JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת קצבית רשת עצבית theta ו תנודות גמא מ הכנה בהיפוקמפוס שלם מבודד. אנו מתארים את השלבים ניסיוני מן החילוץ של ההיפוקמפוס לפרטים של שדה, יחידית תא שלם קליפת הקלטות מהדק, כמו גם צעדה optogenetic של קצב theta.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת והקלטה של ​​ההיפוקמפוס כולו מבודד, של WT ו עכברים מהונדס, יחד עם שיפורים האחרונות במתודולוגיות ויישומים לחקר תנודות תטה. אפיון פשוט של ההכנה בהיפוקמפוס מבודדת מוצג לפיה היחסים בין מתנדים תטא בהיפוקמפוס פנימי נבדק יחד עם פעילות של תאים פירמידליים, ו intereurons GABAergic, של Cornu ammonis-1 (CA1) ותת תחומים (SUB) אזורים. בסך הכל, אנו מראים כי ההיפוקמפוס מבודד מסוגל לייצר תנודות תטה מהותי במבחנה וכי קצביות שנוצר בתוך ההיפוקמפוס ניתן מניפולציה מדויקת על ידי גירוי optogenetic של intervalons חיובי parvalbumin (PV). ההכנה במבחנה מבודדת בהיפוקמפוס מציעה הזדמנות ייחודית להשתמש בשדה סימולטני ובתקן תאיים קליפ תיקון של ניאו מזוהה חזותיתRons כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי הדור קצב.

Introduction

תנודות הטטה בהיפוקמפוס (4-12 Hz) הן בין הצורות השכיחות ביותר של פעילות קצבית במוח היונקי, והן מאמינות כי הן ממלאות תפקידים מרכזיים בתפקודים קוגניטיביים כגון עיבוד מידע spatiotemporal ויצירת זיכרונות אפיזודיים 1 , 2 , 3 . בעוד כמה מחקרים vivo המדגישים את הקשר של תאטה מקום תאים עם הניווט המרחבי ומחקרי הנגע, כמו גם ראיות קליניות, תומכים את הדעה כי תנודות טטה בהיפוקמפוס מעורבים היווצרות זיכרון 4 , 5 , 6 , המנגנונים הקשורים עם הדור של תנודות thta בהיפוקמפוס עדיין לא הבינו לחלוטין. מחקרים מוקדמים בתחום ה- vivo הראו שפעילות התטה תלויה בעיקר במתנדים חיצוניים, ובמיוחד בתשומות קצובותמן המבנים המוחיים כגון מחיצות וקורטקס אנטורהינל 7 , 8 , 9 , 10 . תפקיד של גורמים פנימיים - קישוריות פנימית של רשתות עצביות בהיפוקמפוס יחד עם המאפיינים של נוירונים בהיפוקמפוס - הונח גם על סמך תצפיות חוץ גופית 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . עם זאת, מלבד כמה מחקרים ציון 19 , 20 , 21 , קשיים בפיתוח גישות שעלולות לשכפל פעילות פיזיולוגית ריאליסטית האוכלוסייה בהכנת פשוטה במבחנה חוץ גופיתS יש, במשך זמן רב, עיכוב בדיקה ניסיונית מפורטת יותר של היכולות המהותיות של ההיפוקמפוס ואת האזורים הקשורים עצמית לייצר תנודות תטה.

חיסרון חשוב של תקן במבחנה דק פרוסה הגדרה ניסיונית היא כי הארגון הסלולר 3D ו הסינפטי של מבנים מוחיים נפגעת בדרך כלל. משמעות הדבר היא כי צורות רבות של פעילויות רשת מתואמות המבוססות על מכלולים תאיים מבוזרים מרחביים, החל מקבוצות מקומיות (רדיוס 1 מ"מ) לאוכלוסיות של נוירונים הפרושות על פני אזור מוח אחד או יותר (> 1 מ"מ), לא ניתן לתמיכה. בהתחשב בשיקולים אלה, נדרש סוג אחר של גישות כדי ללמוד כיצד מופיעות תנודות התטה בהיפוקמפוס, והן מתפשטות למבנים של קליפת המוח וקורטקורט.

בשנים האחרונות, הפיתוח הראשוני של "להשלים septo-hippocampal" הכנה לבחון interaional דו כיווניתCtions של שני מבנים 22 , ואת ההתפתחות שלאחר מכן של ההכנה "ההיפוקמפוס מבודדים", גילו כי תנודות תטה מהותי להתרחש ספונטנית בהיפוקמפוס חסר קלט קצבי חיצוני 23 . הערך של גישות אלה טמון על התובנה הראשונית כי המבנה הפונקציונלי כולו של אזורים אלה היה צריך להישמר על מנת לתפקד כמו מחולל קצב תטה במבחנה 22 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים בוצעו על פי פרוטוקולים והנחיות שאושרו על ידי מקגיל אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.

1. היפוקמפוס חריף בהכנת ויטרו

הערה: בידוד ההכנה בהיפוקמפוס שלם כוללת שלושה שלבים עיקריים: (1) הכנת פתרונות וציוד, (2) ניחוח של ההיפוקמפוס ו (3) הגדרת מערכת קצב זלוף מהיר הדרוש ליצירת תנודות תטה מהותי. בפרוטוקול זה, את הביצועים בזמן של נהלים - מן לנתיחה כדי הקלטה - חשוב במיוחד משום ההיפוקמפוס מבודד מהווה כה צפוף, אבל עדין, הכנה כי שמירה על קישוריות תפקודית של המבנה במבחנה דורש טיפול רב. הכנת הכל מראש מבטיחה רמה נאותה של זלוף זמין מוקדם ככל האפשר כדי למזער תא דAmage ולשמור על תפקוד פיזיולוגי.

  1. Sucrose מבוססי מלאכותי מוחי עמוד השדרה נוזל (aCSF) פתרון
    1. הכן 1x המניות סוכרוז פתרון לשמש לנתיחה שלאחר הדגירה דיסקציה. שלב את כל המרכיבים המפורטים בטבלה 1 , למעט CaCl 2 , לתוך 1 ליטר של מים deionized, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
  2. פתרון ACSF סטנדרטי
    1. הכן aCSF סטנדרטי עבור זלוף קצב הזרימה הגבוה של ההיפוקמפוס מבודד במהלך הקלטות אלקטרו. כדי להפוך את aCSF מרוכז (5X) מלאי, להמיס את כל המרכיבים המפורטים בטבלה 2 , למעט CaCl 2 , ב 2 L של מים deionized ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכן את הציוד
    1. לפני תחילת הנתיחה, להגדיר את שטח הספסל עם מגש פלסטיק מלא קרח (30 x 20 x 5 ס"מ), קווי צינורות מחוברים carbogen ו thrEe זכוכית צלחות פטרי (10 x 2 ס"מ) (ראה איור 1 ).
    2. הוסף 300 מ"ל של תמיסת סוכרוז (מניות 1X) כדי 500 כוס מ"ל, בועה זה עם carbogen (95% O 2 , 5% CO 2 ) ולהוסיף Ca 2 + [1.2 מ"מ].
    3. העברת 60 מ"ל של תמיסת סוכרוז זה צלחת פטרי זכוכית ולהשאיר בטמפרטורת החדר. מניחים את שארית במקפיא 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
    4. בועה הפתרון סוכרוז קר כקרח עם carbogen לאורך לנתיחה.
    5. ממלאים צלחת פטרי השני (תא מחזיק קר) עם תמיסת סוכרוז (4 מעלות צלזיוס) ולשמור על הקרח.
    6. הוסף 30 מ"ל של פתרון סוכרוז קר כקרח כוס 50 מ"ל.

2. דיפלקציה של היפוקמפוס שלם

הערה: השיטה עבור לנתח את ההיפוקמפוס מבודד זהה במהותו לזה שפותחו ותיארו במקור 22 , אבל עם פרטים נוספים ושינויים לגבי peקצב rfusion וטכניקות הקלטה.

  1. דיסקציה מוחית
    1. להרדים עכבר (P20 - 35) תחת מכסה המנוע קטר עם מגבת נייר קטנה ספוג עם 1 מ"ל של isoflurane (100%) כי הוא הוסיף לתוך הכלוב.
    2. לערוף את העכבר הרדים במהירות לטבול את הראש פתרון סוכרוז קר כקרח (כוס 50 מ"ל, ~ 5 s). העברת על מגבת נייר.
    3. השתמש באזמל כדי לבצע חתך בעור המדיאלי (הזנב אל מקורי) ודחוף את העור בצדדים כדי לחשוף את הגולגולת.
    4. לחתוך את הגולגולת עם מספריים קטנים ולהשתמש מרית במהירות לחלץ את המוח ולשחרר אותו לתוך צלחת פטרי המכיל פתרון סוכרוז קר כקרח. אפשר 1-2 דקות למוח להתקרר.
    5. בעוד המוח הוא מחלים, להוסיף 2 - 3 מ"ל של תמיסת סוכרוז על נייר העדשה מכוסה פטרי (דיסקציה) צלחת על הקרח.
  2. בידוד את ההיפוקמפוס
    1. מניחים את המוח על צלחת לנתיחה ב positio זקוףנ.
    2. הסר את המוח הקטן ואת קליפת המוח הקדמית עם סכין גילוח. חותכים את המוח לחצי לאורך המטוס בינוני ולהחזיר את שתי ההמיספרות מבודדים לחדר ההחזקה. אפשר עוד 1 - 2 דקות להתאוששות.
    3. מקום אחד hemisected המוח זקוף על צלחת לנתיחה.
    4. סובב את המנה עד מבנים midsagittal הפנים הצופה ואת קווי המתאר מוטבע של מורכבות מחיצת גלוי כמו שכבת אגס דקה של רקמה קדמית התלמוס.
    5. החזק את המוח חמי- sected יציב עם microspatula ומקום הקצה הקטן של polytetrafluoroethylene (PTFE) מצופה המרית מיד מאחורי (הזנב אל) אזור המחצה.
    6. הכנס את המרית מצופה מתחת מחצה ולהזיז את קצה עד צלחת לנתיחה הוא הגיע. סבר את הסיבים המחברים את אזור המחיצות caudally. חזור על אותה פעולה לאורך הקצה הקדמי של מחצה וחותכים את הסיבים המתחברים לחלק הקדמי של המוח.
    7. עם מרית קלות מחזיק את החלק הפנימי של קליפת המוח רק מעל ההיפוקמפוס בעמדה זקופה, להשתמש microspatula כדי למשוך בזהירות למטה את תלמי, ההיפותלמוס הנותרים גזע גזע המוח. השתמש במרית כדי לחתוך ולהסיר את הרקמה משכו.
    8. הפוך את חצי הכדור מבודד על צדה ולזהות את קווי המתאר של ההיפוקמפוס.
    9. הכנס את המרית מצופה בחדר לרוחב, מתחת לקצה מקורי של ההיפוקמפוס הגב.
    10. להחזיק את המרית מיושר אופקית עם המטוס midsagittal של המוח חמי- sected ולהחליק אותו דרך קווי חלקה של קירות החדר עד קצה עולה caudally.
    11. החזק את המרית מתחת להיפוקמפוס ולחץ עליה קלות על סיבי החיבור, לאורך השכבה הפנימית שבה ההיפוקמפוס מצטרף לקליפת המוח. החל את microspatula בצד החיצוני של שכבה זו והחלק נגד מרית מצופה לפרוס דרך חיבור FiBers.
    12. כדי להשלים את החילוץ, לסובב את צלחת לנתיחה ולהכניס את המרית מצופה מתחת ההיפוקמפוס הגחון. החזק קלות את החלק הפנימי של לקפל קליפת המוח עם מרית וחתך דרך חיבורים entorhinal באמצעות חיתוך חתיכת נגד microspatula.
      הערה: ניתן להסיר את מכלול הספטוהיפוקמפוס כולו על ידי הנחת המרית המצופה מתחת לכל ההיפוקמפוס, ושליפת רקמת המוח הנותרת מתחת.
    13. לאחר בידוד מוחלט, לשמור על ההיפוקמפוס מנוחה על המנה להוסיף טיפת פתרון סוכרוז קר כקרח כדי לשמור על זה מגניב. בזהירות לקצץ את כל קליפת המוח הנותרים סיבים להפריד את ההיפוקמפוס מחיצות על ידי בעדינות החלת סכין גילוח דרך fornix.
      הערה: אם התצלומים של מהדק התיקון אמורים להתבצע מתאי פירמידה (ראה סעיף 4.6), ההיפוקמפוס המבודד ניתן לחתוך באופן רוחבי בזווית של 45 ° כדי לחשוף את שכבת הפירמידה של CA1 ("anglE-cut), מבלי לפגוע במעגל הרשת המקומית בחלק הנותר של ההיפוקמפוס.
    14. מעבירים את ההכנות לטמפרטורת החדר סוכרוז פתרון ולתת לו להתאושש במשך 15 - 30 דקות לפני ההעברה לחדר ההקלטה.

3. הגדרת את זלוף מהיר להקלטת ההיפוקמפוס מבודד

  1. הגדר את מערכת זלוף- fed זלוף לאפשר זרימה רציפה במהירות גבוהה של aCSF מחומצן ב 20-25 מ"ל / דקות.
    1. הכן aCSF (1X) צלוחיות מראש לטבול אותם באמבטיה ההתחממות (~ 30 מעלות צלזיוס) לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי. הפעל את מערכת החימום בתוך הקו (30 ° C).
    2. השתמש bubblers אקווריום צינורות צינורות מחובר טנק carbogen כדי לחמצן aCSF לאורך הניסוי, ולהוסיף CaCl 2 [2 מ"מ] לפני תחילת זלוף.
    3. עצור זרימת aCSF ולהעביר את ההיפוקמפוס לתא הקלטה באמצעות רחבסוף של פיפטה זכוכית. אפשר את ההכנות רווי סוכרוז לשקוע להתיישב בתחתית.
    4. מניחים את ההכנה במרכז החדר ההקלטה (בקו עם ציר כניסת מוצא) עם משטח חלק של CA1 ו- SUB על גבי. לייצב את ההיפוקמפוס עם משקולות קטנות על הגפיים ואת הזמני מחטתי מחדש זרימת aCSF.

4. אלקטרופיזיולוגיה בהיפוקמפוס מבודד

  1. הקלטת תאיים של תנודות תזה בהיפוקמפוס במבחנה
    1. עבור ניטור תאיים של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) או יחידה יחידה פעילות של במבחנה מבודדת בהיפוקמפוס, להשתמש micropipettes זכוכית (1 - 3 MΩ) מלא aCSF. רשמו רעש נמוך עם אותות פוטנציאליים של שדה פוטנציאלי עם מגבר מהדק תיקון של x1000 x1, מעבר מקוון של סינון פס 0.1 - 500 הרץ וקצב דגימה של 5-20 קילו-הרץ.
      הערה: מיקרוסקופ נבנה בהתאמה אישית בפרוטוקול זההוא מצויד נמוך (2.5X) ו-הגדלה גבוהה (40X) מטרות עבור נוף ההגדלה נמוכה של ההיפוקמפוס, כמו גם מיקרוסקופ וידאו אינפרא אדום epifluorescence להכרה תא בודד. הרכיבים של מערכת זו כוללים מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף, קוביות סינון פלואורסצנטי, מצלמת וידאו אנלוגי חוטף מסגרת דיגיטלית עם תוכנת הדמיה, על הבמה חדר זלוף מותאם אישית ( איור 2A , inset i) ו micromanipulators דיוק גבוהה עבור הקלטות עצביים ו מיקום סיבים אופטיים.
    2. השתמש המצלמה רכוב על המיקרוסקופ מחובר לתצוגת המחשב כדי לבדוק את ההכנה בהיפוקמפוס תחת הגדלה נמוכה (2.5X) ו לבדוק במהירות כי אין חתכים או נזק על פני השטח החיצוניים. הסדר באלכסון בכיוון של סיבי alveus לאורך משטח חלק של CA1 צריך להיות גלוי ( איור 2 א , הבלעה השנייה) כאשר זורחת אור מועבר דרך ההיפוקםמוּגלָה.
    3. השתמש נמוכה-הגדלה רחב שדה המטרה כדי להציג את ההיפוקמפוס מבודד ואת המיקום של אלקטרודות LFP במקומות הקלטה ספציפיים.
      הערה: פריסה של ההכנה בהיפוקמפוס מבודד עם אלקטרודות מרובות להציב במקומות הקלטה שונים מתואר באיור 2 א .
    4. מנמיכים אלקטרודה LFP לתוך האמבטיה עד שהוא נוגע פני השטח (alveus) של אזור CA1.
      הערה: זה בדרך כלל מייצר חולף מהיר הקלטה AC מצמידים דומה למה שקורה כאשר האלקטרודה בא במגע עם התקשורת ההקלטה. צג שמע יכול להיות שימושי כדי להאזין לערוץ LFP ערוץ לאחר שלב זה.
      הערה: לעתים קרובות, סימנים מוקדמים של פעילות יופיע רק לאחר 10-15 דקות, ולכן חשוב לא להתקדם במהירות לתוך ההכנה. אם לאחר תקופה זו פני השטח LFP אלקטרודה הוא עדיין לא להרים את הפעילות, להתקדם קצת יותר למטה דרך שכבות oriensו להשהות מעת לעת כדי לראות אם כל סוג של פעילות עולה בעת מתקרב שכבת התא העיקרית. אם דבר אינו מזוהה לאחר 5-10 דקות נוספות, בזהירות retract האלקטרודה ומניחים אותו במקום אחר באותו אזור.
    5. לקדם את האלקטרודה LFP דרך שכבת פירמידה. שימו לב כי פעילות spiking תאיים בהתחלה מגדילה כמו פריקה יחידה יחידה של נוירונים בודדים (בעיקר פירמידלית תאים סל מעכבי) מזוהה. הנמיך את האלקטרודה נוספת וציין כי spiking מתחיל להתפוגג שוב עם קצה חוצה את הרדיאטום. שים לב כי תנודה ברורה ברשת גלוי בטווח תדר תדר (4-12 Hz) מתברר ומגיע משרעת מקסימלית (~ 100 - 300 μV) כמו מיקום ההקלטה הוא הוריד דרך הרדיאטום.
  2. תנודות תטא ברחבי אזור אחד
    1. כדי לבדוק את המאפיינים המרחביים של תנודות תטא ספונטנית ברחבי האזור CA1, במקום את קצה oFE התייחסות LFP אלקטרודה באתר CA1 המדיאלי (הממוקם באופן רפואי לאורך ציר האורך הטמפורלי האורך) ולהוריד אותו לתוך הרדיאטום כפי שתואר לעיל.
    2. מניחים אלקטרודה LFP השני לתוך אתר CA1 (200 - 800 מיקרומטר מחרוזת או הזמני של LFP הראשון) ולהבחין כי תנודות CA1 תטה יכול לסנכרן על פני מרחקים גדולים יחסית.
  3. תנודות תטה על פני שכבות
    1. כדי לבדוק את המאפיינים של תנודות thta על פני שכבות בהיפוקמפוס, להשאיר אלקטרודה LFP התייחסות באתר רדיאטום CA1. החל רק מעל השכבה ourens, התחתון אלקטרודה שנייה לתוך שכבת התא פירמידה, דרך הרדיאטום. שים לב היפוך הדרגתי של האות LFP (היפוך פאזה יחסית) על פני השכבה פירמידלית.
      הערה: לדוגמאות מייצגות של סוגי פעילות אלה, ראה איור 2 ב . דוגמאות לפרופילים למינרית / עומק ולמשתנים מקוריים של צפיפות מקור (CSD)הוא ממחיש את האתר של היפוך פאזה בהיפוקמפוס מבודד פורסמו בעבר 23 , 24 , 25 .
  4. תנודות גמא וצימוד תטא-גמא בהיפוקמפוס שלם
    1. מניחים שדה אלקטרודה בגבול CA1 / SUB ומורידים אותו עד שהוא יושב על הממשק בין השכבות הפירמידליות והמולקולריות. ברמה זו, פוטנציאל שדה הצגת תנודות גמא ברור עם שינויים משרעת כי שלב לנעול את המקצב תטה המקומי ניתן להקליט 24 . התאם את קנה המידה כדי לצפות בסולם הזמן האיטי של צימוד הגטא-גמא. שים לב כי התפרצויות גמא מתרחשות בשתי להקות תדר שונות, אשר יכול להתגלות על ידי הלהקה לעבור סינון האות LFP מתמשכת בטווח איטי (25 - 50 הרץ) וגאמה מהירה (150 - 250 הרץ) טווח (ראה איור 2 ג עבור נציג מסונן עקבות).
  5. כל תא תיקון מהדק מהדק במהלך תנודות תבה בהיפוקמפוס במבחנה
    הערה: בחלק זה של הפרוטוקול, המטרה היא לקבל ויזואלי מודרך כולו תא תיקון מהדק מהדק מן interneurons מזוהה בהיפוקמפוס מבודדים מן עכברים PV-TOM מהונדס להביע את החלבון פלואורסצנטי, tdTomato, בשליטת היזם PV (עבור פרטים נוספים ראה חומרים ו Ref 26 ).
    1. השתמש מיקרוסקופ וידאו פלואורסצנטי עם הגדלה (2.5X) גבוה כוח (40X) הגדלה לדמיין interneurons חיובי tdTomato הממוקם ליד פני השטח של הכנה בהיפוקמפוס מ עכבר PV-TOM ( איור 3 ). שים לב כי בעוד נוירונים PV-TOM יכול להיות דמיינו בהצלחה וממוקדים תיקון באמצעות alveus (עד 100 מיקרומטר), תאים פלורסנט שאינם פלורסנט ניתן גם להגיע בקלות יחסית כאשר ההיפוקמפוס מוכן עם טכניקת חיתוך זווית (ראה סעיף 2.2.14 הערה).
    2. תחת תצוגה הגדלה נמוכה של ההיפוקמפוס, במקום אלקטרודה LFP ב CA1 / SUB לפקח תנודות theta בעת הכנה עבור ניסויים מהדק תיקון.
    3. עבור הגדלה 40X ו לטבול את המטרה מעל אזור היעד; הורד אותו עד שהשכבות העליונות יהיו גלויים. לתפעל את המיקום של המיקרוסקופ כדי להבטיח גישה פתוחה מספיק עבור פיפטה תיקון הגישה מן הצד הנגדי.
    4. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, בחר תא PV- טון ניאון לגשת אליו עם פיפטה תיקון (2 - 3 MΩ) מלא פתרון תאיים רגיל.
    5. השתמש חתיכת הפה כדי להחיל לחץ חיובי אור פיפטה לפקח על ההתנגדות כמו האלקטרודה הוא הוריד על התא. כאשר קצה פוגש את התא היעד, ההתנגדות פיפטה מגביר גומת חן ברורה מופיע כמו לחץ חיובי דוחף על הממברנה. שחררו את הלחץ וודאו כי הדופק הנוכחי משתטח כמו גושפנקה מתחיל הטופס. מיד clמגבר על פוטנציאל hyperpolarized (-70 mV), ופעם חותמת GΩ מושגת, לקרוע את קרום התא עם כמות קטנה של לחץ שלילי מיושם באמצעות בעל פיפטה.
    6. פעם בתצורה תא שלם, לבחון את המאפיינים הפיזיולוגיים של תא PV מזוהה במהלך תנודות בהיפוקמפוס ספונטני ( איור 3 ב ).
    7. שימו לב כי פוטנציאל הקלטה ממברנה תאיים מ תאים PV מאופיינים התנהגות מהירה spiking ו בפרצי פוטנציאל פעולה מסונכרנים ל CA1 / SUB קצב תטא.
    8. החלף את המתח-מהדק והחזק את התא פוטנציאלים שונים של קרום לאפיין את היחס בין זרמים סינפטיים מעוררים לעומת מעכב שנוצר על ידי פעילות קצבית מהותי. דוגמה של הקלטה מהדק תיקון מתא פירמידה מוצג באיור 3A להשוואה.
  6. שליטה אופטוגנטית בהיפוקמפוס המבודד
    הערה: עבור שליטה optogenetic של פעילות הרשת בהיפוקמפוס, אסטרטגיה ספציפית מסוג תא הקשורים הפעלה קצבית של תאים המכילים PV- GABAergic משמש כאן כמו תאים אלה הוצגו לשחק תפקיד מרכזי בסנכרון אוכלוסיות תאים ראשיים בהיפוקמפוס מבודד 25 . ביטוי סלקטיבי של הערוץ channelrhodopsin-2 (ChR2) בתאים PV מושגת על ידי חציית קו העכבר PV-Cre עם עכברים המבטא באופן קונבנציונאלי ChR2 Cre- תלוי (Ai32), ובכך לייצר PV-Chy עכברים. לחלופין, מבנים וקטוריים ויראליים ( למשל , AAVdj-ChETA-eYFP) ניתן להזריק לתוך ההיפוקמפוס של PV-Cre או PV-TOM עכברים (P15-16) כדי להניע את הביטוי של opsin מעורר ב CA1 / SUB interneurons ( איור 4 א ).
    הערה: אסטרטגיה זו תוארה בעבר 25.
    1. מניחים אלקטרודה LFP באזור CA1 / SUB ו תיקון תא הפירמידה הקרובה של ההיפוד מבודדיםAmpus של עכבר להביע את האור כחול רגיש opsin מרגש ChR2 ב interneurons PV.
    2. מניחים סיב אופטי מדריך אור (0.2 - 1 מ"מ קוטר) מעל ההכנה בהיפוקמפוס ומרכז אותו באזור נרשם. השתמש באור כחול (473 ננומטר) ממקור LED עבור גירוי אופטוגנטי, המורכב מפעימות אור (10 - 20 אלפיות השנייה, מופעלות באמצעות אות טרנזיסטור טרנזיסטור טרנזיסטור) או פקודות מתח גל סינוס הנשלחות בתדרי תטה (12-12 הרץ).
      הערה: מותאם אישית LED מבוסס גירוי אור הרכבה תוארה במקום אחר 25 .
    3. מעבר הנוכחי מהדק ולאפיין את הפעילות של פירמידה במהלך תנודות תטא ספונטני.
    4. הפעל את פרוטוקול גירוי ולתעד את התגובות האור. Observe כי תנודות שדה ופעילות סינפטי הנוירון נרשם להיות מסונכרן יותר במהלך גירוי optogenetic וכי הקצב הקצבי של תאים PV תוצאות שליטה חזקה של שני תדריםEncy והעוצמה של תנודות theta ( איור 4 ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג על ידי לימוד תנודות theta בהכנת העכבר בהיפוקמפוס מבודד במבחנה . הליך לנתיחה לחילוץ ההיפוקמפוס מבודדת באיור 1 . באמצעות הכנה זו, תנודות תטה מהותי ניתן לבחון במהלך המיקום של אלקטרודות ש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעוד הקלטות אלקטרו מפרופילים בהיפוקמפוס חריף מהווים תקן במבחנה טכניקה, השיטות המוצגות כאן שונה באופן משמעותי מן הגישה הקלאסית. שלא כמו ההכנות פרוסת דק שבו שכבות תאים ספציפיים גלויים על פני השטח ניתן לבדוק ישירות, ההכנות בהיפוקמפוס שלם דומים יותר בתצורות vivo

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אינם מכריזים על אינטרסים מסחריים או פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות ומחקר מדעי הטבע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Sodium ChlorideSigma AldrichS9625
SucroseSigma AldrichS9378
Sodium BicarbonateSigma AldrichS5761
NaH2PO4 - sodium phosphate monobasicSigma AldrichS8282
Magnesium sulfateSigma AldrichM7506
Potassium ChlorideSigma AldrichP3911
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7528
Calcium chloride dihydrateSigma AldrichC5080
Sodium AscorbateSigma AldrichA7631-25G
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Standard Dissecting ScissorsFisher Scientific08-951-25brain extraction
Scalpel Handle #4, 14 cmWPI500237brain extraction
Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm)WPI500456brain extraction
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20Ultident02-90010-20brain extraction
Fine Point Curved Dissecting ScissorsThermo Fisher Scientific711999brain extraction
Teflon (PTFE) -coated thin spatulaVWR82027-534hippocampal preparation
Hayman Style MicrospatulaFisher Scientific21-401-25Ahippocampal preparation
Lab spoonFisher Scientific14-375-20hippocampal preparation
Borosilicate Glass Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-20Ahippocampal preparation
DroperFisher Scientifichippocampal preparation
Razor blades Single edgedVWR55411-055hippocampal preparation
Lens paper (4 x 6")VWR52846-001hippocampal preparation
Glass petri dishes (100 x 20 mm)VWR25354-080hippocampal preparation
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cmn.a.n.a.hippocampal preparation
Single Inline Solution HeaterWarner InstrumentsSH-27Bperfusion system
Aquarium air stones for bubblingn.a.n.a.perfusion system
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8)Fisherbrand14-171-129perfusion system
Electric SkilletBlack & Deckern.a.perfusion system
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) VitalaireSG466204Aperfusion system
Glass bottles/flasks (4 x 1 L)n.a.n.a.perfusion system
Submerged recording Chambercustom design (FM)n.a.Commercial alternative may be used
Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) )WPI1B150F-4electrophysiology
Hum Bug 50/60 Hz Noise EliminatorQuest ScientificQ-Humbugelectrophysiology
Multiclamp 700B patch-clamp amplifierMolecular devicesMULTICLAMPelectrophysiology
Multiclamp 700B Commander ProgramMolecular devicesMULTICLAMPelectrophysiology
Digital/Analogue converterMolecular devicesDDI440electrophysiology
PCLAMP10Molecular devicesPCLAMP10electrophysiology
Vibration isolation table Newportn.a.electrophysiology
Micromanipulators (manually operated )Siskiyou MX130electrophysiology (LFP)
Micromanipulators (automated)Siskiyou MC1000eelectrophysiology (patch)
Audio monitor A-M SystemsModel 3300electrophysiology
Micropipette/Patch pipette pullerSutterP-97electrophysiology
Custom-built upright fluorescence microscopeSiskiyoun.a.Imaging
Analogue video cameraCOHU4912-2000/0000Imaging
Digital frame grabber with imaging softwareEPIX, IncPIXCI-SV7Imaging
Olympus 2.5X objectiveOlympusMPLFLNImaging
Olympus 40X water immersion objectiveOlympusUIS2 LUMPLFLNImaging
Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system customn.a.optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015)
NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
PV::Cre (KI) miceJackson Laboratorystock number 008069Allow  Cre-directed gene expression in PV interneurons
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))Jackson Laboratorystock number 007905Express TdTomato following Cre-mediated recombination
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFPJackson Laboratorystock
number 012569		Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase
PVChY miceIn house breedingn.a.Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP

References

  1. Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
  2. Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
  3. O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
  4. Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
  5. M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
  6. Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
  7. Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
  8. Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
  9. Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
  10. Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
  11. Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
  12. Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
  13. Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
  14. Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
  15. Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
  16. Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
  17. Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
  18. Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
  19. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  20. Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
  21. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  22. Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
  23. Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
  24. Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
  25. Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
  26. Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
  27. Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
  28. Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
  29. Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience126interneurons

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved