פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

Summary

טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא שיטה יעילה עבור ניתוח השינויים הנוצרות על-ידי למידה מאפיינים פנימיים, הפלסטיות של הסינפסות סינאפסות או מעכבות.

Abstract

טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא כלי רב עוצמה עבור חוקרים הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות עצבית באזורים מסוימים במוח. כדי לנתח פלסטיות המושרה מנוע-למידה, התאמנו חולדות באמצעות פעילות רוד הרוטור מואצת. חולדות לבצע את המשימה 10 פעמים במרווחים של 30-s 1-2 ימים. שופרו ביצועים משמעותי בימים אימון בהשוואה במשפט הראשון. אז הכנו פרוסות המוח חריפה של קליפת מנוע ראשי (M1) בחולדות לא מאומן ומיומן. ניתוח הנוכחי-קלאמפ הראו שינויים דינמיים נח קרומית אפשרית, ספייק הסף, afterhyperpolarization, התנגדות הממברנה בנוירונים כפירמידה שכבה II/III. נוכחי הזרקת המושרה רבים יותר קוצים בחולדות יומיים מיומן יותר פקדים לא מאומן.

כדי לנתח פלסטיות המושרה הקשרית-למידה, התאמנו חולדות באמצעות פעילות המעכבת הימנעות (IA). לאחר שנוכחו רגל-שוק בהצד האפל של תיבה, החולדות למדו להימנע ממנה, נשאר בצד המואר. הכנו חריפה פרוסות בהיפוקמפוס מיומנת, מאומן IA, אינטראקצית, וחולדות שלב אחר שלב. מתח-קלאמפ ניתוח שימש ברצף להקליט מיניאטורי סינאפסות postsynaptic זרמים (mEPSCs ו- mIPSCs) של נוירון CA1 אותו. מצאנו שונים מתכוון amplitudes mEPSC ו mIPSC כל נוירון CA1, רומז כי כל נוירון היה עוצמות שונות postsynaptic שלה הסינפסות סינאפסות. יתר על כן, בהשוואה עם פקדים מיומנת, מאומן IA שלחולדות לא היה גבוה יותר amplitudes mEPSC, mIPSC, עם המגוון הרחב. תוצאות אלה הציע כי לימוד הקשרי יוצרת גיוון postsynaptic הסינפסות סינאפסות והן מעכבות על כל נוירון CA1.

רצפטורים_של אמפא או GABA נראה לתווך את הזרמים postsynaptic, מאז הטיפול באמבט עם CNQX או bicuculline חסם את האירועים mEPSC או mIPSC, בהתאמה. טכניקה זו ניתן ללמוד סוגים שונים של למידה באזורים אחרים, כגון קליפת חושית, האמיגדלה.

Introduction

הטכניקה מלחציים תיקון, שפותחה על ידי Neher ו- Sakmann, כבר בשימוש נרחב עבור ניסויים אלקטרופיזיולוגיות¹. הטכניקה מלחציים תיקון שלם-תא² יכול לשמש כדי להקליט תאיים זרם או מתח באמצעות החותם ג'יגה אוהם של קרום התא. הטכניקה הנוכחית-קלאמפ מאפשר לנו לנתח הבדלים במאפייני ממברנה כגון נח פוטנציאל ההתנגדות, קיבוליות³. הטכניקה מתח-קלאמפ מאפשר לנו לנתח הנוצרות על-ידי למידה הפלסטיות הסינפטית-הסינפסות סינאפסות והן מעכבות.

ראשי קליפת המוח המוטורית (M1) הוא אזור מרכזי וקריטי עבור ביצוע תנועות מרצון מיומנים. מחקרים קודמים אלקטרופיזיולוגיות הראו התפתחות הויסעגט (LTP)-כמו פלסטיות בשכבה II/III סינאפסות synapses לאחר אימונים מוטוריים מיומנים⁴. יתר על כן, אין ויוו הדמיה מחקרים נוספים הראו את הבנייה מחדש של הדנדריטים M1 לאחר מיומן להשיג פעילות^5,6. עם זאת, פלסטיות סינפטית ופנימית הנוצרות על-ידי למידה לא הוכח בנוירונים M1.

לאחרונה דיווחנו כי פעילות רוד הרוטור קידום שינויים דינמיים glutamatergic, GABAergic synapses ושינינו את פלסטיות מהותי ב- M1 שכבה II/III נוירונים⁷. כאן השתמשנו בטכניקה מלחציים תיקון פרוסה לחקור פלסטיות הנוצרות על-ידי למידה. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור סוגים אחרים של ניסיון תלוית פלסטיות באזורים אחרים במוח. לדוגמה, הקלט החושי לתוך קליפת חבית יכול לחזק אמפא קולטן בתיווך סינאפסות קלט לתוך שכבה II/III נוירונים⁸, פחד מרומז מיזוג מחזק את הקלט סינאפסות לתוך הנוירונים אמיגדלה לרוחב, אשר נדרש עבור פחד זיכרון⁹. יתר על כן, למידה הקשרית יוצר גיוון מבחינת קלט סינפטית סינאפסות hippocampal CA1 נוירונים^10,11.

Protocol

דיור בעלי חיים וכל הניתוחים היו בהתאם להנחיות עבור בעלי חיים לניסויים של יאמאגוצ'י מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של יאמאגוצ'י אוניברסיטת.

1. חיות

1. להשתמש כדי 5 בשבוע-בת 4 זכר חולדות ספראג-Dawley (כמחנכת 28 עד 31 ימים של גיל).
2. בית העכברושים בכלובים פלסטיק בודדות (40 ס"מ × 25 ס"מ × 25 ס מ) נשמר בטמפרטורה קבועה (23 ° C ± 1 ° C) תחת מחזור/כהה 12-h. לתת חולדות ad libitum גישה מים ומזון.

2. הרוטור רוד מבחן

1. לחקור את יכולות מוטוריות למידה, נושא כל עכברוש במבחן רוד הרוטור (רוד בקוטר 7 ס מ; רוחב ליין 8.9 ס"מ; גובה הנפילה 26.7 ס מ) 1 או 2 ימים רצופים ( איור 1A קידה ואח ', 2016 < מה המצב class = "xref" > 7). לבצע את הפעילות בחדר שקט, בטמפרטורה מבוקרת (23 ± 1 ° C). לא להפריע או להתמודד עם חולדות לפני ילדי
2. הגדר את המוט הרוטור למצב האצה, אשר מגדילה בצורה לינארית מ- 4 סיבובים לדקה כדי 40 סיבובים לדקה (8 π/דקה כדי π 80/min) ב- 5 דק
3. לשים את החולדה על מוט סיבוב מנוחתו. לאשר כי כל האיברים הם על המוט.
4. למדוד ההשהיה ליפול מהעגלה מוט סיבוב כדי להעריך את ביצועי המנוע.
5. לאפשר כל עכברוש 10 ניסיונות (ניסויים) עם מרווחי 30-s.
6. אם החולדה נופל מן המטה מסתובב, להגדיר אותו על המוט שוב לאחר מרווח s 10-20-
7. להקריב את העכברוש עם מנת יתר של פנטוברביטל (400 מ"ג/ק"ג) 30 דקות אחרי המשפט האחרון. להזריק שליטה מאומנת חולדות עם המינון אותו הרדמה בכלובים שלהם הביתה.

3. מבחן הימנעות מעכבות

1. לחקור את לימוד הקשרי, נושא חולדות כדי מבחן הימנעות מעכבות (IA) ( איור 1D ב Mitsushima et al., 2011 2013 ^{10 , 11}) למנוע כל חוויות אפיזודי ביום של הניסוי כגון קשר עם אחרים, שינויים כלוב או ניקוי. לבצע את המשימה בחדר שקט, בטמפרטורה מבוקרת (23 ± 1 ° C).
   הערה: המנגנון הכשרה IA היא תיבה אקרילי דו תאיים (אורך 33 ס מ; רוחב 58 ס"מ; גובה 33 ס מ). יש בו צד בטוח מואר צד אפל הלם המופרדים באמצעות דלת נסתרת ( איור 1D).
2. מקום העכברוש ליתר (ספרות) של תיבת מואר. להתמודד עם העכברוש בעדינות בלי לחץ.
3. לחכות זמן קצר (10-20 s) להסתגלות העכברוש לסביבה.
4. לפתוח את הדלת האחורית כדי לאפשר את החולדה להזין בתיבת כהה יהיה.
5. למדוד ההשהיה (s) לפני החולדה חודר את הצד האפל הרומן של התיבה. ההשהיה של המשפט הראשון מייצג את העכברוש ' s ביצועים לפני אימון-
6. לאחר כניסתו הצד האפל, סגור את הדלת ולהחיל הלם מעורבל רגליים חשמלי (2 s, 1.6 mA) באמצעות מוטות פלדה חשמל הממוקם בתוך הרצפה של התיבה. לאפשר חולדות שלב אחר שלב לחקור את המנגנון הדרכה עבור 1 דקות מבלי להיות בהלם. בית אינטראקצית חולדות בכלוב הלם מואר עבור מספר ימים פתאום נותן ההלם ללא חוויות אפיזודי. לטפל בעדינות ללא מתח בקבוצות כל.
7. לשמור כל עכברוש בתיבת כהה עבור 10 s לפני שחזר זה הכלוב הביתה.
8. -30 דקות לאחר ההלם רגל, למקם שוב העכברוש לתוך הצד המואר של התיבה. למדוד את ההשהיה כדי להזין את הצד האפל.
9. להחזיר את החולדה לכלוב הביתה.
10. -60 דקות לאחר ההלם, להקריב את העכברוש עם מנת יתר של פנטוברביטל (400 מ"ג/ק"ג). להתמודד עם העכברוש בעדינות ולהזריק את ההרדמה intraperitoneally. בחולדות שליטה מיומנת, להזריק את ההרדמה בכלובים שלהם הביתה בלי החוויה המתוארת לעיל.

4. מאגר דיסקציה

1. להמיס גבישים של 0.195 g ₂ PO NaH ₄-2 H ₂ O, g 0.188 אשלגן כלורי, CaCl 0.074 g ₂, 1.423 g MgCl ₂-6 H ₂ O ו- 12.579 g כולין כלוריד במים הנדסה גנטית (900 מ"ל עד 950 מ"ל) . ראה טבלה 1-
2. להמיס גבישים של חומצה אסקורבית 2.340 g, 0.342 g פירובט נתרן מלח, 2.100 g NaHCO ₃ ו- 4.500 g גלוקוז.
3. הוסף מים עד 1000 מ"ל. טווח osmolality יהיה בין mOsm 290/L ל 300 mOsm/ל' התאם osmolality על-ידי הוספת מים הנדסה גנטית, אם זה על פני הטווח.
4. בועה הפתרון ב- 5% CO ₂ / 95% O ₂ גז התערובת בטמפרטורה קרה כקרח במשך 5 דקות לפני השימוש.

5. נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד)

1. להמיס גבישים של 0.186 g. אשלגן כלורי, 6.700 g NaCl, ו- g 0.156 NaH ₂ PO ₄-2 H ₂ O במים הנדסה גנטית (900 מ"ל עד 950 מ"ל). ראה טבלה 2-
2. בועה עם תערובת גז עבור 5 דק.
3. להמיס גבישים של 1.800 g גלוקוז ו- 2.184 g NaHCO ₃ ולאחר מכן להוסיף 4 מ"ל MgCl ₂ ו- 4 מ"ל CaCl ₂ מ- 1 מ' במניה פתרונות.
4. הוסף מים עד 1000 מ"ל. טווח osmolality יהיה בין mOsm 290/L ו- 295 mOsm/ל' התאם osmolality על-ידי הוספת מים הנדסה גנטית, אם זה על פני הטווח.
5. בועה עם ראש המנזר תערובת גז להשתמש.

6. פתרונות תאיים

1. עבור זרם-קלאמפ הקלטות (טבלה 3), התמוססות 0.0746 גרם אשלגן כלורי, 6.089 g K-gluconate, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA ו- 500 MgCl µL ₂ מ- 1 מ' במניה הפתרון ב 180 מ ל מים הנדסה גנטית (להתאים את ה-pH ל 7.2 עם קו).
   1. להוסיף 0.4408 g נה ₂ - ATP, 0.0418 g נה ₃ - GTP ו 0.510 g נה-phosphocreatine. להוסיף מים עד 200 מ"ל ולהתאים את ה-pH 7.35 עם קו כדי.
   2. להתאים את osmolality כדי mOsm בסביבות 290/L על-ידי הוספת מים אלקטרופורזה.
   3. חנות כמו 1-mL aliquots במקפיא (למינוס 30 מעלות).
2. עבור מתח-קלאמפ הקלטות (טבלה 4), לפזר 5.244 g CsMeSO ₃, 0.672 g. CsCl, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA ו- 500 MgCl µL ₂ מ- 1 מ' במניה פתרונות ב- 180 מ ל מים הנדסה גנטית. להתאים את ה-pH ל 7.2 עם CsOH. להקלטות mEPSP ו- mIPSP, להשתמש ריכוז שונה של 5.814 g CsMeSO ₃ ו- 0.252 g CsCl כדי להתאים את פוטנציאל היפוך של התגובה קולטן GABA _A ¹¹.
   1. להוסיף 0.4408 g נה ₂ - ATP, 0.0418 g נה ₃ - GTP ו 0.510 g נה-phosphocreatine. להוסיף מים עד 200 מ"ל ולהתאים את ה-pH ל 7.35 עם CsOH.
   2. להתאים את osmolality כדי mOsm בסביבות 290/L על-ידי הוספת מים אלקטרופורזה.
   3. חנות כמו 1-mL aliquots במקפיא (למינוס 30 מעלות).

7. פורסים הכנה

1. מראש כדי להקריב, לרמתו כל כלי חיתוך עם קרח כתוש ( איור 2 א). להוסיף בערך 500 מ"ל של מים קרים לתוך המיכל קרח כתוש כדי להגדיל את שטח הפנים ליצירת קשר. פרוצדורה זו תוארה בעבר ^{10 , 11 , 12}-
   הערה: הכלים כאן הם: מספריים גדולים, מספריים איריס, מרית, מרית מיקרו, מלקחיים, פינצטה, גביע 200-mL פלדת אל-חלד, להב עבור המוח זמירה, מזרק 120-mL זלוף הלב מלא מאגר לנתיחה מטופלים עם תערובת גז, צינור סיליקון (20 ס מ) מחובר מחט אל תדאגי שעברו שיטוח, שלב ניתוח המוח אל חלד (עובי = 3 מ מ, ϕ = 12 ס מ), ואת במת הרכבה vibratome (ϕ = 5 ס מ).
2. להקריב את החולדה 30 דקות לאחר השלמת הדפוס ההתנהגותי מאת מאלחש זה עם מנת יתר של פנטוברביטל (400 מ"ג/ק"ג משקל גוף). מבצעים בתכשיר פרוסה במהירות כדי להבטיח כי הפרוסות בריאה כמו אפשרי ^{10 , 11 , 12}. תוספת המוחפרוטוקול פעולה עומד בכל הסטנדרטים וטרינרית של האוניברסיטה שלנו.
3. מילוי מזרק 120-mL עם המאגר הקר לנתיחה (טבלה 1) מבעבע עם 5% CO ₂ / 95% O ₂ גז תערובת. להסיר את כל הבועות אוויר לפני זלוף.
4. לאחר שחשף את הלב, את המחט לתוך החלק האחורי של החדר השמאלי.
5. בצע זלוף transcardial של המוח באופן ידני באמצעות המזרק. חולדות גדולות יותר לדרוש עוד מאגר לנתיחה זלוף. להטביע את המוח עם ניתוח קר כקרח המאגר עבור 5 דק בועה המאגר באופן רציף במהלך ועלייתו.
6. חתוך אל הצד האחורי של המוח ב במקביל זווית הכיוון דנדריטים של אזור בקליפת המוח היעד באמצעות סכין. מאז המוח היא לעמוד על הבמה הקרע עם חיתוך קצה התחתון, הזווית הראשוני קובע את זווית כל פרוסות המוח עוקבות. השלב זה חשוב באופן קריטי ( איור 2B). זווית שגוי עשוי לחתוך הנוירונים כפירמידה היעד.
   הערה: הכלים כאן הם: להב עבור המוח זמירה, נייר סינון (ϕ = 10 ס מ), שלב ניתוח המוח אל חלד (עובי = 3 מ מ, ϕ = 12 ס מ), מרית, עם דבק מגע, טפי ואת במת הרכבה vibratome (ϕ = 5 ס מ).
7. לחתוך פרוסות עבות המוח הילתית באמצעות vibratome של 350-מיקרומטר. מילוי החדר ניתוח עם המאגר הקר מבעבע עם 5% CO ₂ / 95% O ₂ גז תערובת ( איור 2C). בועה המאגר באופן רציף במהלך הפרוסה במוח.
8. לקצץ הפריפריה של אזור היעד באמצעות מספריים איריס.
9. לשטוף פרוסות החתוך בעדינות בטמפרטורת החדר חנה המבר מבעבע עם 5% CO ₂ / 95% O ₂ (טבלה 2).
פרוסות
10. תחזוקה גזוז תא ממשק עד בהקלטה שבוצעה ( איור 2D ו- E). הדגירה לשעה בבית הבליעה משפר את המצב של התאים, אך הפנוטיפים לשנות אם הפרוסות מודגרת למשך יותר מעשר שעות. סגור את המכסה של תא כדי להקיף את הגזים וטיפות הנוזל קטן של חנה המבר.

8. מלחציים תיקון שלם-תא

הערה: כל תא הקלטות דורשים מגבר מסנן נמוך לעבור מוגדר על תדר הקיצוץ של 5 קילו-הרץ. האותות דיגיטציה ומאוחסנים במחשב. ניתוח הנתונים המאוחסנים מנותק ( איור 3 א).

1. צור זכוכית אלקטרודות באמצעות של פולר אופקי. למלא את האלקטרודות פתרון מתאים (טבלאות 3 ו- 4) בעזרת מזרק 1-mL פוליאתילן רגיל מחובר צינור זכוכית ומסנן 0.22-מיקרומטר.
2. לפני מגע עם התא, לשמור על לחץ אוויר חיובי ולהתאים את פיפטה הנוכחי לאפס.
3. לאחר ויוצרים גושפנקה ג'יגה אוהם, הפעילו לחץ שלילי להיקרע קרום התא (תא כל תצורה באיור 3F).

9. ניתוח הנוכחי-קלאמפ

1. המאפיינים של קרום התא
   1. למלא את התיקון הקלטה פיפטות עם הפתרון תאיים להקלטות הנוכחי-קלאמפ (טבלה 3). ההתנגדות של פיפטה היא בין 4 MΩ 7 MΩ ב חנה המבר.
   2. אחרי הקרום ציסטות נקרעות, להחזיק את מתח הממברנה ב-60 mV במצב V-קלאמפ. לאחר מכן, מעבר " אמבט " למצב " תא " מצב במבחן ממברנה שימוש בתוכנה כדי למדוד את המאפיינים תאים פנימיים כגון קיבול הממברנה, התנגדות קבוע הזמן.
2. הנוכחי המחקר זריקה
   1. לאחר הקלטת המאפיינים תאים פנימיים, לעבור למצב של V-קלאמפ כדי לעקוב אחר (אני = 0) /I-CLAMP רגיל עבור הזריקה הנוכחית. שימו לב כי הפוטנציאל צומת נוזלי לא צריך להיות מתוקן ¹⁰.
   2. הכנס הנוכחי לתוך התא עבור גברת 300 לשנות את עוצמת הזרם stepwise מ − 100 הרשות הפלסטינית +550 עם עליות 50-pA. לספור את מספר קוצים (פוטנציאל פעולה) שהפיק את הזריקות הנוכחי.
   3. למדוד את המתח המינימלי הדרוש כדי לגרום של פוטנציאל הפעולה (זהו מתח הסף).
   4. לחשב את משרעת afterhyperpolarization כמו ההבדל בין המתח על ספייק חניכה המתח הנמוך ביותר השיגו במהלך afterhyperpolarization ⁷.

10. . מלחציים צולבים מתח ניתוח

1. אמפא/NMDA יחס
   הערה: יחס אמפא/NMDA הוא דרך מקובלת להעריך פלסטיות postsynaptic glutamatergic הסינפסות סינאפסות ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}. עם זאת, שים לב והמצוות העלאות שני הרכיבים אינם יכולים לשנות את יחס ¹³.
   1. Perfuse תא הקלטה עם פתרון פיזיולוגיים מבעבע עם תערובת גז ולשמור על הטמפרטורה ב 22 ° C עד 25 מעלות צלזיוס, הוסף 0.1 מ מ picrotoxin אל הפתרון כדי לחסום את GABA _A - מתווכת התגובה ולהוסיף 4 מיקרומטר 2- chloroadenosine כדי לייצב את התגובה העצבית עורר ¹⁴.
   2. למלא את התיקון הקלטה פיפטות עם הפתרון תאיים על מתח-קלאמפ הקלטות (טבלה 4). לבדוק את עמידות פיפטה הקלטה ב חנה המבר. ההתנגדות היא בין 4 MΩ 7 MΩ.
   3. בשביל ההקלטה בנוירונים שכבה II/III כפירמידה ב M1, מקום של טונגסטן דו קוטבית מגרה מיקרומטר אלקטרודה 200 עד 300 לרוחב מיקרומטר לתאים כדי שיירשמו, מתחת לפני השטח pial באזור של הייצוג forelimb (2-מ מ לרוחב קו האמצע) ^{15 , 16 , 17}.
   4. בשביל ההקלטה בנוירון כפירמידה CA1, מקום מגרה את האלקטרודה 200 מיקרומטר, כדי מיקרומטר 300 לרוחב (סיבים משני שפר) או המדיאלי (מסלול temporoammonic) על התאים יהיה מוקלט ( איור 3B).
   5. להגדיל את עוצמת הגירוי עד התגובה סינפטית > 10 אבא
   6. לחשב את יחס אמפא/NMDA הנמדדת היחס השיא הנוכחי ב − 60 mV הנוכחי נמדד ב +40 mV ב-150 מילישניות לאחר תחילת גירוי. שימו לב כי עקבות 50 ל- 100 צריך להיות בממוצע כדי לחשב את היחס.
2. הקלטות הנוכחי postsynaptic מיניאטורי
   הערה: מיניאטורה זרמי postsynaptic מעוררים (mEPSCs) נחשבים כדי שיתאימו התגובות שהפיק לשחרור שלפוחית יחיד של גלוטמט presynaptic ¹⁸ . לעומת זאת, מיניאטורות זרמי postsynaptic מעכבות (mIPSCs) נחשבים כדי שיתאימו התגובות שהפיק לשחרור שלפוחית יחיד של גאבא ¹⁸ presynaptic. העלאות amplitudes של mEPSCs ו- mIPSCs משקפת שידור postsynaptic חיזוק, תוך עליות במקרה תדירות משקפים עליות מספר הסינפסות תפקודית או את ההסתברות לשחרור presynaptic ¹¹ .
   1. למלא פיפטה הקלטה של תיקון עם פתרון שונה תאיים (טבלה 4) כדי להתאים את פוטנציאל ההיפוך של הזרם בתיווך קולטן GABA _A ל-60 mV.
   2. הוסף 0.5 מיקרומטר טטרודוטוקסין לאמבטיה כדי לחסום את פוטנציאל פעולה ספונטנית.
   3. להחזיק המתח ב-60 mV ל record האירועים mEPSC עבור 5 דק
   MV
   4. שינוי החזקת פוטנציאליים 0 mIPSC שיא אירועים במשך 5 דקות. כי נוירונים M1 הראו היפוך מעט גבוה יותר פוטנציאל אמפא קולטן בתיווך זרמים, mIPSCs של נוירונים M1 נרשמים ב +15 mV עם 0.1 מ"מ APV.
   5. לחכות כמה דקות על הזרם לייצב.
   6. להקליט את האירועים mIPSC עבור 5 דק.
   7. לזהות את האירועים מיניאטורי שימוש בתוכנה, והשתמש אירועים מעל הרשות הפלסטינית 10 לניתוח. לספור את מספר אירועים mEPSCs או mIPSCs עבור 5 דקות כדי לקבוע את התדירות. ממוצע amplitudes את האירועים כדי להשיג את משרעת רשע.
   8. לאשר האם לערוך טיפול באמבט עם 10 מיקרומטר CNQX או עם 10 מיקרומטר bicuculline methiodide חוסם האירועים mEPSCs ו- mIPSCs, בהתאמה.
3. ניתוח מדגמים מזווגים-הדופק
   הערה: פלסטיות Presynaptic ניתן לנתח באמצעות ניתוח לזווג...-דופק. עלייה לזווג-הדופק מצביע על ירידה גלוטמט presynaptic או GABA לשחרר את ההסתברות ^{7 , 10 , 11}.
   1. כדי לנתח את הסינפסות סינאפסות, להוסיף picrotoxin 0.1 מ מ ולהקליט את התגובה ב-60 mV. למרות הוספנו 2 מיקרומטר 4-chloroadenosine לאמבטיה, עלינו לזכור כי התרופה משפיעה על הסתברות השחרור presynaptic ¹⁴-
   2. לנתח הסינפסות מעכבות, להוסיף 0.1 מ מ APV ו 2 מיקרומטר 4-chloroadenosine לאמבטיה ולהקליט את התגובה ב 0 mV. בנוירונים M1, להקליט את התגובות +15 mV.
   3. החלת פולסים לזווג במרווח הבין-גירוי של 100 ms או 200 גב
   4. ממוצע של הערכים ולהקליט 50-100 עקבות רציפים בכל אחד מחזיק פוטנציאלי.
   5. לחשב את יחס הדופק לזווג כיחס בין הפסגה השנייה לשיא הראשון של הזרם postsynaptic.

תוצאות

כפי שהסברנו לאחרונה⁷, רוטור רוד הדרכה (איור 1 א') המושרה שינויים דינמיים ב פלסטיות מהותי של נוירונים הפירמידלית הבנויה שכבה II/III M1. מדידת ההשהיה עד העכברים ליפול מן המטה מסתובב מאפשר לנו להעריך את הביצועים מיומן למידה של העכברוש. השהיית זמן מצביע על ביצועי המנוע טובים יותר. ביום 1 של אימון, החולדות שיפור ביצועיהם רוד הרוטור עד המשפט. יום 2, החולדות השיגו רמות כמעט אסימפטוטית בהפעלה בממוצע ציונים (איור 1B). לעומת ההשהיה במשפט הראשון, ניתוח פוסט-הוק הראה שיפור משמעותי על הניסויים הסופי על ימי הדרכה (איור 1C).

איור 4A מראה דוגמה של זרם-קלאמפ ניתוח שבו המאפיינים עצביים השתנה לאחר למידה יכולות מוטוריות. זריקות של הרשות הפלסטינית 400 וזרמים pA 500 היו נחוצים כדי ליצור פוטנציאל פעולה בקבוצה מיומנת, בחולדות שעברו הכשרה בת יום אחד, בהתאמה. לעומת זאת, הזרקה של רק 150 הרשות הנוכחי היה מספיק כדי להפיק פוטנציאל פעולה בחולדות שעברו הכשרה יומיים. היחס בין עוצמת הנוכחי ואת המספר של פוטנציאל הפעולה מוצג באיור 4B. הנוכחית קטנה כמו 50 pA הספיק להפיק קוצים בחולדות שעברו הכשרה יומיים; לעומת זאת, חולדות שעברו הכשרה בת יום אחד הגיב עם פוטנציאל פעולה פחות מאשר חולדות לא מאומן 350 הרשות הפלסטינית וזרמים גבוהים יותר. יתר על כן, 4C דמות מראה כי חולדות שעברו הכשרה בת יום אחד הראה נח התחתון פוטנציאליים, גבוה יותר ספייק הסף, afterhyperpolarization עמוק יותר, בעוד יומיים חולדות שעברו הכשרה הראה פוטנציאל גבוה יותר מנוחה (איור 4C) ו- (התנגדות הממברנה איור 4D).

כפי שהסברנו בעבר¹¹, הכשרה IA (איור 1D) המושרה postsynaptic פלסטיות-הסינפסות סינאפסות של הנוירונים hippocampal CA1. על ידי מדידת ההשהיה בתיבת אור, אנחנו יכול להעריך את הביצועים למידה הקשרית של העכברוש. איור 1E מציגה את התוצאות של הפעילות IA. לאחר ההלם החשמלי לזווג, החולדות ללמוד להימנע הצד האפל של תיבת להישאר בצד המואר, אשר בדרך כלל שהם מעדיפים לא. הנטייה להימנע הצד האפל מציין ולכן רכישת זיכרונות הקשרית.

איור 5 מראה דוגמה של ניתוח מתח-קלאמפ במיזעור אילו זרמי postsynaptic שונו באופן דרמטי לאחר למידה הקשרית. לחקור פלסטיות הנוצרות על-ידי למידה, mEPSCs בתיווך אמפא ספונטנית ו- GABA_A-mIPSCs בתיווך הוקלטו ברצף בנוכחות טטרודוטוקסין 0.5 מיקרומטר (איור 5 א ו- B). כפי שמוצג על מגרשים דו מימדי (איור 5C), כל נוירון CA1 היה שונה רשע amplitudes עבור mEPSCs ו- mIPSCs. למרות amplitudes היו נמוכים והראה רכס צר הפצה ב כשרמת, אינטראקצית, שלב אחר שלב חולדות, ואלה היו מגוונות בחולדות מאומן IA (טבלה 5). אנובה שלאחריה יבוא ניתוח פוסט-הוק הראו עלייה משמעותית amplitudes אכזרי של mEPSC mIPSC בחולדות מאומן IA (איור 5E), רומז הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות postsynaptic בתוך הנוירונים CA1.

יתר על כן, כל נוירון CA1 הציג תדרים mEPSC, mIPSC שונים (איור 5D). למרות התדרים היו נמוכים והראה רכס צר הפצה ב כשרמת, אינטראקצית, שלב אחר שלב חולדות, ואלה היו מגוונות בחולדות מאומן IA (טבלה 6). אנובה שלאחריה יבוא ניתוח פוסט-הוק הראו עלייה משמעותית התדרים של האירועים mEPSC ו- mIPSC בחולדות מאומן IA (איור 5F). ישנם שני פירושים אפשריים של תוצאות אלו. הראשונה היא כי לימוד הקשרי גדל המספר של הסינפסות פונקציונלי של הנוירונים. השני הוא כי לימוד הקשרי הגדיל את הסבירות presynaptic שחרור גלוטמט ו- GABA.

לבחון יותר פלסטיות presynaptic, ערכנו גם בזוגות...-דופק stimulations, כפי שדווח בעבר^10,11.

איור 1 : למידה ביצועים אחרי האימונים.
A: הנבחנים מציגה את הרוטור רוד אימון המוח הילתית פרוסה. B: ההשהיה מתכוון ליפול מן החבית רוד הרוטור מאיץ. C: ההשהיה אומר ארבעה חודשים המוט על הראשון ועל הניסויים הסופי על הכשרה בימים 1 ו- 2⁷. P< 0.01 לעומת במשפט הראשון. D: סכימה של הימנעות מעכבות (IA) הפרונטליים של פעילות המוח הפרוסה. E: ההשהיה רשע כדי להזין בתיבת כהה לפני ואחרי אימון IA¹¹. P< 0.01 לעומת לפני אימון IA. המספרים לפי הסעיפים הילתית מציינים את מרחק והשתרשה עמוק בלבה bregma במ מ. מספר החיות מוצג בתחתית של הסורגים. קווי שגיאה מציינים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : פורסים נהלים.
A: תמונות להראות את הכנת פרוסות המוח חריפה. כלי ניתוח היו מקורר בתוך קרח כתוש לפני השימוש. B: המוח חיתוך וגיזום. שימו לב כי הזווית של זמירה בצד האחורי יהיה מכוון במקביל כיוון דנדריטים. C: לחתוך את המוח בתוך תא vibratome. המוח הוא טובל במאגר לנתיחה, מבעבע ברציפות בתערובת 5% CO₂/95% O₂ גז. D: חדר הממשק העשוי שני מיכלי מזון פלסטיק, צינור סיליקון. החדר היה מלא נוזל מוחי-שדרתי מלאכותי, מבעבע ללא הרף עם תערובת גז. E: פרוסות המוח הונחו על נייר סינון רטוב בבית הבליעה.בר = 5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : תיקון קלאמפ נהלים.
A: מערכת תיקון-קלאמפ שישמשו להקלטת אותות חשמליים של נוירון. המיקום של מגרה את הקלטת אלקטרודות שכבה II/III הנוירונים מוצגים קליפת המוח המוטורית חולדה. B: כדי לנתח את הסינפסות שפר של נוירון כפירמידה CA1, הונח על אלקטרודה מגרה radiatum הרובד. כדי לנתח temporoammonic הסינפסות, אלקטרודה מגרה שהיתה ממוקמת moleculare שכבה. נציג עקבות של אמפא עורר ומוצגים NMDA קולטן בתיווך סינאפסות postsynaptic זרמים בתוך הנוירון CA1 אותו. C: עוגן פרוסה שימש כדי לייצב את הפרוסה בתא ההקלטה. D: מפת ייצוג בתוך קליפת המוח המוטורית, המבוססת על ה^15,16,של מאמרים שפורסמו¹⁷. מ ל = קו האמצע. E: IR-DIC micrographs של M1 שכבה II/III נוירונים לפני (העליון) במהלך ההקלטה (התחתון). בר = 10 מיקרומטר. F: שינויים פיפטה הנוכחי לפני המגע (העליון), קרום קרע (התחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : נציג תוצאות של ניתוח הנוכחי-מהדק⁷ .
A: עקבות נציג של פוטנציאל הפעולה שנרשם לאחר אינדוקציה עם זריקות הנוכחי. B: קשרי הגומלין בין רשע הקלט הנוכחי (pA) לעומת פוטנציאל הפעולה פלט (מספר קוצים) פרוסות המוח לא מאומן (הסורגים פתוח), 1-יום מיומן (סרגלים אפורים), חולדות שעברו הכשרה יומיים (ברים מלא). C: נח פוטנציאל הסף, afterhyperpolarization של הנוירונים שכבה II/III. D: עמידות קרום ועמידות סדרה של הנוירונים. השתמשנו 9-10 חולדות בכל קבוצה. מספר התאים מוצג בתוך כל עמודה. קווי שגיאה מציינים ב- SEM. *P< 0.05, * *P< 0.01 לעומת רוצה לנצח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : נציג מתוצאות ניתוח מתח-קלאמפ¹¹ .
נציג עקבות זעירים סינאפסות postsynaptic זרמים (mEPSCs ו- mIPSCs) ב מאומנת (A) והימנעות מעכבות (IA)-אומן חולדות (B). mEPSCs ב-60 mV ו mIPSCs ב 0 mV נמדדו ברצף ב CA1 באותו הנוירון כפירמידה בנוכחות טטרודוטוקסין (0.5 מיקרומטר). הסרגל האנכי = 20 הרשות הפלסטינית, אופקי בר = 200 מילישניות. C: דו מימדי מתווה של הממוצע אותי (I) PSC amplitudes ב רוצה לנצח, מאומן IA, אינטראקצית, וחולדות שלב אחר שלב. D: דו מימדי חלקות האני (I) PSC התדרים 4 קבוצות. הערה כל נוירון CA1 הציג שונה לא לי (I) PSC amplitudes תדרים. IA אימון לא רק חיזקה את amplitudes רשע (E) אבל גם הגדילה התדרים של האני (I) PSC אירועים (F). השתמשנו 4-6 חולדות בכל קבוצה. מספר התאים מוצג בתחתית של הסורגים. סימן פלוס אדום (C, D) וברים עם קווים אנכיים (E, F) לציין את זאת אומרת ± ב- SEM. * *P< 0.01 לעומת כשרמת חולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מאגר לנתיחה (סה כ 1 ליטר)
NaH2PO4 • 2 H2O	0.195 g	1.25 mmol/L
אשלגן כלורי	0.188 g	2.5 mmol/L
CaCl2	0.074 g	0.5 mmol/L
MgCl2 • 6-אייץ '2O	1.423 g	7.0 mmol/L
כולין כלוריד	12.579 g	90 mmol/L
חומצה אסקורבית	2.340 g	11.6 mmol/L
פירובט	0.342 g	3.1 mmol/L
NaHCO3	2.100 g	25 mmol/L
גלוקוז	4.500 g	25 mmol/L

טבלה 1: מתכון מאגר לנתיחה

נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (סה כ 1 ליטר)
אשלגן כלורי	0.186 g	2.5 mmol/L
NaCl	6.700 g	114.6 mmol/L
NaH2PO4 •2H2O	0.156 g	1 mmol/L
גלוקוז	1.800 g	10 mmol/L
NaHCO3	2.184 g	26 mmol/L
MgCl 1 מ'2	4 מ"ל	4 mmol/L
CaCl 1 מ'2	4 מ"ל	4 mmol/L

בטבלה 2: מתכון. מלאכותית נוזל מוחי שדרתי (CSF)

פתרון תאיים קלאמפ הנוכחי (סה כ 200 מ)
אשלגן כלורי	0.0746 g	5 mmol/L
K-Gluconate	6.089 g	130 mmol/L
HEPES	0.476 g	10 mmol/L
EGTA	0.0456 g	0.6 mmol/L
MgCl 1 מ'2	500 ΜL	2.5 mmol/L
נה2 ATP	0.4408 g	4 mmol/L
נה3 GTP	0.0418 g	0.4 mmol/L
נה phosphocreatine	0.510 g	10 mmol/L

טבלה 3: מתכון פתרון תאיים קלאמפ הנוכחי הקלטה

פתרון תאיים קלאמפ מתח (סה כ 200 מ)
CsMeSO3	5

.244 g (5.814) ^* 115 mmol/L (127.5) ^* CsCl 0.672 g (0.252) ^* 20 mmol/L (7.5) ^* HEPES 0.476 g 10 mmol/L EGTA 0.0456 g 0.6 mmol/L MgCl 1 מ'₂ 500 ΜL 2.5 mmol/L נה₂ ATP 0.4408 g 4 mmol/L נה₃ GTP 0.0418 g 0.4 mmol/L נה phosphocreatine 0.510 g 10 mmol/L * Cl^– ריכוז להקלטות מיניאטורי

בטבלה 4: מתכון פתרון תאיים עבור מתח קלאמפ הקלטה

פרמטרים		לא מאומן	IA מאומן	אינטראקצית	ללכת דרך
mEPSC משרעת	סטיה	5.8	32.1	4.7	5.9
	סטיית תקן	2.4	5.7	2.2	2.4
	מקדם של וריאציה	0.189	0.326	0.177	0.190
mIPSC משרעת	סטיה	17.1	56.7	31.8	20.7
	סטיית תקן	4.1	7.5	5.6	4.5
	מקדם של וריאציה	0.279	0.387	0.367	0.286

טבלה 5: המגוון של המיניאטורות סינאפסות postsynaptic הנוכחית (mEPSC ו- mIPSC) amplitudes ב הימנעות מעכבות (IA)-אומן חולדות

פרמטרים		לא מאומן	IA מאומן	אינטראקצית	ללכת דרך
mEPSC תדר	סטיה	278	2195	188	195
	סטיית תקן	17	47	14	14
	מקדם של וריאציה	0.902	1.198	0.893	0.874
mIPSC תדר	סטיה	3282	27212	1385	5135
	סטיית תקן	57	165	37	72
	מקדם של וריאציה	1.195	1.006	0.955	0.836

טבלה 6: המגוון של המיניאטורות סינאפסות postsynaptic הנוכחית (mEPSC ו- mIPSC) תדרים בהימנעות מעכבות (IA)-אומן חולדות

Discussion

המגבלה העיקרית של הטכניקה מלחציים תיקון פרוסה היא ההקלטה בהכנה פרוסה, אשר עשוי לא לשקף מה קורה בתוך vivo. למרות ויוו הנוכחי-קלאמפ ניתוח הוא אמין יותר, הוא מאתגר מבחינה טכנית כדי לקבל מספיק נתונים מבעלי בהכרה. מאז כל נוירון כפירמידה יש מאפיינים שונים הסלולר, מספר התאים יש צורך לנתח את הבדלי נוירונים כראוי לאחר אימון. יתר על כן, מתח-קלאמפ ניתוח דורשת טיפול רציף סמים עם CNQX, APV או bicuculline כדי לקבוע את אופי התגובות postsynaptic. כדי לנתח את התגובות מיניאטורי שנגזרות של שלפוחית יחיד של גלוטמט או GABA, טיפול מתמשך עם טטרודוטוקסין יש צורך לחסום את פוטנציאל פעולה ספונטנית. למרות טכניקת דימות שפותחו לאחרונה פוטון רב עוצמה לניתוח שינויים מורפולוגיים הסינפסות סינאפסות¹⁹, טכניקה מלחציים תיקון משולב יש צורך לנתח את הפונקציה של הסינפסות ויוו. . זה כרגע די קשה כדי לנתח שינויים מורפולוגיים-הסינפסות מעכבות, מאז הסינפסות ביותר המעכבת לא בצורת קוצים. בשלב זה, המלחציים תיקון פרוסה יהיה הטכניקה המתאימה ביותר כדי לנתח מאפייני תא או את הפונקציות של סינאפסות מעכבות סינפסות החיות.

באמצעות ניתוח הנוכחי-קלאמפ (איור 4), דיווחנו לאחרונה מנוע הנוצרות על-ידי למידה מהותי פלסטיות בנוירונים שכבה II/III. באופן ספציפי, חולדות שעברו הכשרה בת יום אחד הראה על ירידה משמעותית נח קרומית אפשרית ועלייה על הסף ספייק. העכברושים מיומן יומיים הראו עלייה משמעותית נח פוטנציאל ממברנה שהובילו דעתנית מוגברת. תוצאות אלה הציע כי שם היו שינויים דינמיים פלסטיות מהותי של M1 שכבה II/III נוירונים בחולדות שעברו הכשרה. מתח נוסף-קלאמפ ניתוח גילה עלייה היחס דופק לזווג בחולדות שעברו הכשרה בת יום אחד, רומז שהיתה ירידה presynaptic גאבא שחרור ההסתברות⁷ארעי. לכן אפשרי הזה עכבה של הקדמית של גאבא בשכבת II/III synapses עלול לגרום פלסטיות הנוצרות על-ידי למידה שנוצר ב- M1. כדי לתמוך בזה, פרוסה הכנת M1 דורש לערוך טיפול באמבט עם חוסם קולטן GABA_A לזירוז LTP²⁰.

ניתוח של פוטנציאל postsynaptic מיניאטורי היא דרך רבת עוצמה כדי לזהות הפלסטיות הסינפטית בבעלי חיים מאומן IA. נוירון CA1 רציפים הקלטה של mEPSCs ושל mIPSCs יחיד מאפשרת הניתוח של הכוח סינאפסות מעכבות סינפטית של כל נוירון הפרט. מאז בודד לי (I) PSC התגובה מיוחס של שלפוחית יחיד של גלוטמט או GABA, עלייה בי (I) PSC משרעת מרמז postsynaptic חיזוק. באמצעות לי (I) ניתוח PSC, מצאנו הבדלים בעוצמת סינאפסות מעכבות קלט לתוך כל נוירון CA1 (איור 5C). IA הכשרה בבירור קידום הגיוון בעוצמתם סינפטית, אבל זה לא נצפתה קבוצות אחרות (טבלה 5).

למידה-induced גיוון סינפטית ניתן לנתח מתמטית. על-ידי חישוב ההסתברות מראה של כל נקודה, ניתן להמיר נתונים כל נוירון העצמי-אנטרופיה (קצת) באמצעות תורת המידע קלוד שאנון²¹. נקודה בהסתברות גבוהה מראה (סביב הרמה מרושע) מציין העצמי-אנטרופיה נמוכה, בעוד נקודה בהסתברות מאוד נדירה (נקודה סטיה) מציין העצמי-אנטרופיה גבוהה. לעומת חולדות מיומנת, העצמי-האנטרופיה לכל תא עצב היה בבירור גדל בחולדות מאומן IA, אך לא נמצא אינטראקצית או חולדות שלב אחר שלב²². ניתוח זה עולה כי חלה עלייה מידע אינטרה-CA1 לאחר הלמידה הקשרית.

הטכניקה מלחציים תיקון פרוסה יכול לשמש גם עבור פחד מרומז מיזוג מחקרים ב אמיגדלה לרוחב⁹ , חוויה חושית בחקר קליפת חבית⁸. יתר על כן, ניתן להשתמש בטכניקה זו עם טכניקות שונות אחרות לחקירה נוספת. למשל, וירוס בתיווך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-טכניקה משלוח ג'ין מתויג יכול להיות משולב עם הטכניקה מלחציים תיקון כדי לנתח את הפונקציה של מולקולות ספציפיות. בנוסף, ניתן להשתמש microinjection מוקד של מכשיר מעקב רטרוגרדית להמחיש נוירונים ספציפיים הפרויקט על אזור מסוים. לאחר מכן, באמצעות הטכניקה הנוכחית-קלאמפ, המאפיינים הספציפיים תא ניתן לנתח את הנוירונים מטמיעים²³. עוד יותר, שילוב של שני הפוטונים סריקה בלייזר מיקרוסקופ עם שני הפוטונים לייזר uncaging של גלוטמט שימש כדי להדגים גידול ספציפי עמוד השדרה ואת התגובה EPSC עכבר קורטיקלית שכבה II/III נוירונים כפירמידה¹⁹. לכן, להיות שיפור הטכניקה מלחציים תיקון פרוסה על-ידי שילוב עם כימיקלים הרומן המסירה הגן, טכניקות מניפולציה תמונה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rota-Rod Treadmills	Med Associates Inc.	ENV577
inhibitory avoidance box	Shinano Seisakusho
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku
Blade	Nisshin EM Co., Ltd	LC05Z
Cardiac perfusion syringe	JMS Co., Ltd	JS-S00S
Vibratome	Leica Microsystems	VT-1200
Horizontal puller	Sutter Instrument	Model P97
Microfilm 34 gauge	World Precision Instruments, Inc	MF34G-5
0.22 µm filter	Millipore	SLGVR04NL
Axopatch–1D amplifier	Axon Instruments
Digidata 1440 AD board	Axon Instruments
pCLAMP 10 software	Axon Instruments
Upright Microscope	Olympus	BX51WI
CCD camera	Olympus	U-CMAD3
Camera controller	Hamamatsu Photonics K.K.	C2741
Stimulator	Nihon Kohden	SEN-3301
Isolator	Nihon Kohden	SS-104J
Motorized manipulator	Sutter Instrument	MP-285
Micromanipulator	Narishige	NMN-21
Peristaltic Pump	Gilson, Inc	MINIPULS® 3
Glass capillary	Narishige	GD-1.5
Ag/AgCl electrode	World Precision Instruments, Inc	EP4
Slice Anchor	Warner instruments	64-0252
Stimulus electrode	Unique Medical Co., Ltd	KU201-025B
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Dissection buffer/ artificial CSF
NaH2PO4 • 2H2O	Sigma-Aldrich Co.	C1426
KCl	Wako Pure Chemical Industries	163-03545
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries	039-00475
MgCl2 • 6H2O	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
Choline chloride	Sigma-Aldrich Co.	C7527
Ascorbic acid	Wako Pure Chemical Industries	190-01255
Pyruvic acid Na	Wako Pure Chemical Industries	199-03062
NaHCO3	Sigma-Aldrich Co.	28-1850-5
Glucose	Sigma-Aldrich Co.	07-0680-5
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
K-Gluconate	Sigma-Aldrich Co.	G4500
HEPES	Wako Pure Chemical Industries	346-01373
EGTA	Wako Pure Chemical Industries	348-01311
Na2 ATP	Nacalai Tesque	01072-24
Na3 GTP	Sigma-Aldrich Co.	G-8877
Na phosphocreatine	Sigma-Aldrich Co.	P-7936
CsMeSO3	Sigma-Aldrich Co.	C1426
CsCl	Wako Pure Chemical Industries	033-01953
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Drugs in aCSF
2-Chloroadenosine	Sigma-Aldrich Co.	C5134
Picrotoxin	Sigma-Aldrich Co.	P-1675
Tetrodotoxin	Wako Pure Chemical Industries	207-15901
CNQX	Sigma-Aldrich Co.	C239
APV	Sigma-Aldrich Co.	A5282