ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Summary

אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.

Abstract

פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקטור חזק של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם וניתן להפריד בין 3 משטרי צמיחה: שלב בפיגור, שלב שלב, שלב נייח. כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר הקשורים לתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. מדידות ברזולוציה גבוהה וכמותית של כל 3 שלבי הצמיחה הם בדרך כלל קשה להשיג. כאן אנו מציגים שיטה מפורטת לאפיין את כל השלבים 3 צמיחה על מדיה מוצקה באמצעות assay שנקרא תא בודד הכפלת הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). ODLAY מכמת פנוטיפים הצמיחה של תאים בודדים גדל מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ. שיטה זו יכולה ישירות לבחון את ההטרוגניות האוכלוסייה עם כל פרמטר הצמיחה בתאים זהים גנטית גדל מושבות. הטרוגניות אוכלוסייה זו מציעה נקודת מבט ייחודית להבנת רגולציה גנטית ואפיגנטית ותגובותהפרעות גנטיות וסביבתיות. בעוד שיטת ODLAY מודגם באמצעות שמרים, זה יכול להיות מנוצל על כל המושבה היוצרים מיקרואורגניזם זה גלוי על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר.

Introduction

פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקציה חזקה של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם למצב סביבתי נתון. הצמיחה מופרדת באופן קלאסי לשלושה משטרי צמיחה שונים: שלב השלב, שלב הפאזה וצמיחת פאזה נייחת ¹ . כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר התלויים בתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. לדוגמה, זמן השהיה, או משך הזמן האורגניזם מבלה בשלב השהיה לפני תחילת הצמיחה מעריכי, יכול להצביע על יכולתו של אורגניזם להגיב לתנאים סביבתיים שונו ² . הכפלת זמן הגידול במהלך שלב הפלט, המדד הנפוץ ביותר של כושר הסלולר, מגלה את היעילות הכוללת של יכולתו של אורגניזם לחלק על ידי חילוף החומרים ושימוש בחומרים סביבתיים לשכפול. שלב נייחים, שבו הצמיחה לאחר שלב יומן מופחת במהירות, הוא אינדיקטור נוסף של כושר, שהוא קבועLy משמש נקודת סיום הצמיחה במקום מבוססי מבחני שמרים צמיחה.

כמה שמרים צמיחה שמרים זמינים כיום נחשב שיטות סטנדרטיות להערכת פנוטיפים הצמיחה בשמרים ^{3 , 4 , 5} . מבחני אלה מבוססים בעיקר על שיטות גידול שמרים או על מוצק או בתקשורת נוזלית. על מוצק התקשורת, המושבה להצמיד מבחני להעביר מספר קטן של תאים על גבי אגר מוצק עם סיכה, תאים שמרים מותר לגדול לתקופה מוגדרת של זמן. המושבות הם צילמו ואז הגודל שלהם מושווים בנקודת קצה מסוף ⁶ . אלה מושבות pinning המושבה הוכיחו חזקים וניתן להרחבה כדי ליצור מסך רחב הגנום. לאחרונה, הדמיה תקופתית באמצעות סורקים שטוחה שטוח עדשות יחיד רפלקס (SLR) מצלמות שולבו אלה מבחני להקליט צמיחה המושבה לאורך זמן ^{7 , 8, 9} . עם זאת, הפתרון של התקנים אלה מונע מהם לגלות תאים בודדים ולכן, אלה מושבות הצמיד המושבה לא ישירות לצפות בפיגור זמן ולא ניתן להבחין וריאציה בין תאים בודדים לגדול לתוך מושבות.

מבחני צמיחה מבוססי נוזלים הועסקו גם כדי לבצע מסכי גנום רחבים ³ . צימוד assay צמיחה נוזלית עם מיקרוסקופ זמן לשגות חשף ההטרוגניות האוכלוסייה בזמן הכפלת תאים בודדים זהים גנטית, אשר מציעה נקודת מבט חשובה להבנת רגולציה גנטית הסתגלות סביבתית. עם זאת, assay זה אינו מודד היבטים אחרים של צמיחה כגון זמן השהיה כושר נשיאה ¹⁰ . כאן אנו מציגים שיטה לאפיין את כל שלבי הצמיחה של המושבה להרכיב מיקרואורגניזמים על מדיה מוצקה באמצעות assay אנחנו מונח ODELAY ¹¹ . ODELAY מורכב utiliZing גבוהה התפוקה זמן לשגות מיקרוסקופ כדי להקליט תמונות של תאים בודדים גדל לתוך מושבות על מוצק התקשורת. אוכלוסייה זו של תאים בודדים הגדלים לתוך מושבות מגלה את ההטרוגניות הבסיסית של האוכלוסייה, אשר לא זוהה על ידי מדידות פחות רגישות אחרות כגון ניקוד נקודות קצה סופיות. אנו מדגימים את השיטה על שמרים, אבל ODELAY ניתן להחיל על כל אורגניזם זה מראה בניגוד מיקרוסקופ שדה בהיר.

Protocol

1. הכנת מלאי ג'ל Agarose

1. לשקול את 2 גרם של agarose טוהר גבוהה.
2. מוסיפים את agarose לבקבוק 500 מ"ל ולהקליט המסה המשולבת שלהם.
3. חישוב מסה היעד של הבקבוק בתוספת 2 גרם agarose עם 150 גרם של מים טהור במיוחד, ולאחר מכן להוסיף 150 גרם של מים טהור טהור בתוך 0.1 גרם של מסה זו היעד.
4. הערה מסה של הבקבוק בתוספת agarose ומים.
5. מניחים את הבקבוק במיקרוגל ולוודא כדי להתאים את הבקבוק עם כובע רופף על מנת לצמצם את אידוי המים תוך חימום agarose.
6. מיקרוגל את הבקבוקים 15 - 20 s ואחריו קצר מתערבל את הבקבוק כדי לערבב את agarose ומים. חזור על הליך זה עד הפתרון הוא רותח התערובת היא הומוגנית.
   זהירות: היזהר כדי למנוע הצטלקות העור עם אדים לברוח הבקבוק. כמו כן, הבקבוק יהיה חם למגע והגנה נאותה, כגון כפפה החיטוי, נדרש כדי למנוע פגיעה.
7. לאחר agarose מותך הוא הומוגני, לשקול את הבקבוק שוב להוסיף מים ultrapure לתוך 0.1 גרם של המסה המקורית. זה יחליף את כל המים לאיבוד עקב אידוי.
8. לפני agarose מותך מתקשה, מערבולת לערבב במים הוסיף כדי להבטיח הומוגניות.
9. Aliquot 15.2 גרם של agarose לתוך 9 - 50 צינורות פלסטיק מ"ל.
10. לקרר את הצינורות עד הצורך.

הכנת ODELAY Agarose מדיה

1. מחממים 400 מ"ל של מים deionized לרתיחה בתוך כוס מכוסה, על hotplate תחת ערבוב עדין עם מגש מערבי בר.
2. הוסף 2 מ"ל של 10x התקשורת ( למשל , שמרים חלץ פפטון (YEP), או להשלים להשלים תערובת (CSM)) כדי 15.2 גרם agarose aliquot בצינור חרוטי 50 מ"ל משלב 1.10.
   הערה: המדיום CSM נוטה להיצמד לשקופיות הזכוכית. אם באמצעות CSM מדיה ניסוחים, להוסיף 5 μL של 50% WT פוליאתילן גליקול (PEG) במים סטריליים כדי ניסוח בינוני. PEG מונע אGar מ דבק על שקופיות זכוכית במהלך שחרור עובש אינו מעכב צמיחה שמרים.
3. הוסף תוספים נוספים 100X מזין, אם יש צורך, ולהשתמש במים כדי להביא את נפח הוסיף הכולל משלב זה 1 מ"ל.
4. לשקול את aliquot agarose עם התקשורת הוסיף ותוספות לפני הצבת צינור חרוטי 50 מ"ל לתוך מים רותחים משלב 2.1.
5. לאחר 16 דקות, להוציא את הצינור 50 מ"ל ו homogenize את התערובת באמצעות מערבולת. שמור את הכובע מהדק חזק על צינור חרוטי 50 מ"ל.
   הערה: מכסה על כוס עוזר לחמם את הצינור כולו בצורה שווה אחרת סרט של agarose מוצק יהוו ואולי לא להמיס. גם במהלך תקופה זו, זה נוח להרכיב את agarose עובש ( איור 1 ).
6. Homogenize את התערובת באמצעות מערבולת.
7. מרתיחים 2 דקות נוספות כדי להבטיח את כל אגר הוא מעורב ונמס.
8. שקול צינור ולהחליף את כל המונית איבדה עם מים סטרילי טהור במיוחד.
9. הוסף 2 מ"ל של 10X פחמן חמוץCE מגיב ( למשל , 20% w / v גלוקוז) ו מערבולת כדי להשיג פתרון בינוני agarose.
   הערה: הפרדת זכוכית Slides: בעת הרכבת עובש, יש לנקוט בזהירות כדי לוודא את המרווחים ארוכים ממוקמים עובש עם כיוון הנכון. הסיבה לכך היא כמו לייזר חתכים אקריליק, הוא נוטה לחתוך כמו חרוט עוזב את החלק עם צדדים מעט זווית במקום בדיוק 90 ° הצדדים. ואז, כאשר התבנית ממוקמת על benchtop כדי לשחרר את הכוס מן אגר, קצה spacer צריך להיות בזווית חריפה עם אגר. הזווית החדה מסייעת לדחוס את קצה האגר הרחק מהחלק העליון של הזכוכית כאשר הקצה החיצוני של spacer עובש הוא סובב על הקצה התחתון (ראה איור 1 ). התוצאה היא הפרדה עקבית יותר של אגר מהחלק העליון של זכוכית.
   הערה: סוכני שחרור עובש מוחל על זכוכית כמו שמנים, תרסיסים סיליקון או אפילו טיפולים חלון מסחרי לא אמור לשמש כי הם מזהמים את Urface של אגר ואולי לעכב את הצמיחה. שיטות אלה לוקחות קצת תרגול להיות עקבי.
10. נקה ארבעה 2 ב x 3 ב x 1 מ"מ שקופיות זכוכית עבה עם אתנול 70% ויבש באמצעות אוויר מאולץ.
11. נקי תבניות אקריליק עם אתנול 70%, יבש, להרכיב כפי שמוצג באיור 1 . קח את שלוש חתיכות התחתונה, כפי שמוצג, להרכיב אותם, כך שתי חתיכות זהים סנדוויץ 'היצירה השלישית ( איור 1 ב ). מהדק את חתיכות הבסיס על כל צד באמצעות שני קליפים קלסר קטן ( איור 1C ). מניחים את הזוויות לתוך עובש ולוודא כי קרנף לייזר ממוקם כראוי ( איור 1E ).
12. מניחים את שקופיות זכוכית ניקה מיובש על עובש והחזק אותו במקום בעת הנחת שקופית זכוכית השני בצד השני. מהדק את הרכבה עם קליפ בינדר גדול ( איור 1D ). מהדק את שתי שקופיות עם קליפים גדול קלסר (Lass = "xfig"> איור 1D). ודא קליפ העליון קליפ נמצא במגע עם שקופית זכוכית חופפים עם אקריליק.
13. הוסף קליפים הנותרים שנותרו. שוב, ודא מלחציים ליצור קשר עם שקופית איפה זה חופף אקריליק ( איור 1D ).
    הערה: לפני מילוי התבנית התאספו עם אגר מותך, להבטיח את הקצוות אטומים על ידי pipetting כ 70 μL של אגר התקשורת מותכת לאורך הצד הפנימי של התבנית. אגר זה יהיה לחזק במהירות ולמנוע כל דליפות.
14. ממלאים את התבנית עם אגר מותך, הקפד להימנע השמנה בועות אוויר בתבנית.
    הערה: זה יכול להיעשות על ידי pipetting לאט את אגר מותך לאורך הקצה של התבנית. לאחר שהוא מלא, לאפשר עובש להתקרר במשך 40 דקות עד 1 שעה על 23 ° C טמפרטורת הסביבה. אם מותר לצנן זמן רב מדי את אגר עשוי שבר בתבנית.
    הערה: הפרדת עובש: הסרת נאות של עובש מן אגר יצוק חיוני כדי להבטיח מוצק אחידהאגר כרית עבור הצמיחה שמרים. אי - הבטחת הפרדה יעילה של התבנית בשלב זה תגרום להפרשי צמיחה המיוחסים לליקויים בפנקס האגר המוצק. מומלץ לבצע שלב זה מספר פעמים.
15. התחל על ידי הסרת קליפ התחתונה התחתונה. הסר את החלק התחתון של התבנית המורכבת משלושת החלקים דחוקה. החזק את השקופיות על-ידי דחיסתן ולאחר מכן הסר את הקליפים. הקפד לא להכות את הצדדים עובש תוך הסרת קליפים קליפ. זה יהיה לעוות את התקשורת.
16. מניחים את התבנית על קצה הספסל העליון כך בצד של עובש עם נקודה כחולה פונה כלפי מעלה בפינה השמאלית התחתונה ( איור 1E ). המקום אגודלים מתחת אקריליק ואת האצבע הראשונה על החלק העליון כלפי הקצה הפנימי של התבנית.
17. לאט ובזהירות לדחוף את האגודל נגד התבנית, כאילו pivoting את עובש spacer על הקצה התחתון שלה ( איור 1F ). החל קבועאבל לאט לאט הלחץ. משתמשים יראו הפסקה בועה באוויר מופיעים לאורך הקו שבו זכוכית העליון מכסה את spacer עובש.
18. לאחר שראה את קו ההפסקה הראשונית, המשך לדחוף מעלה עם אגודל וליישם לחץ קבוע. אגר צריך להתחיל להישבר מן הזכוכית בנקודה זו ( איור 1F ). המשך לסובב את התבנית כלפי מעלה. פעולה זו תרים את הכוס מבלי להחליקה. קו שבו אגר הוא מתקלף מן הזכוכית צריך להמשיך להתרחק קו הפסקה הראשונית.
    הערה: בשלב זה, אגר הוא דבק הן בתחתית ואת החלק העליון של הזכוכית. זה יקרה מדי פעם עם הקצה השמאלי ביותר. כל עוד השטח מעוות הוא לא באזור שבו שמרים הוא הבחין, זה צריך להיות בסדר.
19. כמו זכוכית מגיע לגמרי בחינם, לתפוס אותו ולהסיר אותו לחלוטין מן התבנית. ואז להסיר את חתיכת עובש אחרים באמצעות תנועה דומה להרים את חתיכת חינם מבלי להזיז את אגר. מניחים את השקופיות בעצה סטרילית עם כמה מים טוהר גבוהה טוהר בתחתית. סגור את התיבה ולאחסן ב 4 ° CO / N לשימוש למחרת. אם מאוחסן זמן רב יותר, שיעורי הצמיחה יהפכו לא עקביים.

3. ODLAY תרבות ההכנה

1. הניחו זנים בצלחת 96-היטב עבור O / N צמיחה.
2. למחרת, לדלל 20 μL של תרבות לילה לתוך 200 מדיה μL עבור נפח 220 μL הכולל בצלחת חדשה.
3. למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) של כל תרבות בקורא צלחת. באמצעות קורא צלחת ורופול טיפול נוזלי, בצע את הדילול האוטומטי פרוטוקול של 3.3.1 - 3.3.6. באופן ידני לדלל את התרבויות בצלחת כ 0.1 OD600 (אופציונלי).
   1. על הקורא צלחת, פגע "ניסוי" תחת "ליצור חדש". בחר ODELAYDilution.exp ולהפעיל את הניסוי. הזן את שם הניסוי כ- ODLAY "תאריך" "זמן" "ניסוי שם" איטרציה.
   2. לחץ על sTatistics ולאחר מכן לחץ על סמל Excel. שמור את הנתונים על כונן האגודל והעבר אותו למחשב רובוט לטיפול נוזלי.
   3. פתח את פריסת הרובוט ואת עורך השיטה. פתח את קובץ השיטה "ODELAYDilution_v1.med". הפעל את Execable "Convert_SynergyFiles.exe". הזן 0.09 עבור יעד OD600.
   4. לחץ על "תיקון Glu" ו "תיקון גאל" ל 0.05. מדידת מדיה ריקה בצלחת זהה. לחץ על "צור קובץ". בחר את הקובץ בעורך השיטה. לחץ על סמל הרמזור כדי להפעיל את השיטה כדי לפתוח את התוכנית דילול זמן ריצה.
   5. ודא צינורות הם uncapped וצלחות יש מכסים הוסר אבק מכסה מוסרים טיפים. טען צלחות, צינורות וטיפים על הסיפון של טיפול רובוט נוזלי, כפי שצוין על ידי פריסת הסיפון.
   6. לחץ על הלחצן "הפעל" כדי להפעיל את תוכנית הדילול. בחר את המספר הנכון של 50 עצות μL. בחר את המספר הנכון של 300 טיפים μL. חכה12 דקות עבור תהליך לרוץ.
4. קח את צלחת דילול מן הרובוט, לכסות את הטיפים, ולסכם את צינורות התקשורת 15 מ"ל. תרבות צלחת עבור 5 - 6 שעות ב 30 ° C.
5. בערך 1 - 2 שעות לפני תחילת הדילול השני הקפד להפעיל את תאי הדגירה של המיקרוסקופ. אפשר להם לאזן ב C ° או הטמפרטורה הנדרשת עבור הניסוי.
6. חזור על הצעדים דילול 3.3 - 3.4, אבל לדלל תרבויות OD600 של 0.01-0.02 עבור תצפית על תרבויות על שקופיות agarose.
7. מכסים את צלחת דילול עם חותם מקפיא מתכת.
8. Sonicate צלחת דילול באמבט קרח במשך 30 שניות עם צלחת צף במי קרח באמצעות צנטריפוגה מתכת דלי מתאים להחזיק את הצלחת ( איור 2 א ). מעבירים את התרבויות sonicated מן צלחת דילול לצלחת תחתית שטוחה. תווית 4 x 96-גם שטוח התחתון צלחות 1, 2, 3 ו 4 ( איור 2 ב ).
   1. העברות# 181; L של צלחת דילול מבארות A01 - D06 לתוך בארות C04 - F09 של צלחת שכותרתו 1. ואז להעביר 150 μL של צלחת דילול מבארות A07 - D12 לתוך בארות C04 - F09 של צלחת שכותרתו 2. ואז להעביר 150 μL של צלחת דילול מבארות E01 - H06 לתוך בארות C04 - F09 של צלחת שכותרתו 3. לבסוף להעביר 150 μL של צלחת דילול מבארות E07 - H12 לתוך בארות C04 - F09 של צלחת שכותרתו 4.
9. עבור לשלב 4, תצפית על אגר.

4. איתור על אגר באמצעות רובוט אוטומטי נוזלי תצפית

1. הסר את שקופיות agarose מאוחסן ב 4 ° CO / N (משלב 2.19) מן תיבות פיפטה סטרילי humidified שלהם.
2. אם יש צורך, לקצץ את הפינות של המדיום agarose עם להב סכין גילוח נקי על מנת להבטיח כי הם יתאימו על שקופית קאמרית.
3. הסר את השקופית מהדק את הר. בזהירות במקום צלחת אגר לתוך השטח הפסקה של הר בשלב הבמה.
   הערה: ודא שה- אוIentation של השקף הוא עקבי מניסוי לניסוי.
4. בדוק כדי לוודא את מהדק הוא סומק עם החלק התחתון של החדר. אם הוא מעוקם, אז השקופית לא יכול להיות מלא יושב באזור הפסקה. מניחים את spacer פילוס לתוך מרכז צלחת המיקום של רובוט תצפית. זה spacer מספק קשר עבור ברגים פילוס, כך החדר שקופית יכול להיות מפולס עם טיפים.
5. מניחים את הצלחות על השולחן לפי הסדר של הרבע שלהם. צלחות 1, 2, 3 ו 4 הורה משמאל לימין ( איור 2 ב ).
6. הניח את הטיפים כך הפנימי 24 בארות C04 - F09 עסוקים עם טיפים לתוך 4 תיבות קצה ריק. תיבה חמישית יהיה צורך טיפ אחד בעמדה C10, כמו גם 4 טיפים עם הקצוות שלהם לחתוך את A01, A12, H01, ו H12 עמדות. אלה 4 לחתוך עצות לספק יציבות עבור מהדק צלחת קצה ( איור 2C ו 2 ד ).
7. הסר את המכסה העליון מהשקעהר חדר אידיאלי.
8. מניחים את האגרוף טיפ הראשון לאתר ההתחלה של תוכנית בקרת הרובוט שליטה. זה צריך אגרוף חור agarose אשר מאוחר יותר לשמש ליישר את קואורדינטה המוצא. צלחת מקום 1 על הרובוט טיפול נוזלי לזהות את הרבע הראשון. ודא את המכסה הוסר ולהמשיך את תוכנית איתור.
9. בדוק כדי לוודא שכל הנקודות קיימות. כמו כן, המתן ~ 30 s להם להתייבש. כאשר כתמים על 1 מ"מ קוטר, התוכנית עשויה להמשיך. רוקן את הטיפים המשמשים לתוך מיכל biohazard, ומניחים עצות חדשות על הרובוט. להחליף את הצלחת 1 עבור צלחת ברבע השני.
10. חזור על הרבע השלישי. וחזור שוב על הרביע הרביעי.
11. כאשר כתמים יבש, להחליף את הכיסוי קאמרית השקופית להפוך את המנגנון מעל.
12. התקן את חיבורי הצינור עם מסנן אוויר.
13. מניחים שקופיות זכוכית בצד העליון של החדר.
    הערה: שקופית זו היא חיונית עבור reduciNg השטף החום על אגר וממזער את היווצרות של עיבוי על כיסוי אובייקטיבי להחליק בצד של החדר. אל תשכח את זה להחליק כיסוי. בהתאם לתצורת מיקרוסקופ, כיסוי זה להחליק מונע חימום מן הצד תאורה מ גורם עיבוי בצד המטרה.
14. מיקום מאוורר לפוצץ אוויר חם על הצד האובייקטיבי של החדר. מאוורר זה מונע עיבוי מן ההרכבה על הכריכה להחליק. הגדר את קצב זרימת האוויר דרך מבעבע ל 10 מ"ל / דקה.

5. הפעלת ODELAY על מיקרוסקופ

1. הפעל את התסריט "ODELAY_Microscope_Control.m".
2. לחץ על "תריס" כדי לפתוח את תריס האור המועבר ולאחר מכן את "פוקוס" כפתור ליזום את שיעור המצלמה גבוהה ( איור 3 א , חצים אדומים).
3. לחץ על "Go Origin" והזיז את הבמה כדי למצוא את סימן המקור שנחבט באגר.
4. ואז זז מעט ימינהלהתמקד תאים שמרים הבחין באזור E07.
5. חזור אחורה לנקודת המוצא ומרכז אותה בשדה התצוגה.
6. הגדר את המקור לערך זה על ידי לחיצה על כפתור "Set" ( איור 3 א , חצים כחולים). עכשיו לעבור למיקום H18 ולהתמקד באמצעות בורג hex הקרוב למקום. ואז לעבור למיקום L07 ולהתמקד באמצעות בורג hex הקרוב למקום. ואז לעבור למיקום E07 ולהתמקד באמצעות בורג hex הקרוב למקום.
7. חזור על שלבים 5.5 - 5.7 לפי הצורך עד שמיקומים אלה יישארו ממוקדים.
8. בדוק את המיקוד במרכז ובשוליים בנקודות E12, H12, L12. כוונן את טווח המיקוד האוטומטי אם המיקוד Z- ערכים, כפי שצוין על ידי ערך Z, הם יותר מ ± טווח פוקוס אוטומטי ( למשל , להגדיר את טווח פוקוס אוטומטי עד 60 מיקרומטר Z- ערך עבור נקודה מרכז גדול מ ± 40 מיקרומטר).
9. לחץ על לחצן האיפוס, שכן פעולה זו תפעיל את מאפייני הלחצנים ולאחר מכן לחץ עלODELAY ( איור 3 א , החצים הירוקים). בחר את הספרייה לשמירת הנתונים. ודא שיש מספיק מקום פנוי.
   הערה: המיקרוסקופ אוסף נתונים עבור 48 שעות, או עד לסיום התוכנית.

6. עיבוד נתונים ODELAY

1. פתח את ODLAY_IPT.exe או השתמש סקריפט ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m ( איור 3 ג ).
2. הכן * Excel ODELAYExpDisc.xlsx Excel גיליון אלקטרוני.
3. תן שם לניסוי בתא B1.
4. בחר את תיקיית התמונות שבה קובצי התמונות E07 - H18 מאוחסנים.
5. בחר את מדריך הנתונים שבו הנתונים יכתבו.
6. כתוב את התאריך שבו הניסוי התחיל לתא B04. השתמש בפורמט MM / DD / YYYY.
7. כתוב את זמן הדילול בתא C04. הפעם הוא בערך 5 דקות לפני התמונה הראשונה נאספת. השתמש בפורמט HH: MMpm שבו HH הוא עבור h ו- MM דקות.
8. הוסף את שמות המתח לפי tO צלחת המקור (שלב 3.1). בשל זנים דרך הם הבחינו, הם מסודרים על שקופית agarose ODELAY. תאים בגיליון האלקטרוני B31-B126 הם צלחת המקור, בעוד תאים C31 - C126 הם מיקומים ספוט צלחת אגר ODLAY.
9. לאחר מכן לחץ על כפתור "תהליך נתונים" ובחר את * ODELAYExpDisc.xlsx זה היה מוכן.
10. המתן 16-24 שעות בהתאם למערכת המחשב המשמשת לעיבוד נתונים.
11. כאשר התמונות מעובדות, תופיע ספריה בשם "ODLAY Well Data" וקובץ "* _ndex_ODELAYData.mat". לחץ על "טען נתונים" כפתור ובחר את "* _Index_ODELAYData.mat" הקובץ שנוצר רק. פעולה זו תעמיס את ערכת הנתונים שעובדה. השם "*" בשם הקובץ יופיע על פי שם הניסוי שהוזן בגיליון האלקטרוני של Excel.
12. לאחר טעינת הנתונים, לבדוק את זה באמצעות סרגל הזמן נמצא בחלק התחתון, לחץ על כיכר התמונה לראות עקומות הצמיחה ואו נקודה, או למצוא טוב של עניין ברשימה בצד שמאל ולאחר מכן לטעון את התמונות עבור רשימה זו.
13. צור היסטוגרמות של פרמטרים של גידול האוכלוסייה על ידי לחיצה על כפתור "כינור מגרש". זה יפיק מגרש שמוצג באיור 4 או איור 6 .

תוצאות

תמונות לדוגמה של שמרים גדל במיקרוסקופ זמן לשגות מוצגים באיור 3 ב . לאחר עיבוד הזמן לשגות תמונות, נתונים נציג קבוצה השוואת זנים שמרים BY4741 & BY4742 מוצג באיור 4 . במערך זה לדוגמה, יש וריאציה מעט מאוד זמן הכפלה בין עמדות שונות על הצלחת. אם בינוני agarose מוכן כראוי, אז סטייה ברורה הן זמן הכפלת זמן השהיה יהיה ברור עמדות נקודה חופפות עם האזור המעוות של ג'ל agarose. בעוד שכפול פעמים נראה אחיד יחסית, דוגמה זו מציגה שינויים במידות הזמן בפיגור. מערך נתונים עקבי יותר מוצג באיור 6 . במערך זה זמן הפיגור וכפל הזמן הם אחידים.

Files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg "/>
איור 1: אגר עובש עובש.
הרכיבים של עובש אגר מוצגים ב ( א ). להרכיב את הבסיס כפי שמוצג ב ( B ) ולאחר מכן מהדק את הבסיס עם קליפים קלסר קטן. מניחים את החלקים זקוף יותר בחלל של הבסיס ( ג ) ולאחר מכן המחנה שקופיות עובש כפי שמוצג ( D ). מבט צד מראה את הזווית של התבנית ואת הכיוון של קרף עובש הדרוש הפרדה עקבית של אגר מן השקופית זכוכית ( E ). הערה המיקום של האגודל ואת האצבע, כמו גם את הקו הישר של אגר להפריד את השקופית ( F ) ולשים לב את החץ האופקי. קו ההפרדה צריך לנוע באופן שווה לכיוון החצים האנכיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

= "Jove_content" עבור: keep-together.within-page = "1">
איור 2: שיטת סוניקציה ואיתור.
Sonicate את הצלחת במים הקרח באמצעות מחזיק דלי צנטריפוגות לעזור לתמוך את הצלחת ( א ). הנח את הצלחות ממדרגות 3.8.1 החוצה לזיהוי על צלחת agarose ( B ). כמו כן, לארגן את הטיפים כך את הקצה השמאלי ביותר קצה יש עצה אחת במצב C10 ולאחר מכן ארבעה טיפים אחרים עם הקצוות שלהם מנותקים כך שהם לא לקרוס את מחזיק צלחת ( ג ). מניחים את הטיפים הנותרים בארבעה קופסאות כך שהמקומות הפנימיים של 24 הטייסים כבושים ( D ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

55879fig3.jpg "/>
איור 3: ODELAY ממשק משתמש גרפי.
צילום מסך של ממשק משתמש גרפי עבור "ODELAY_Microscopecontrol.m" ( A ). ממשק זה מאפשר ניטור של המצלמה עבור התאמת הגדרות תאורה מיקרוסקופ עבור מצבי epifluorescent ובהיר שדה. החצים האדומים מצביעים על הלחצנים 'פוקוס' ו'מעבר 'המפעילים את המצלמה כדי לרכוש תמונות במהירות ולפתוח את תריס האור המועבר בהתאמה. החצים הכחולים משמשים להעתקת הבמה למקור ולאחר מכן הגדרת המקור עם הלחצן "Go Origin" ו- "Set". חיצים ירוקים מצביעים על "אפס" ו "ODELAY !!!" לחצנים המאפסים מצבי תמונה של ODELAY לתנאים הנוכחיים ומפעילים אוסף תמונות של ODELAY. זמן לשגות תמונות של שמרים גדל על בינוני מוצק ב 0, 3, 6, ו 9 שעות לאחר תצפית ( ב ). צילום מסך של ממשק המשתמש הגרפי עבור "ODELAY_IPT.m" או th עיבוד תמונה כלי ( C ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: דוגמה פלט ODLAY.
מערך נתונים זה משווה זנים BY4741 ו BY4742 על מדיה YPD. נתון זה הוא דוגמה של שקף agarose מוכן היטב; עם זאת, הגדרות פוקוס אוטומטי אינן אופטימליות. הנתונים המוצגים בכל עמוד, משמאל לימין, הם: יכולת הנשיאה ביומן ₂ באזור המושבה; הכפלת הזמן, נתון דקות; ו בפיגור זמן, נתון דקות. בדוגמה זו, פעמים הכפלה של כל הכתמים על קו השקופית אגר למעלה גם עם כמות קטנה של זמן הכפלת כפול לכיוון העמודה. עם זאת, פעמים בפיגור להשתנות במידה ניכרת במערך זה._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: דוגמאות לעקומת הצמיחה.
דוגמה זו ממחישה כיצד המיקוד הראשוני המסכן עלול לגרום לזמן השהיה המשוער (t _lag ) להגדלה ( A ), ואילו המיקום הסמוך מציג זמן פיגור קצר יותר ( B ). T _d הוא זמן הכפלת דקות, ו l _בפיגור הוא זמן השהיה דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6: דוגמה לניסוי המבוצע בהצלחה.
הXample של זן BY4742 נבדק לאחר החלפת נורת הלוגן טונגסטן עם מנורה דיודה ולהבטיח את המיקוד האוטומטי מוגדר כראוי. נראה כי כל זמני ההכפלה חופפים היטב והזמן בפיגור נראה עקבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

Assay ODLAY יש כמה נקודות קריטיות להבטחת המדידות פנוטיפי לשחזור ואמין. הנקודה הקריטית הראשונה היא הכנה עקבית של תרבויות השמרים. יש להקפיד לקצור את תאי השמרים מן הצמיחה הלוגריתמית. אם תרבויות יש רווי, אז ההטרוגניות האוכלוסייה שלהם יהיה מוגבר אשר עלול לערפל הטרוגניות הנגרמת על ידי גורמים גנטיים או סביבתיים ( למשל, מקור פחמן) ¹¹ . הנקודה הקריטית השנייה היא הכנה עקבית של התקשורת. באופן כללי, נפח גדול של פתרון 10X מדיה מלאי צריך להיות שנוצר ולאחר מכן נעשה שימוש לאורך זמן כדי למזער את האפקטים אצווה. גיבוש מדיה לפי משקל, ככל הניתן, מסייע לשפר את עקביות המדיום לאורך זמן על ידי הבטחת צפיפות של אגר ואת התוכן הכולל של המים של agarose ניתן לפקח מקרוב. הנקודה הקריטית השלישית כוללת מזעור או ביטול כל דפורמציה מכנית של agarose אותי. דפורמציה מכנית של התקשורת תהיה הנפוצה ביותר להתרחש במהלך ההפרדה של agarose מן שקופיות הזכוכית. כמו טכניקות מעבדה רבות, בפועל נדרש לשלוט בשלב זה.

שינוי בזמן בפיגור כפי שמתואר באיור 4 , קשורה לעיתים קרובות לאחד משלושת הגורמים: עיוות מכני של המדיום agarose, וריאציה בעובי אגר מעוצב, או מקור אור יציב. אם המדיום agarose משתנה Z- גובה על פני מערך מנומר, וריאציה גובה עלול להציף את טווח של שגרת פוקוס אוטומטי, גורם לתמונות הראשונית להיות קצת מחוץ להתמקד. מסיבה זו, לבדוק את גובה המיקוד במספר כתמים במרכז לאורך הקצוות של מערך הבחין כדי להבטיח את שגרת פוקוס אוטומטי יש מספיק טווח Z כדי למצוא את המיקוד. אם יש צורך, השתמש בחלונית 'פוקוס אוטומטי' כדי להגדיל את טווח המיקוד ולהגדיל את מספר שלבי המיקוד.

קונדיט שלישי אפשרייון שעלול להוביל להתמקדות ירודה הוא מקור אור לא יציב או מהבהב, אשר יכול לשבש את ציון המיקוד מחושב עבור Z- גובה מסוים. נורות הלוגן טונגסטן נוטים להבהב הרבה לפני הנורות לשרוף. ההשפעה של המיקוד לקוי הוא ציין בדוגמה אחת שבה עקומות הצמיחה לטבול בין הראשון והשני נקודות זמן ( איור 5 א ), ואילו במקום הסמוך אין לטבול אותו ( איור 5 ב ' ). במקרה זה, מצב המיקוד המסכן הוקל על ידי החלפת מקור האור הלוגן טונגסטן.

בפועל, המחברים מצאו כי כדי להפחית את הבהוב של 100W טונגסטן נורות הלוגן, הנורות צריך להיות מוחלף כל 500 שעות או בערך כל 2 חודשים כאשר המיקרוסקופים נמצאים תחת שימוש כבד. כדי למנוע בעיות מיקוד ירודות מנורה מהבהבת, החלף את מקור האור של הלוגן טונגסטן לעיתים קרובות או החלף את נורת ההלוגן באמצעות מקור אור דיודה. Anדוגמא למערך המציג וריאציה נמוכה בזמני ההכפלה וכן זמני פיגור אחידים יותר מוצגים באיור 6 . מערך נתונים זה נלקח עם דיודה מאיר אשר מספק תאורה יציבה יותר לאורך זמן תוך ביצוע פוקוס אוטומטי.

בעוד שרבים מהנקודות שהוזכרו כאן לאופטימיזציה של הכנת המדיה עשויות להיות מובנות מאליהן, בספרות המסכים הגדולים ביותר לא משכפלים היטב זה עם זה ^{8 , 11} . לכן, יש לנו תיאר בקפידה את ההכנה של תרבויות התקשורת agarose כך מסכי פנוטיפי לשחזור יותר עשוי להיווצר.

Assay ODLAY מוגבל כעת התפוקה בהשוואה להצמדת מבחני מבוסס כגון מערכים גנטיים סינתטיים או assay Scan-O-Matic. בעוד שיטות אלה להגדיל את מספר זנים נמדדים, הם חסרים יכולת לפתור תאים בודדים אNd ולכן לא ניתן למדוד הטרוגניות האוכלוסייה שאנו רואים בתוך זנים שמרים משובטים. מקור ההטרוגניות של אוכלוסייה זו אינו מובנת כיום, אך מיזוג הטכנולוגיה והחישוב כפי שמוצג כאן מציע הזדמנות להתייחסות אובייקטיבית למנגנונים הסלולאריים הבסיסיים ¹² .

המחברים מבקשים לציין כי ODELAY כרגע מותאם רק עבור מותג מיקרוסקופ מסוים סוג הגוף. שינוי ODLAY עבור מערכות מיקרוסקופ אחרות הוא ישר קדימה אבל ידרוש ידע של קוד פתוח ¹³ API. עם זאת, הן ה- API, כמו גם את הסקריפטים ODELAY כתובים להיות מותאמים בקלות למערכות שונות מבחני ניסיוני.

בעוד ODELAY פותחה במקור עבור שמרים, היינו מסוגלים לנצל את זה ללא שינוי כדי לבחון את הצמיחה של Mycobacterium smegmatis . תצפית של המושבה האחרת להרכיב מיקרואורגניזמים הואאפשרי עם שינויים בקוד המקור שסופק ¹¹ . באופן כללי, ODELAY הוא כלי רב עוצמה וגמיש להשוואת מיקרואורגניזמים הגדלים בתנאים סביבתיים שונים הפרעות גנטיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose UltraPure	ThermoFisher	16500500	Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm
Yeast Extract Peptone (YEP)	Fisher Scientific	BP1422-2
Complete Suplement Mixture (CSM)	Fisher Scientific	MP114560222
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)	SigmaAldrich	P2906
Yeast Strain BY4741	ThermoFisher	95400.BY4741
Yeast Strain BY4742	ThermoFisher	95400.BY4742
50 mL Falcon tubes	Corning	430291	1 case
15 mL Falcon tubes	Corning	352096
2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross	VWR	48382-179
96-well plate flat bottom	Corning	353072
Hydra liquid handleing robot	Thermo	1096-DT-100
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot	Hamilton
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS	Thermo	5527
Synergy H4 Plate Reader	Biotek	H4MLFAD
Leica DMI6000 B Microscope	Leica
Leica 10X/0.3NA objective	Leica	11506289
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera	Hamamatsu	C11440-22CU
MATLAB with image processing tool box	Mathworks
MicroManager	Open Imaging		https://micro-manager.org/
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software
ODELAY Microscope Chamber			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings
ODELAY Agar Molds			www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings