = 1.4; Z-צעד = 0.1 מיקרומטר; Z-עומק = 16.23 מיקרומטר. השתמש בהגדרות ערוץ הבאות: דאפי עירור עם 20% UV-טווח לייזר, טווח מסנן פליטה = 430-480 ננומטר, האופטיקה (PMT) רווח = 525 V ולאחר קיזוז PMT =-1.72%; fluorophore ננומטר 448 (עיין טבלה של חומרים) עירור עם 20% 488 ננומטר לייזר, טווח מסנן פליטה = 493-573 ננומטר, רווח PMT = 689 V ולאחר קיזוז PMT =-0.2%; 594 עירור fluorophore ננומטר עם 32% 594 ננומטר לייזר, טווח מסנן פליטה = 608-706 ננומטר, PMT רווח = 768 V ולאחר קיזוז PMT =-6.8%-
    3. לשמור קבצי נתונים גולמיים עם שמות קבצים ייחודי, תיאורי וליצור עותק לעריכה בתוכנה ניתוח התמונה.
11. אוסף של Z-במחסן להצגת תחזיות המרבי
    1. לפתוח את העותק קובץ נתונים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית הציבור (למשל, ImageJ). סימון כל אחד מערוצי מופיע רצף תמונות בודדות (Z-ערימות).
    2. פיצול לערוצי התמונה באמצעות הרצף התפריט הבא: “ תמונות/צבע/פצל ערוצים ”.
    3. ליצור תמונת הממוזג על-ידי השלכת את ערוצי עניין באמצעות הרצף התפריט הבא: " תמונות/צבע/מיזוג ערוצים. " בחר את 594 ננומטר, 488 ננומטר, וערוצי דאפי להיות כוזב בצבע אדום, ירוק וכחול, בהתאמה. בדוק " יצירת הפרדות צבע " ובחר " אישור " ²⁸.
       הערה: להשמיט את הערוץ דאפי להעביר את פירוט ספציפי ל MTs הקרנה מרבי כמו באיור 2 ו- 3, עדיף על ידי רק בחירת צבעים שווא עבור שני הערוצים האחרים.
    4. לבחון את Z-מחסנית הממוזג, רשום את ההתחלה והסיום עמדות של הפנימית הטובה ביותר Z-המטוסים עבור כל הערוצים גלוי. לפטר החיצוני Z-המטוסים בדרך כלל בעלי אות שיוצרת עקב משטחים אחידים של המקטע. עיין להפנות ²⁹ לפרטים-
    5. להמחיש הערימה-Z הממוזגת כתמונה דו-ממד יחיד על-ידי ביצוע של הטלה בעוצמה מרבית Z-מחסנית באמצעות הרצף התפריט הבא של ניתוח תמונה תלת-ממדית של: " תמונות/מחסנית/Z-בפרוייקט. " להזין ההתחלה והסיום עמדות הטובים ביותר הפנימי Z-מטוסים מהשלב 1.11.3 כמו " התחל פרוסה " ו " עצירה פרוסה, " בהתאמה. בחר " מקסימום עוצמה " סוג ההקרנה ולחצו על " אישור ". עיין להפנות ²⁸ לפרטים נוספים-
12. MT בניתוח תיוג
    1. לפתוח את תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדי מסחרי. בחר " ליצור ספריית " לספק שם תיאורי עבור הספרייה התמונה. לחץ על " צור. " לגרור קבצים תמונת raw המופקים מיקרוסקופ קונפוקלי לספרייה. קבצים גדולים יותר דורשים יותר זמן להעביר.
    2. בחר קובץ כדי לנתח. בחר " מיקוד מורחבת " מ " תצוגה " התפריט כדי להציג את התמונה התמזגו הערוץ בחלון הראשי של.
    3. להתאים את סף על-ידי גרירת הכלי המחוון לכל ערוץ ימין או שמאל עד האות רקע מוקטן, האות האמיתי הוא עמיד. שים לב כי כל אחד מערוצי מראה אות אמת עבור מולקולת עם התווית (למשל, דאפי הערוץ מציג גרעינים מלבני או mitotic אך לא אוטומטית-זריחה הציטופלסמה או agarose).
    4. בחר " ביד חופשית אזור של הריבית (ROI) " כלי ומיתאר האזור עניין כדי להיות מנותח. בחר " פעולות " טאב ואחריו " יבול לבחירה " כדי לחתוך את התמונה. שמור את קובץ התמונה החתוכה תחת שם חדש. לחץ " מדידות " טאב כדי ליצור הפרוטוקול עבור סינון אובייקטים מסוימים הנוגעים ניתוח תלת-ממדי.
    5. דראג " למצוא אובייקטים " לחלון פרוטוקול. שינוי שם של הפרוטוקול הראשון " דאפי. " בחרו בערוץ דאפי בתפריט הנפתח. גרור את ההגדרות הבאות בפרוטוקול דאפי ולמקם אותם מתחת " למצוא אובייקטים " לפי הסדר הבא (טבלה 1): " למלא חורים ObjectsŔ " נפרד לגעת ObjectsŔ " לא לכלול אובייקטים על-ידי SizeŔ " אל תכלול לא נוגע ROIs ".
       הערה: המטרה של הגדרת טבלה 1 כדי לקבוע תחילה סף זה מבטלת את אותות ותפוצתם, גודל עולה בקנה אחד עם הגודל של עצמים שעוברים ניתוח. לדוגמה, לחסל את אות לא גדולים מספיק כדי להיות גרעין בעת ספירת גרעיני.
    6. בצע הרצף (שלב 1.12.9) להרכיב את הנותרים מסננים עבור β-טובולין, סמנים אחרים תוך שימוש בהגדרות טבלה 1-
    7. בחר " מידה " בחלק התחתון של כל פרוטוקול. בחר " בעוצמה ומדידה נפח " ו " אורך השלד " עבור כל תיוג טובולין, אבל רק לשעבר לאות דאפי.
    8. ציירו רועי סביב האזור שברצונך למדוד. לצפות את המידות תחת " סיכום " טאב לאחר התוכנה תהליכי באזור. העתק את הנתונים ולשמור אותם לגיליון עביד, כמו בטבלה 2. צור עותק גיבוי של הגיליון לניתוח בשלב מאוחר יותר.
    9. בחר מדידות של עניין (לדוגמה, אורך של הר צרור, מספר חבילות MT/גרעין, כפי גילה עם סמנים שונים) בגיליון ולנתח כדי לקבוע את הממוצעים עבור כל קבוצה.
       הערה: הר צרור האורך הממוצע = הסכום ' מתכוון אורך השלד עבור β-טובולין ' עבור כל העובר מחולק על ידי המספר הכולל של העוברים. עיין שורה 20 המובאים בטבלה 2. תבנית הגיליון כך משתנים וקבוצות ניסיוני מוצגים בגרף בקלות.

2. דה נובו MT הרכבה Assay (פרוטוקול 2)

1. לבנות ובדיקה מרובת טוב זרימה דרך המנגנון ( איור 1) 2 ימים לפני הניסוי.
   הערה: המנגנון מאפשר שטיפה בו זמנית של מספר קבוצות הניסוי לאחר הטיפול nocodazole באמצעות אספקה של טבלה של חומרים. סילר לאיטום סיליקון דורש לפחות 24 שעות של זמן ייבוש לפני זה מהווה שום סיכון רעילות העוברים.
   1. לפצל את שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל לשניים לאורכו, באמצעות פאזל או הלהקה ראה-
   2. 7 לחתוך עיגולים למחצה, עם רדיוס של 3 ס מ, מתוך 70 מיקרומטר ניילון mesh ולחיתוך שיתאימו בחוזקה לתוך אחד חצי של ספליט צנטריפוגה שפופרת. הדבק החוגים למחצה לתוך הצינור צנטריפוגה במקביל הסימנים הדרגתיות 10 מ"ל באמצעות סילר לאיטום אקווריום-בטוח סיליקון. לאפשר להתקן יבש במשך יומיים ולשטוף למסמס בתוך מים במשך 2-3 ח'
   3. קו בסוף (משורשרות) העליון ברכבת התחתית צנטריפוגה לחתוך עם בפלסטלינה כזה כי הגובה של הנוזל נשמר במכשיר זרימה דרך יש עומק של ¼ אינץ ( איור 1, נוף 2 ו- 3).
   4. להכין את המנגנון שטיפה על-ידי הסרת הבוכנה מזרק 50-mL ולהוספה של 12 סנטימטרים של אבובים בסדר לתוך הקצה. לדחוף את הצנרור ככל היא ללכת, לאטום סביב המפרק באמצעות מידול קליי.
   5. טרום רטוב באמצעות רשת בינוני העובר כדי לאפשר את הנוזל לרוץ דרך המכשיר זרימה דרך כולו. זווית המכשיר על קרח אז הנוזל הזה בריכות כל התאים אבל עדיין תודה שבאתם הקדמי שבו השפה קליי ממוקם. באמצעות עמדה טבעת, להשעות את המנגנון שטיפה מעל המכשיר זרימה דרך על קרח ( איור 1).
   6. להירגע 200 מ של העובר בינוני על הקרח ויוצקים מספיק לתוך מנגנון שטיפה כדי להבטיח כי כל בועות האוויר נמחקים כי קצב הזרימה הוא כ 7 מ ל לדקה התאמת קצב הזרימה על-ידי שינוי הגובה של המזרק.
2. Enzymatically dechorionate עוברי
   1. להפוך הפתרון עובד של פרוטאז שאינם ספציפיים על-ידי דילול 1 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל מניות שאינם ספציפיים פרוטאז במדיום העובר 20 מ ל.
   2. בצע dechorionation כימי על עוברי h 1 לפני timepoint כאשר הם צפויים להגיע לשלב ההתפתחותי הרצוי. תקציר chorions על-ידי הסרת העובר בינוני 100 מ מ פטרי המכילות מבוים עוברי והוספת 20 מ של הפתרון עובד שאינם ספציפיים פרוטאז.
   3. Incubate עוברי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק
      הערה: לא יעלה על 5 דקות או להשתמש ריכוז גבוה יותר של פתרון פרוטאז שאינם ספציפיים, כמו התוצאה תהיה העוברים נופל לגזרים פעם שטופלו nocodazole.
   4. במהירות פיפטה החוצה פרוטאז שאינם ספציפיים, ממלאים את מנות כ 25 מ ל העובר בינונית. אני חוזר פעם.
   5. באמצעות פיפטה של זכוכית 1-mL, העברת העוברים צעיר יותר 24 מנות hpf הזכוכית כדי להגן עליהם מפני נזק.
   6. Dechorionation מלאה על-ידי הסרת ידני chorions באמצעות זוג מלקחיים בסדר, כפי שמתואר בשלב 1.1.5.
   7. במקום זכוכית פטרי המכילות dechorionated העוברים בתוך חממה 28.5 ° C למשך תקופה מינימלית של 30 דקות עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי.
3. Depolymerize MTs הקיימים
   1. להכין את הפתרון עובד של nocodazole µg/mL 5 על ידי שילוב של nocodazole מניות 1 מ"ג/מ"ל µL 50 מ"ל קרח העובר קר בינונית.
      התראה: שימוש בכפפות בעת טיפול nocodazole, מגרה העור.
   2. חילופי המדיום העובר של קבוצת טיפול nocodazole עם הפתרון עובד 10 מ"ל nocodazole קר. המקום פטרי בקרח זמן מתאים לשלב ההתפתחותי (לדוגמה, 1h עבור עוברי somite 4-5). להפריש שליטה ללא טיפול עוברי בצלחת פטרי על הקרח יש לתקן לצד שטיפה דגימות בשלב 2.3.4.1.
   3. העברת העוברים באמצעות על פיפטה 1-mL כמראה אש למכשירים זרימה דרך, בעזרת תאים נפרדים עבור כל קבוצה ניסיונית. הפעלה הכשלון nocodazole על ידי שפיכת בינוני העובר קר קרח אל החלק העליון של המזרק 50 מ ל.
      הערה: השתמש עוברי לפחות 30 לכל קבוצה ניסיונית. קבוצות ניסיוני יכול מורכב העוברים בקרה או מגוון רחב של מורפולינו או להזריק RNA עוברי. הכשלון ידרוש סכום כולל של-150 מ ל העובר בינוני להוסיף כל 8-10 דקות סחף את nocodazole תוך לעכב את הצמיחה MT עם קרח. שמירה על העוברים על הקרח הוא חיוני להצלחת assay הזה משום MTs אינם יציבים בטמפרטורות נמוכות, הקור מעכב הפיתוח עבור עוברי מוקדם.
   4. לאפשר MTs לצמוח לאחר 20 דקות של כשלון ב RT על-ידי העברת העוברים זכוכית פטרי המכילות חמים (28.5 ° C) העובר בינונית בעזרת פיפטה מזכוכית מלוטשת 1 מ"ל של אש. ברגע העוברים מועברים, להפעיל טיימר.
      1. לתקן את העוברים שטיפה ובקרה -1 דקות, 5 דקות, 10 דקות על ידי pipetting כ 10 עוברי לתוך mL 1.5 צנטריפוגה צינור מלא עם 1 מ ל- 4%-כדורגלן/MAB-תיקון (28.5 ° C), בעקבות ההוראות צעד 1.2.3.
4. הכין דוגמיות של immunolabeling כפי שמתואר סעיפים 1.3-1.5.
5. Immunolabel צף ומקטעים עוברי תמונה כמו שמתואר בסעיפים 1.6-1.10 עם השינויים הבאים למפרטי נוגדן ראשוני: שימוש שבערך ארנב אנטי-γ-טובולין, 1:200 העכבר אנטי-β-טובולין.
6. תהליך ולנתח תמונות בעזרת תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית, כפי שמתואר בשלב 1.12.

תוצאות

ניתוח של MTs יציבה ודינמית באמצעות immunolabeling
פרוטוקול 1, ההתפלגות של MT תת האוכלוסיות במהלך המוקדמות (קיל עצבית) ו- (מוט עצבית) מאוחר, שלבי הפיתוח שפופרת פגמים בתעלה מתגלה, באמצעות Glu-טובולין טובולין Tyr כסמני בשביל יציבה ודינמית MTs, בהתאמה. MTs דינמי שולטים ב- hind...

Discussion

כיום ישנן שיטות רבות הדמיה MT הדינמיקה של התפתחות מוקדמת של דג זברה, ועד הדמיה חיה של מולקולות מתויגות immunolabeling של קבוע רקמות^11,12,13,14. למרות MTs בתא יחיד יכולה להתקיים במצבים דינמיים או יציבה, epithelialization הוא תהליך שבו MTs בהדרגה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose			Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized.
Kpipes	Sigma	P7643
NaCl	Sigma	S7653
Tris-HCl	Sigma	T3253-500G
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
NP-40	American Bioanalyticals	AB01424
EGTA	Sigma	E3889-25G
MgCl2	Sigma	M2670-500G
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher	BP1605
Triton-x	American Bioanalyticals	AB02025
Anti-Fade mounting medium	Invitrogen	P10144
Mouse anti-β-tubulin	Developmental studies Hybridoma Bank	E7	1/200
Rabbit anti-γ-tubulin	Genetex	GTX113286	1/500
Rabbit anti-α-tubulin	Genetex	GTX108784	1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin	Millipore	AB3201	1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin	Millipore	ABT171	1/500
Mouse anti-centrin	Millipore	04-1624	1/1000
Goat 488 anti-rabbit	Thermofisher	A11008	1/500
Goat 594 anti-rabbit	Thermofisher	A11012	1/500
Goat 594 anti-mouse	Thermofisher	A11005	1/500
Goat 488 anti-mouse	Thermofisher	A11001	1/500
Vibratome	Vibratome	1500
Forceps	World Precision Instruments	555227F
100 mm petri dish	Cell treat	229693
35 mm petri dish	Cell treat	229638
50 ml falcon tube	Fisher	14-432-22
Woven nylon mesh 70 um	Amazon.com	B0043D1SZG
Micropipette	Gilson	F123602
Glass pipette	Fisher	NC-999363-9
Aquarium sealant	Amazon.com, by MarineLand	Silicone Sealer 1 oz (Tube)
Ring stand	Fisher	14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID	Cole-Parmer	WU-06417-21
Modeling clay	Amazon.com	Sargent Art 22-4000	Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp	Fisher	02-215-466
60ml syringe	Fisher	14-820-11
Embryo medium (E3)			34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.
Blocking Solution			50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6)			155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4)			160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software	PerkinElmer	Volocity (V 6.2)
Dry block heater	VWR	12621-108	Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope	Leica	MZ12
Confocal Microscope	Leica	SP5
Flat embedding mold	emsdiasum.com	BEEM 70904-01
Public domain image processing software	NIH	ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number