תסיסנית חיזור התניה כמדד למידה וזיכרון

Summary

פרוטוקול זה מתאר לימוד תסיסנית זיכרון assay שנקרא מיזוג חיזור. זה assay קלאסי מבוסס על צמצום התנהגות החיזור הגברי לאחר דחייה מינית על ידי נקבה לא נקלט מראש. צורה טבעית זו של גמישות התנהגותית יכולה לשמש לבחינת למידה, זיכרון לטווח קצר וזיכרון לטווח ארוך.

Abstract

תובנות רבות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס הלמידה והזיכרון הובאו לידי ביטוי באמצעות מבחני התנהגות פשוטים באורגניזמים דוגמת זבוב הפירות, תסיסנית מלנוגאסטר . תסיסנית שימושית להבנת הנוירוביולוגיה הבסיסית העומדת בבסיס הגירעונות הקוגניטיביים הנובעים ממוטציות בגנים הקשורים בהפרעות קוגניטיביות אנושיות, כגון נכות אינטלקטואלית (ID) ואוטיזם. עבודה זו מתארת ​​מתודולוגיה לבדיקת למידה וזיכרון באמצעות פרדיגמה קלאסית ב תסיסנית המכונה מיזוג חיזור. זכר טס לנקבות המשפט באמצעות דפוס ברור של התנהגויות בקלות לזהות. נקבות מוקדמות אינן קשורות להזדווגות, והן ידחו את ניסיונות ההזדווגות של הזכר. בתגובה לדחייה זו, זבובים זכרים מצמצמים את התנהגות החיזור שלהם. הפחתה מלמדת זו של התנהגות החיזור נמדדת עם הזמן, ומשמשת אינדיקציה ללמידה ולזיכרון. הבסיסי numeפלט Rical של assay זה הוא מדד החיזור (CI), אשר מוגדר כאחוז הזמן שגבר מבלה חיזור במהלך 10 דקות מרווח. מדד הלמידה (LI) הוא ההפחתה היחסית של CI בזבובים שנחשפו לנשיקה מוקדמת בהשוואה לזבובים נאיביים ללא מפגשים חברתיים קודמים. עבור השוואה סטטיסטית של LIs בין גנוטיפים, מבחן אקראי עם bootstrapping משמש. כדי להמחיש כיצד assay ניתן להשתמש כדי לטפל בתפקיד של הגן הנוגע למידה וזיכרון, נוקדון פאן עצבי של dyydroxyacetone פוספט acyltransferase ( Dhap-at ) היה מאופיין כאן. אורתולוג האדם של Dhap-at , glyceronephosphate O-acyltransferase ( GNPT ), מעורב ב- chondrodysplasia punctata type 2, תסמונת אוטוזומלית-רצסיבית המאופיינת במזהה חמור. באמצעות assay מיזוג חיזור, נקבע כי Dhap-at נדרש זיכרון לטווח ארוך, אבל לא עבורזיכרון לטווח קצר. תוצאה זו משמשת כבסיס לחקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים.

Introduction

המנגנונים המולקולריים שבבסיס הלמידה והזיכרון נשמרים בכל מיני מינים. חלוצי העבודה הקרנת תסיסנית melanogaster שורות מוטציה עבור פגמים הלמידה חוש הריח והזיכרון סיפקה מפתח תובנות מולקולריות לתוך התהליכים הבסיסית למידה וזיכרון ¹ . מחקרים אלה זיהו חלק מהגנים הראשונים המעורבים בלמידה ובזיכרון, כגון rutabaga ² , amnesiac ³ ו- dunce ⁴ , והם חושפים תפקיד קריטי עבור איתות מעגלי אדנוזין מונופוספט (cAMP) ⁵ .

מסכים גנטיים מוקדמים עבור מוטציות זיכרון נערכו בעיקר באמצעות מיזוג הריח. עם זאת, כמה שיטות למדוד צורות אחרות של למידה וזיכרון צמחו לאורך זמן. אחד הפרדיגמות למידה וזיכרון הנפוץ ביותר, ואת assay המתואר כאן, ידוע כ cהתאימות הראשונה, שתוארה לראשונה על ידי סיגל והול ⁶ וצורפה מאוחר יותר על ידי כמה קבוצות מחקר אחרות ^{7 , 8 , 9} . התנייה של החייבות תלויה בנוכחות של פרומון ספציפי, cis- acenate (cVA), על הבטן הנשית, אשר מופקד על ידי הזכר במהלך הזדווגות. חישה cVA על הבטן הנשית באופן טבעי מפחית התנהגות החיזור, וכאשר מצמידים עם מעשה של דחייה על ידי הנקבה, את ההשפעה של cVA על הפחתת החיזור הגברי הוא משופר באופן דרמטי. התגובה של זבובים זכרים assay זה ניתן לכמת בקלות על ידי התבוננות התנהגות החיזור שלהם, המאופיינת על ידי התמצאות לקראת ואחרי הנקבה, הקשה, הארכת ורטט את הכנף, ללקק, ולנסות copulation ¹⁰ ( איור 1 א ). זבובים זכר ללמוד distuisuis שעה בין דחייה מינית לבין נשים שאינן קשורות לרווחה, ואחרי דחייה מינית, הן מציגות התנהגות חיזור מופחתת כלפי נקבות שאינן קולטות עד 9 ימים ⁸ . זו התנהגות טבעית ניתן להשתמש כדי להבהיר את המנגנונים הבסיסית למידה, זיכרון לטווח קצר (STM), וזיכרון לטווח ארוך (LTM) ^{8 , 9 , 12} . הלמידה מוגדרת כהפחתה מיידית בהתנהגות החיזור המתרחשת במהלך תקופת האימון, והיא מכונה לעתים קרובות זיכרון זיכרון מיידי, שנמדד 0 - 30 דקות לאחר החשיפה לנקבה ^{6 , 8} . STM נמדד בין 30 דקות ו 1 שעה לאחר אימון, בעוד LTM נמדדת לרוב 24 שעות לאחר אימון ⁸ ( איור 1 ב ). STM יכול להיות המושרה באמצעות תקופת אימון 1-h, אבל זה נמשך רק 2-3 שעותS = "xref"> 6 ^{, 8} . ברוב פרדיגמות הלמידה, LTM יכול להיגרם רק על ידי התקפות שונות של אימון חוזר. מקברייד ואחרים . (1999) ⁸ הראו כי שלושה מפגשים, 1 שעות אימון פגישות היו מספיק כדי לעורר זיכרונות זיכרון שנמשך עד 9 ימים, בניגוד 2-3 שעות המושרה על ידי אימון אימון 1 שעה. מקברייד ואחרים . ⁸ הוכיחו גם כי אימון יחיד 5 שעות אימון הפיק תגובה דומה LTM עד 9 ימים. זבובים לא בית המשפט כל הזמן במהלך תקופה זו 5 שעות, למעשה לייצר אימון שלהם מרווחים כדי לעורר LTM בפגישה אימון אחד. זה חשוב מאוד מנקודת מבט מעשית, להגדיל במידה ניכרת את הקלות שבה assay זה יכול לשמש כדי לחקור LTM. פרוטוקולים הנוכחי בעיקר להשתמש בפגישה אימון יחיד של 7 שעות עבור LTM ^{11 , 12} . מספר מחקרים חקרו אחרתתנאי מוטציה שיש להם פגמים ספציפיים בהיבטים שונים של למידה חיזור. לדוגמה, אבלציה בגוף פטריות משפיעה על STM ו- LTM, אך לא לומדת ⁸ . מוטציות בגן אמנזיה, אשר הוגדר לראשונה כווסת מסוים של זיכרון באמצעות מיזוג הריח ³ , להשפיע STM אבל לא לומד ⁶ . הפרעה של הרגולטור תרגום orb2 (oo18 RNA מחייב (גלגל) CPEB2 subfamily) ו ecdysone איתות בלעדי השפעה LTM ^{9 , 13} . לפיכך, מיזוג חיזור הוא פרדיגמה שימושית לנתח את המנגנונים העומדים מאחורי השלבים השונים של הלמידה והזיכרון.

עבודה זו מדגימה הגדרה ניסיונית מותאמת המאפשרת את התפוקה גבוהה יחסית של התניה חיזור. יתר על כן, הוא מתאר סקריפט ניתוח סטטיסטי דן על גורמים קריטיים של assay. זה שמשלו כאן כי הגן תסיסנית Dihydroxyacetone acyltransferase פוספט ( Dhap-at ) נדרש נוירונים עבור LTM, אבל לא עבור STM. אורתולוג האדם של הגן הזה, גליצרונפוספט O-acyltransferase ( GNPAT ), הוא מוטציה ב- chondrodysplasia punctata type 2 ¹⁴ , הפרעה אוטוסומלית-רצסיבית המאופיינת על ידי נכות אינטלקטואלית חמורה, התקפים ועוד מספר מאפיינים קליניים. בהקשר זה, ניתן להשתמש בהתניה של חיזור כדי לאמת באופן פונקציונלי את תפקידם של גנים של מחלות אנושיות בלמידה ובזיכרון, המהווים בסיס למחקרים מכניסטיים.

Protocol

הערה: בפרוטוקול המפורט להלן, מתואר שכפול אחד של איסוף, הדרכה ובדיקה. על מנת לבדוק את שחזור של התוצאות, צעדים אלה יש לחזור במקביל, על ימים מרובים, עם קבוצות נפרדות של זבובים ( טבלה 1) . הפרוטוקול מבוסס על מחזור חיים של 10 ימים מ ביצה למבוגר, וזה נורמלי כאשר גידול זבובים בתנאים קבועים של 25 ° C, לחות 70%, ו 12 שעות אור / חושך מחזור. כל ההיבטים של פרוטוקול זה להניח כי התנאים נשמרים קבוע לאורך assay כולו. הטיימס מצויין כשעות לפני שהאורות נדלקים (BLO) או לאחר הפעלת האורות (ALO) באינקובטור, שכן ניתן לקבוע זאת בהתאם לזמן המועדף של החוקרים. השתמש גז CO ₂ רק עבור אוסף ראשוני של זבובים זכר נאיבי ולאסוף של נקבות מוקדמות. פרוטוקול זה עבור מיזוג חיזור מורכב מהפעולות הבאות:

1. ההקמת תרבויות אוסף נקבות
2. הקמת תרבויות לאיסוף נושאי המבחן הגברי
3. הכנת בלוקים למגורים
4. הקמת צלוחיות זיווג לייצור נקבות מתוקננות
5. אוסף הנושאים הנבדקים
6. הַדְרָכָה
7. בדיקה
8. ניתוח נתוני וידאו וסטטיסטיקות

1. הקמת תרבויות אוסף נקבות מוקדמות

1. הכנת צריכת חשמל ¹⁶ . מבושלים 0.8% (w / v) אגר, 8% (w / v) שמרים, 2% (w / v) שמרים לחלץ, 2% (w / v) פפטון, 3% (w / v) סוכרוז, 6% W / v) גלוקוז, 0.05% (w / v) MgSO ₄ , ו 0.05% (w / v) CaCl ₂ במים במשך 15 דקות. אפשר פתרון לצנן עד 70 ° C לפני הוספת 0.05% (w / v) methylparabene (זהירות: רעילים) ו 0.5% (v / v) חומצה propionic (זהירות: רעילים). מערבבים היטב על ידי ערבוב תוך הקירור עוד 50 מעלות צלזיוס כדי להשיג פתרון הומוגני.
2. לפני האוכל כךLidifies בטמפרטורת החדר, להוסיף ~ 50 מ"ל של powerfood לכל בקבוקון 175 מ"ל פלסטיק. אפשר למזון להתקרר עוד יותר. סגור את הבקבוקון עם תקע.
   הערה: Powerfood הוא תערובת מזון מיוחדת שנוסחה במיוחד עבור ייצור של מספר גדול של זבובים, ככל הנראה על ידי גרימת הנחת ביצים. Powerfood אינו משמש לייצר זבובים זכרים שישמשו לניתוח התנהגות (שלב 2), כי תזונה לא טיפוסית וצפיפות פוטנציאלית עשויה להשפיע על הפיתוח.
3. ביום -11 ( טבלה 1 ), להתחיל 5-20 wildtype תרבויות עם כ 60-100 זבובים (שילוב של זכרים ונקבות) בצנצנות כוח; אלה ישמשו בשלב 4 לייצר נקבה מתוקנת מראש ¹⁷ . הוסף נייר סינון לכל בקבוקון כדי להגדיל את האזור שבו הזחלים יכולים לגלול; זה יגדיל את מספר הזבובים שיכולים eclose.
4. מעת לעת לחזור על שלבים 1.1-1.3 לאורך הניסוי כדי לקבל מספיק חדשים eclosing זבובים כקלט עבור"הקמת צלוחיות זיווג לייצור של נקבות מקובלות מתוקנן" (שלב 4).

2. הקמת תרבויות לאספת נושאי המבחן הזכרי

1. הכנת מזון רגיל ¹⁶ , עשוי עם אגר 0.5% (w / v), 2.75% (w / v) שמרים, 5.2% (w / v) קמח תירס, 11% (w / v) סוכר, 0.05% (w / v ) Methylparabene, ו 0.5% (v / v) חומצה propionic במים, כמתואר צעדים 1.1 ו 1.2. סגור את בקבוקי פלסטיק 175 מ"ל עם פקק בקבוקון לעוף.
2. ביום -10 ( טבלה 1 ), מקום על 10-20 גברים עם כ -30-75 נקבות בתולה ( חומרים / לוח ציוד ) בכל בקבוקון 175 מ"ל המכיל מזון רגיל. הוסף נייר סינון כדי להגדיל את פני השטח עבור גולם כדי למקסם את הפרודוקטיביות.
3. להקים שלושה עד שישה בקבוקי 175 מ"ל לכל גנוטיפ כדי לקבל את המספר הנדרש של גברים הנושא הבדיקה.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך בבקבוקים נוספים, בהתאם לפרודוקטיביות של הגנרטור הרצויOtype.

3. הכנת בלוקים למגורים ( איור 2 א )

1. ממיסים כ 50 מ"ל של powerfood לכל בלוק דיור במיקרוגל, או להכין אותו טרי.
2. הוסף 500 μL של powerfood היטב של בלוק 96-היטב, שטוחה התחתון באמצעות פיפטה multidispenser.
3. אפשר מזון כדי לחזק בטמפרטורת החדר.
4. לכסות את אבני עם סרט PCR דבק ולהשתמש מחט לעשות לפחות 4 חורים לכל היטב כדי לספק אוויר צח כדי זבובים.
5. כדי להיות מסוגל לפתוח כל טוב, להשתמש סכין גילוח לחתוך את הסרט דבק לאורכו בין כל שורה. השאירו את הסרט שלם על קצה אחד של הבלוק.
6. בלוקים ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 ימים.
   הערה: אפשרו ל בלוקים להתאזן מחדש לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

4. הקמת בקבוקי זיווג לייצור נקבות מוקדמות מתוקננות

1. ביום -1, הסר ולהשליך את כל הזנים wildtype למבוגרים מן התרבויות אוסף נקבה שנקבע ב 2-5 שעות BLO.
2. איסוף זבובים באמצעות aspirator ( איור 2 ב ) מן בקבוקונים אלה במרווחים 2-3 ל -3 שעות ( למשל, ב 30 דקות, 2.5 שעות, ו 5 שעות ALO) ומניחים אותם בקבוקון Powerfood חדש בתוספת כמות קטנה של שמרים להדביק נייר סינון.
3. כדי למנוע צפיפות ולקדם אווירה אופטימלית ההזדווגות, לא להעביר יותר מ 150-200 זבובים לכל בקבוקון חדש. להבטיח את ההזדווגות של כל הנקבות על ידי מתן לפחות 25% זכרים. ודא כי נקבות מספיק נמצאים צלוחיות החיבור כדי להתאים את גודל הניסוי.
   הערה: כמו זה הוא צעד מכריע בפרוטוקול, ודא כי זבובים eclosed טריים ולא זבובים זקנים, זחלים, או גלמים מועברים בקבוקון ההזדווגות החדש.
4. דגירה אלה "צלוחיות הזדווגות" במשך ארבעה ימים כדי לאפשר זמן מספיק עבור כל הנקבות יש מזדווגות.

5. קולזכאות של נושאים לבדיקת זכרים

1. ביום 1 ( טבלה 1 ) ב 2-3 שעות BLO, השתמש CO ₂ כדי להסיר את כל הזבובים למבוגרים מן בקבוקוני אוסף זכר (שלב 2), אבל לתת עוד זבובים eclose במהלך השעות הקרובות.
2. במהלך 5-6 שעות הבא, להסיר זבובים eclosed החדש כל 20-30 דקות באמצעות CO ₂ ולשים כל זכר בבאר הפרט של בלוק הדיור (שלב 3) באמצעות aspirator ( איור 2 ב ).
3. Re- החותם היטב עם הסרט PCR דבק.
   הערה: זהו צעד מכריע בפרוטוקול. יש לאסוף את הזכרים לעתים קרובות. הזכרים שנאספו צריכים להיות מבודדים בבלוק הדיור הקרובה לזמן ההזיה, כאשר הם מדגימים פיגמנטציה בהירה ואת נוכחותו של המקוניום בבטן השקופה.
   הערה: שימוש עדין של aspirator מאפשר העברת זבובים; עם זאת, שימוש לא הולם ידגיש את הזבובים, שגורם שונות assay (ראה דיון).
4. המטרה לשתףLlect עד 48 גברים לכל גנוטיפ. זה מספק עודף קטן למספר הזכרים המקסימלי הדרוש לניתוח של התנאים נאיבי ומאומן, המאפשרים הפסד במהלך הצעדים העברה מאוחר יותר.

6. הדרכה

1. הסר את הזבובים מן הבקבוקון החיבור (שלב 4.2) באמצעות CO ₂ ולהפריד את הנקבות שהוזמן מן הזכרים.
2. באמצעות aspirator, להוסיף נקבה אחת הרדים, מוקדמת כל טוב בשורה אחת של בלוק דיור חדש.
3. באמצעות aspirator וללא הרדמה, להעביר זכר נאיבי בודדים מן הבלוק דיור להגדיר בשלב 5.2 אל המכיל גם נקבה מראש. לאחר הזכר ממוקם לתוך הבאר, מחדש לאטום מיד עם הסרט דבק; אל תתנו לגבר להימלט.
   הערה: העברת זבובים זכר מן aspirator כדי לחסום את הדיור על ידי ניצול שלהם טבעי "geotaxis שלילית" התנהגות (ראה דיון).
4. חזור על שלבים6.2-6.3 עד שייווצרו זוגות זכריים ונקביים. באופן אידיאלי, להקים 24 זוגות, שתי שורות של בלוק מגורים, לכל גנוטיפ. השאירו את הזכרים נאיבי הנותרים בבלוק הדיור המקורי להגדיר בשלב 5.2.
5. השאירו את הזוגות זכר ונקבה ללא הפרעות במהלך תקופת האימון ( טבלה 2 , איור 1 ב ).
   הערה: במהלך הזמן הזה, הזכר יידון ויידחה על ידי הנשיאה. עבור למידה STM, תקופת האימונים היא 1 שעות ו LTM, תקופת האימון הוא 7-9 שעות.
6. סוף האימון ( טבלה 2 , איור 1 ב ) באמצעות aspirator כדי להפריד בעדינות את הזכר מן הנשי שהוזמן; אין להשתמש בהרדמה. מניחים את הזכר המופרד בבלוק מגורים חדש.
7. השתמש aspirator להעביר את כל הזכרים נאיבי בעדינות וללא הרדמה מתוך בלוק הדיור להגדיר בשלב 5.2 כדי בלוק דיור חדש.
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי עבור STM ו לאהאבל זה מאוד חשוב עבור LTM כי זבובים הם שוכנו במשך 24 שעות נוספות כדי לבדוק LTM.
8. עבור STM ו LTM, לאפשר לזכרים לנוח 1 שעות ו - 24 שעות, בהתאמה ( טבלה 2 , איור 1 ב ) לפני בדיקה (שלב 7).
9. עבור למידה, מיד לבדוק את הזכרים מאומן ונאיבי (שלב 7).

7. בדיקה

1. איסוף זבובים מ צלוחיות החיבור (שלב 4.2) באמצעות CO ₂ להפריד את הנקבות שהוזכרו מן הזכרים.
2. תן לנקבות להתאושש מההרדמה במשך שעה אחת לפחות בבקבוקון המכיל מזון רגיל.
3. הר את מקליטי וידאו מראש ( איור 2 ג ), על מנת לקבל את כל הציוד מוכן לפני תחילת הבדיקה.
4. התחל את הבדיקה על פי לוחות הזמנים השונים ללמידה, STM, ו LTM ( טבלה 2 , איור 1 ב ). בצע בדיקות מיד לאחר האימוןעבור למידה, 1 h לאחר אימון עבור STM, ו 24 שעות לאחר אימון עבור LTM.
5. שימוש באספירטור, העבירו בעדינות זכר יחיד מהגוש או מבית האימון, אם הלמידה נבחנת (שלב 6.7, מאומן, שלב 6.8, נאיבי) למחצית זירת החיזור עם סגירת המחיצה ( איור 2 ד ראה קובץ S1 לתכנית בניין).
   הערה: השימוש של התנהגות "geotaxis" שלילי טבעי צריך להיות מספיק כדי להעביר את הזבובים זכר מן aspirator לזירת החיזור (דיון).
6. במהירות אבל בעדינות להזיז את חור הכניסה לזירה הבאה לחזור על שלב 7.5 עד כל 18 זירות להכיל זכר אחד.
7. באמצעות aspirator וללא CO ₂ , להוסיף נקבה אחת מראש (שנאספו בשלב 7.2) אל החצי השני של כל 18 זירות.
8. בזהירות מקום תא החיזור מתחת למצלמה, עם פתיחת הבארות פונה כלפי מטה ( איור 2 ג ).
9. הסר את המחיצה של הזירות כדי לאפשר אינטראקציה ישירה בין הזכרים ונקבות מוקדמות.
10. מיד להתחיל להקליט את ההתנהגות במשך 10 דקות לפחות.
    הערה: בעת שימוש בהגדרה של שתי מצלמות, ניתן לבצע הקלטה מקבילה של שתי לוחות חיזור בזמן חופף בזמן כדי למקסם את היעילות.
11. רוקן את זירות החיזור באמצעות שואב אבק ידני ולאפשר חדר החיזור לאוורר לפני שימוש חוזר.
12. חזור על שלב 7.4-7.11 עד בדיקה של כל גנוטיפים ותנאים ( כלומר, נאיבי ומאומן) הושלמו.

8. ניתוח נתוני וידאו וסטטיסטיקות

1. חישוב מדד החיזור (CI), שהוגדר כאחוז הזמן כי בתי המשפט זכר במהלך 10 דקות הראשון של תקופת הבדיקה, עבור כל זבוב זכר יחיד.
   הערה: זה יכול להיעשות באופן ידני על ידי התבוננות התנהגות חיזור סטריאוטיפית ( איור 1 א ) או על ידי Uלשיר תוכנת מחשב לכימות אוטומטי של התנהגות החיזור (דיון).
   הערה: מומלץ לנתח 40-60 זכרים לתנאי במשך שלושה ימים על מנת להשיג כוח סטטיסטי מספיק ולשפוט את העקביות של נתוני ה- CI.
2. חישוב מדד הלמידה (LI), המוגדר כאחוז הפחתה ב- CI הממוצע של זכרים מאומנים בהשוואה לזכרים נאיביים (LI = (CI _נאיבי - CI _מאומן ) / CI _נאיבי ). להעריך את LI עבור כל יום של בדיקות ולהשוות אותו LI המצטבר מחושב מכל ימי בדיקות משולב.
3. יצירת נפרד שני טורים טור נתונים עם "Genotype" ו "CI" כמו כותרות.
   הערה: כותרות אלה הן רגישות לרישיות. השם של הגנוטיפ עבור כל CI חייב לכלול תיאור של הגנוטיפ ואחריו קו תחתון ותנאי ההכשרה ( לדוגמה, genotype_N ו- genotype_LTM, וכו ', כאשר N = נאיבי ו- LTM = לטווח ארוךזיכרון; ראה קובץ S2 משלים לדוגמה). ביאור זה הוא חיוני, כמו analearn את הפונקציה יהיה לזהות זומבים מאומן ונאיבי מבוסס על הדמויות הנוכחיות לאחר הדגש הראשון בעמודה "גנוטיפ".
4. השתמש בתסריט R האנלוגי (קובץ משלים S3) כדי לבצע בדיקת אקראיות כדי לשפוט את המשמעות הסטטיסטית של הבדלים בין ערכי LI מגנוטיפים שונים.
   1. מקור סקריפט (קובץ משלים S3) לתוך R ¹⁸ , אשר מגדיר פונקציה בשם "analearn".
      הערה: הגדרת הפונקציה היא: אנלוגיה = פונקציה (nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, כותרת = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. הפעל את הפונקציה על ידי הזנת "analearn ()" בשורת הפקודה R ובחירת קובץ הנתונים לניתוח (המיוצר בשלב 8.3) דרך החלון המוקפץ.
   3. בחר את המוטציה התייחסות, אשרהוא גנוטיפ שליטה, על ידי הזנת מספר המקביל הקשה על Enter.
      הערה: לאחר בחירת הגנוטיפ הייחוס, הסקריפט לוקח מספר שניות כדי לבצע 10,000 משכפפי Bootstrap.
   4. שים לב לטבלת הפלט (טבלה 3), המכילה את הגנוטיפ, מצב הלמידה ( כלומר, למידה, STM או LTM), כלומר CI נאיבי, ממוצע CI מאומן, LI, ההבדל בין LI של שליטה לעומת המצב הניסויי (LI dif), הגבול התחתון (LL) והגבול העליון (UL) של רווח סמך 95% של LI dif, ו- p -value המעידים על ההסתברות שאין הבדל משמעותי.
      הערה: analearn ישמור קובץ טקסט של פלט בספריה שבה נמצא קובץ הנתונים. עם זאת, טבלת הפלט מופיעה גם במסוף R-Studio. שם ברירת המחדל נבנה על פי שם קובץ הנתונים שסופק.
   5. ישנם מספר ארגומנטים בפונקציה analearn שניתן להשתמש בהם כדי לשנות את דההגדרות תקלות של הפונקציה כדי להתאים את הפרמטרים של bootstrapping.
      הערה: "nboot" מגדיר את מספר משככי האתחול ומוגדר כ- 10,000 כברירת מחדל. ערך זה יכול להשתנות למספר שלם שלם גדול מאפס. טבלה 5 מגייסת מספר ארגומנטים שניתן להשתמש בהם כדי לשנות את הגדרות ברירת המחדל של הפונקציה. עם זאת, לא מומלץ להשתמש בנתונים המיוצרים עם מספר נמוך של משכפל אתחול.

תוצאות

בחיישן מיזוג החיזור ניתן להשתמש כדי למדוד למידה וזיכרון תסיסנית . כדי להדגים זאת, התוצאות המוצגות כאן לנתח STM ו LTM בזבובים שליטה לעומת זבובים עם מציאה נוירון ספציפי של Dhap-at. בקרת גברים מבטאים רצף רצף התערבות רנ"א מיקוד הגן eenans ספציפי Caenorhabditis , אצבע אבץ משוערת C02F5.12 ¹⁹ . זן בקרה זה מבטיח מספר שווה של רצף מפעיל רצף (UAS) אלמנטים בין מציאה ושליטה באותו רקע גנטי, ואת RNAi שליטה סיכות חשבונות עבור כל ההשפעות הלא ספציפיות של מערכת RNAi. ( איור 3 א ' , p = 1.2 x 10), ראה איור 3 א ' , p = 1.2 x 10, p = 1.2 x 10 ^{/ 4} , מאן- WhitneY- מבחן) ו LTM ( איור 3 ב , p = 1.2 x 10 ^-4 , מאן- Whitney U- מבחן). תוצאה זו משקפת את היכולת הנורמלית ללמידה ולזיכרון בזבובים אלה. כמו כן, ניתן לראות ירידה משמעותית של CI בזבובים מוכשרים לעומת נאיביים עבור STM ( איור 3 א ' , p = p = K411437} VIE-260B / +, elav-Gal4 / + ) 1.2 x 10 ^-4 , Mann-Whitney U-test). עם זאת, הם לא מראים ירידה משמעותית CI לאחר אימון LTM ( איור 3 ב ' , p = 0.33, מאן וויטני U- מבחן). מבחן ה- Mann-Whitney U שימש כדי להשוות את ה- CI הממוצע של זבובים נאיביים ומאומנים בשל ההתפלגות הלא-פרמטרית של נתוני ה- CI לתנאים מסוימים ( איור 3 א ו -3 ב ). ההבדלים שנצפו באמצעות ניתוח של CIs משתקפים על ידי LI עבור כל גנוטיפ, אשר מודד את אחוז ratctiב CI ב נאיבי לעומת זבובים מאומן ( איור 3 ג ). אין הבדלים משמעותיים ב- LI בין הבקרות ל- Dhap - בזבובים המכווצים ל- STM ( p = 0.115, 10,000 משככי bootstrap, איור 3C , טבלה 3 ), בעוד שה- LI ל- LTM נמוך משמעותית ב- Dhap - בזבובים מוחזקים ( p = 0.0034, 10,000 משכפל bootstrap, איור 3 ג , טבלה 3 ). לשם השוואה של LI בין גנוטיפים, מבחן אקראיות ²⁰ מותאם לשיטה המומלצת לראשונה על ידי Kamyshev et al. ⁷ היה בשימוש. מאחר שה- LI הוא ערך יחיד הנגזר מנתוני אוכלוסייה ( כלומר, ממוצע CI-naïve ו- CI מאומן), שיטות סטטיסטיות סטנדרטיות המסתמכות על חלוקות נגזרות ניסוייות אינן חלות. מבחן האקראיות הוא ללא הפצה ומשתמש bootstrapping ( כלומר, sampli אקראיתNg עם החלפת) כדי ליצור ערכות נתונים היפותטיים נגזרות הנתונים בפועל. התסריט analearn (קובץ S3) מייצר קבוצה של LIs היפותטי עבור כל גנוטיפ ומחשב את ההבדל בין השליטה לבין גנוטיפ הבדיקה (LIdiff). תהליך זה חוזר על עצמו 10,000 פעמים, והערכים המתקבלים משמשים לקביעת רווח סמך 95% של LIdiff ( טבלה 3 ). נתונים אלה משמשים ליצירת p -value המציין את ההסתברות ש- LI של שני הגנוטיפים שונה. התוצאות המוצגות כאן מראות כי Dhap-at נדרש נוירונים עבור LTM אבל לא עבור STM.

כדי לשלוט על השתנות יומיומית, CIs ו LIs מושווים בין ימים לשכפל ( טבלה 4 ). למרות כמה תנודות LI הוא ציין מיום ליום, התוצאות הן לשחזור בדרך כלל. חשוב לציין כי נתונים CI יכול להשתנות במידה רבה בהתאם str הבקרהAin משמש את התנאים הסביבתיים של בדיקות. נתוני ה- CI המוצגים כאן אופייניים לגנוטיפ זה, אך גנוטיפים אחרים עשויים להפגין CI גבוה יותר או נמוך יותר והפצה.

איור 1: קביעת מדד החובה והסקירה הניסויית. ( א ) תמונות המציגות סטריאוטיפיות התנהגות חיזור זכר כלפי זבוב נקבה. שלבים שונים של התנהגות החיזור מוצגים: אוריינטציה (I), בעקבות (II), רטט כנף (הרחבה) ו הקשה (III), ליקוק (IV), וניסיון הזדווגות (V). ( ב ) סקירה סכימתית של אימונים ובדיקות פעמים ביחס מחזור האור החממה, מסומן שעות. זמני ההדרכה מסומנים עם סרגלים, תקופות מנוחה עבור STM ו- LTM מסומנות בקו מקווקו, ונקודת ההתחלה של הבדיקה מסומנת כחץ. שים לב כיזמן בדיקה עבור LTM הוא יום לאחר אימון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: ציוד המשמש assay תביעה תסיסנית חמור. ( א ) בלוק הדיור הוא שטוח, גוש תחתון עם 500 μL של powerfood לכל טוב. הוא חתום עם סרט דבק qPCR עם לפחות 4 חורים לכל טוב שנוצרו באמצעות מחט מזרק עם 0.8 מ"מ קוטר. שורות בודדות נחתכים לאורכים לרצועות באמצעות סכין גילוח כדי לאפשר פתיחה וסגירה. ( ב ) האספירטור נדרש להעברה עדינה של זבובים זכרים ונקבות ללא שימוש בהרדמה. את הבלעה מראה את קצה של aspirator, סגור עם חתיכת כותנה כדי keEp זבובים בתוך קצה. ( ג ) הגדרת מערכת של שתי מצלמות עבור הקלטה בו זמנית של שני חדרי חיזור. ( ד ) חדר חיזור עם 18 זירות. חורי כניסה הזזה משמשים כדי למקם את הזבובים בזירות. את המחיצות הלבנות ניתן לפתוח בו-זמנית כדי ליזום אינטראקציה בין הזכרים לנקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: ניתוח של STM ו LTM שליטה ו Dhap- לעבר זבובים נודדאון. ( AB ) Boxplots מראה את ההתפלגות של ערכי CI עבור נאיבי (N) ו מאומנים (T) זבובים של שליטה (אפור) ו Dhap ב גנוטיפים מציאה (לבן) נבדק STM (A) ו LTM (B). ( ג ) CorrespoNding ערכי LI עבור שליטה Dhap- לעבר זבובים מציאה נבדק STM ו LTM. הבדלים ב- LI בין גנוטיפים של בקרה וגרירה הושוו באמצעות בדיקה אקראית (10,000 משככי bootstrap). שורות שגיאה מציינות את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע הנגזר מערכי LI המחושבים בימי בדיקה שונים. הגנוטיפים הם: w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE-260B / + ; ו elav-Gal4 / + (שליטה) ו- w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE-260B / +; ו elav-Gal4 / + ( Dhap-at -RNAi). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

	כללי	לאסוף	רכבת	מִבְחָן
ליום19	התחלה מוקדמת אוסף תרבויות נקבה (שלב 1.3)
עמ space	התחלה תרבויות עבור אוסף של נושאים מבחן זכר (שלב 2.2)
יום 1		נציג. 1
יום 2		נציג. 2
יום 3		נציג. 3
יום 4		נציג. 4	נציג. 1
יום 5			נציג. 2	נציג. 1
יום 6			נציג. 3	נציג. 2
יום 7			נציג. 4	נציג. 3
יום 8				נציג. 4
יום 9	ניתוח נתוני וידאו ונתונים סטטיסטיים (שלב 8)
Rep = לחזור

טבלה 1 : דוגמה ציר זמן לבדיקת LTM מעל שלושה משכפל בימים בודדים.

	לְמִידָה	STM	LTM
זמן אימון	1 ח.	1 ח.	8 שעות.
זמן מנוחה	0 ח.	1 ח.	~ 24 שעות.
להתחיל אימון	0ח. ALO	0 ח. ALO	4 שעות. BLO
להפסיק אימון	1 ח. ALO	1 ח. ALO	4 שעות. ALO
מבחן התחלה	1 ח. ALO	2 ח. ALO	0 ח. ALO (למחרת)
ALO = לאחר הפעלת האורות, BLO = לפני הפעלת האורות, STM = זיכרון לטווח קצר, זיכרון לטווח ארוך LTM =

טבלה 2 : משך ההכשרה, זמני ההדרכה, ובדיקת זמני למידה, STM ו- LTM.

גנוטיפ	לְמִידָה מַצָב	CI תמים	CI מְאוּמָן	לי	LI הֶבדֵל	גבול תחתון (95% מרווח ערנות)	גבול עליון (95% מרווח ערנות)	P-value
לִשְׁלוֹט	STM	0.467	0.116	0.752	NA	NA	NA	NA
Dhap-at-RNAi	STM	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.030	0.265	0.116
לִשְׁלוֹט	LTM	0.590	0.384	0.348	NA	NA	NA	NA
Dhap-at-RNAi	LTM	0.697	0.650	0.068	0.280	0.103	0.446	0.003

לוח: 3 נתונים סטטיסטיים המופקים מתוך התסריט האנליסטי.
נתונים סטטיסטיים המיוצרים מתוך התסריט analearn. קובץ הפלט של התסריט R-script של bootstrapping המכיל את הגנוטיפ, מצב הלמידה ( כלומר, למידה, STM או LTM), פירושו CI נאיבי, כלומר CI מאומן, LI, ההבדל בין LI של שליטה לעומת מצב ניסויי (LI dif) , הגבול התחתון (LL) והגבול העליון (UL) של רווח סמך 95% של LI dif, ו- p -value המציין את ההסתברות שאין הבדל משמעותי.

		לִשְׁלוֹט			Dhap-at-RNAi
		ממוצע CI נאיבי	ממוצע CI מאומן	LI	ממוצע CI נאיבי	ממוצע CI מאומן	LI
STM	יום 1	0.300	0.125	0.584	0.679	0.239	0.648
	יום 2	0.634	0.107	0.831	0.720	0.276	0.617
	כל הימים	0.467	0.116	0.752	0.699	0.257	0.633
LTM	יום 1	0.590	0.441	0.252	0.630	0.646	-0.027
	יום 2	0.640	0.363	0.432	0.709	0.710	-0.002
	יום 3	0.547	0.349	0.363	0.738	0.598	0.190
	כל הימים	0.590	0.384	0.348	0.697	0.650	0.068

טבלה 4 : ערכי CI ו- LI שהושגו בימי בדיקה נפרדים.

"Naivelevel" קובע את הטקסט שיזהה ערכים נאיביים עבור כל גנוטיפ. ברירת המחדל היא "N", אבל זה יכול להיות שונה לתוך כל טקסט אחר alphumerical.

"Refmutation" מוגדר "NA" (לא ישים) כברירת מחדל, אך ניתן לשנות את שם הבקרה או הגנוטיפ על מנת לבצע השוואות סטטיסטיות. זה יגרום sCript כדי לבחור באופן אוטומטי את הגנוטיפ לשלוט.

"Datname" מתייחס לשם קובץ הנתונים וניתן לציין בארגומנט זה במקום את בחירת הקובץ המוגדרת כברירת מחדל.

"Header" יכול לשמש כדי לציין אם קובץ הנתונים מכיל כותרות עמודות או לא. ברירת המחדל היא "TRUE", אך ניתן להשתמש בקובץ ללא כותרות כאשר הארגומנט הזה משתנה ל- "FALSE".

"Seed" מאתחל את מחולל המספרים האקראיים.זה מוגדר כברירת מחדל ל- "NA" ומבטיח מספר אקראי בכל פעם שהתסריט נמצא בשימוש. לפי עיצוב, ניתוח Bootstrap ייתן תוצאות שונות במקצת בכל פעם שהוא פועל, גם בעת שימוש באותו קובץ נתונים. כאשר הזרע מוגדר על ידי מספר שלם שלם גדול מאפס, אותה קבוצה של דוגמאות bootstrap אקראי מתקבל.

"לכתוב במלואו לשים "ניתן להגדיר" TRUE "או" FALSE "כדי לקבוע אם קובץ הפלט ייווצר. ברירת המחדל היא "TRUE".

טבלה 5: ארגומנטים המשמשים פונקציה Analearn שיכולים לשנות את הגדרות ברירת המחדל של הפונקציה כדי להתאים את הפרמטרים של Bootstrapping

קובץ משלים S1: תוכנית בניין של חדר החיזור. ניתן לפתוח את הקובץ עם כל יישום המאפשר הרחבות .stp (קבצי CAD) . לחץ כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים S2 : דוגמה לקובץ קלט עבור Script Analearn .S2.zip "target =" _ blank "> לחץ כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים S3 : כתב העת Analearn.R. ניתן לפתוח את הקובץ עם R-studio ¹⁸ . לחץ כאן להורדת הקובץ.

Discussion

חיזור מיזוג החיזור הוא פרדיגמה קלאסית לניתוח של למידה וזיכרון תסיסנית . הפרוטוקול המוצג כאן כדלקמן המתודולוגיה הכללית שתוארה בעבר ^{6 , 7 , 8 , 9} אבל כולל היבטים ייחודיים כגון הנחיות מעשיות, ציוד מיוחד, ניתוח סקריפט נתונים ^{9 , 12} עבור בדיקות אקראיות. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לנתח מספרים גדולים של זבובים במקביל באמצעות 96-גם שטוחים בתחתית בלוקים ( איור 2 א ) לאסוף ולאמן זכרים. בלוקים הם אטומים עם סרט PCR דבק, מה שהופך את הזבובים נגיש בקלות בעת הצורך. בנוסף, חדרי החיזור הייחודיים המתוארים כאן מאפשרים זיווג סימולטני של 18 זוגות זכר לנקבה בחלל דו-מימדי כמעט שאניS אופטימלי לניתוח וידאו. החדרים מותאמים אישית חיזור קל לשימוש, תוכנית הבנייה מסופק ( קובץ S1 , איור 2 ד ). פרוטוקול זה, מן הקמת תרבויות המשמש לאסוף נושאים הבדיקה לרכישת נתוני וידאו, לוקח בערך 20 ימים ( טבלה 1 ). נדרש זמן נוסף לניתוח נתוני וידאו. מניסיוננו, אסאי STM הוא חזק מאוד. Assay LTM הוא גם חזק למדי, אבל זה יותר רגיש משתנים סביבתיים confounding ולכן יכול להיות קשה יותר לשלוט.

התנהגות בעלי חיים יכולה להיות משתנה למדי. לכן, צעדים קריטיים בפרוטוקול חייב להיעשות בזהירות כדי לצמצם את השונות. ראשית, שימוש עדין של aspirator ( איור 2 ב ) יפחית את הלחץ כי ניתן להטיל על ידי טיפול מחוספס או על ידי נושבת החוצה חזק מדי. שיטה מוצעת להעברת הפרטזבובים מתוך aspirator היא באמצעות geotaxis שלילי. כמו זבובים נוטים ללכת למעלה, אפשר פשוט להצביע על קצה של aspirator למעלה; בדיוק לפני שהטוס מגיע לקצה, מכה עדינה מספיקה כדי לאפשר לזבוב לצאת החוצה. בנוסף, כדי לתת לזכרים לתאי החיזור לפני הבדיקה, מכה לעתים קרובות לא הכרחי.

צעד חשוב נוסף הוא האוסף והדיור של נושאי המבחן הגברי. יש לאסוף את כל הגברים כאשר הם צעירים מאוד ונאיביים חברתית. זה יכול להיות מושגת על ידי איסוף תכופים בתקופות השיא של eclosion (שלב 5.2). אם גברים אינם נאספים בפרק זמן קצר זה, הם יכולים להיות אינטראקציות חברתיות מוקדמות, אשר עלול לגרום למידה לקויה או השתנות גבוהה ב- CI. גורם נוסף של נבדקי הניסוי הגברי שיש להעריך הוא הרקע הגנטי. רקע גנטי שונה יציג רמות שונות של חיזור נאיבי ויכול גם להיות שונה בפעילות הכללית או ביכולת התנועה. כאשר compaריבוי גנוטיפים, יש להקפיד על הרקע הגנטי כדי למנוע את הגורמים המבלבלים שעלולים להשפיע על ציוני LI. בנוסף, יש לנתח בקפידה את התפלגות נתוני ה- CI. נתוני CI יכולים להיות פרמטריים ולא פרמטריים, בהתאם לגנוטיפ או לגורמים סביבתיים אחרים. במקרים מסוימים, אם ההתפלגות של CI מופחתת באופן דרמטי מהתפלגות נורמלית, עדיף להשתמש בחציון CI במקום בממוצע לחישוב LI. עם זאת, מניסיוננו, השימוש ב- CI החציוני או הממוצע אינו משפיע על הפרשנות הסטטיסטית של הנתונים, והשימוש ב- CI הממוצע הוא הנוהג המקובל בספרות.

עבור החיזור מוצלח החיזור, הדחייה הפעילה של ניסיונות חיזור הגבר על ידי הנקבות שנקבע הוא חיוני במהלך תקופת האימון. חשוב לוודא כי נקבות שהשתמשו בעבר assay זה כבר הזדווגות ביעילות והםובכך לא מאפשר הזדווגות. זה preating הוא הקים את צלוחיות הזדווגות שהוכנו בשלב 4, שבו הזכרים והנקבות טסים שוכנים יחד במשך 4 ימים ( טבלה 1 ). לאחר מכן, ההזדווגות ניתן לפקח על ידי בדיקה סדירה של בדיקות קטעי וידאו על ידי התבוננות זוגות זכר ונקבה במהלך האימון. אם ההזדווגות מתרחשת, ישנם מספר צעדים שניתן לנקוט במהלך הכנת נקבות מוקדמות. ראשית, נקבות נקבות צריך להיות reared בתנאים הרבייה אופטימלית. בקבוקונים ניתן להשלים עם שמרים להדביק נייר מקופל מסנן להגדיל משטחי ההזדווגות הפוטנציאליים. הדגירה של זבובים בתנאים המתוארים כאן יצרה בעבר נקבות חזקות ומוצקות, אך זה עשוי להשתנות במעבדות שונות ובשימוש בזנים גנטיים שונים. לכן, ייתכן שיהיה צורך לייעל את הדור של נקבות על ידי שינוי זמן הדגירה ותנאי.

כימות התנהגות החיזור היאצעד קריטי נוסף בפרוטוקול זה. זה יכול להיעשות באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנות מיוחדות ⁹ . כימות אוטומטי הוא מהיר, באופן עקרוני, משוחדת. מספר תוכניות פורסמו ^{21 , 22 , 23} ; עם זאת, הם אינם פשוט לשימוש, לעתים קרובות הדורשים פורמטים של וידאו מיוחדים ומיומנויות חישוב מתקדמות. כימות ידני הוא קל ומדויק, אבל זה מאוד עבודה אינטנסיבית כפוף השתנות הפרט הטיה. חשוב להדגיש כי פרוטוקול זה אינו עונה על הדרישות של עיצוב וידאו, כי הם נדרשים פוטנציאליים עבור כימות אוטומטי של CIs. עבור כימות ידני, להשתמש בכל מכשיר הקלטה פשוטה וידאו שיש לו את הפוטנציאל לייצר וידאו באיכות מספקת כדי לצפות במדויק התנהגות החיזור. עבור כימות אוטומטי, סביר להניח שיהיה שונהדרישות בהתאם לתוכנה בשימוש, והמשתמשים צריכים לחקור את זה ביסודיות אם כימות אוטומטי הוא הרצוי.

בשילוב עם הכלים הנרחבים הזמינים עבור המניפולציה הגנטית של זבובים, assay מיזוג החיזור מספק readout חזקים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח מנגנונים מולקולריים רשתות עצביות המעורבים למידה וזיכרון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-