JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ג 'ל מסורתי ג' ל אלקטרופורזה (SGE) ניסויים דורשים מנגנון מסובך וצריכה כימית גבוהה. עבודה זו מציגה פרוטוקול המתאר שיטה זולה להפריד שברי DNA בתוך פרק זמן קצר.

Abstract

ג'ל אלקטרופורזה (SGE) היא השיטה הנפוצה ביותר להפרדת שברי דנ"א; ולכן היא מיושמת באופן נרחב על תחום הביולוגיה ואחרים. עם זאת, פרוטוקול SGE המסורתי הוא די מייגע, ואת הניסוי לוקח זמן רב. יתר על כן, צריכת כימי בניסויים SGE הוא גבוה מאוד. עבודה זו מציעה שיטה פשוטה ההפרדה של שברי דנ"א מבוסס על שבב SGE. השבב נעשה על ידי מכונת חריטה. שני סדינים מפלסטיק משמשים את אור גירוי ואת פליטה של ​​האות האופטי. אות הקרינה של להקות ה- DNA נאסף על ידי הטלפון החכם. כדי לאמת את השיטה, מופרדים 50, 100, ו- 1,000 bp DNA סולמות. התוצאות מראות כי סולם DNA קטן מ -5,000 BP ניתן לפתור תוך 12 דקות ועם רזולוציה גבוהה בעת שימוש בשיטה זו, המציין כי היא תחליף אידיאלי לשיטה המסורתית SGE.

Introduction

סלע ג'ל אלקטרופורזה (SGE) היא השיטה היעילה ביותר עבור הפרדת קטע DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ולכן הוא נחשב כלי רב תכליתי ב ביוכימי וביולוגי מנתח 6 , 7 , 8 . עם זאת, ניסויים רבים מצביעים כי SGE מוגבל על ידי ארבע הבעיות הבאות: (1) ההפרדות לוקח שעות רבות, ואפילו ימים; (2) הצריכה הכימית גבוהה מאוד; (3) זה דורש מנגנון מסובך ( למשל, תא אלקטרופורזה 2D, ספק כוח אלקטרופורזה, מערכת ג 'ל הדמיה); (4) מערכת הדמיה ג'ל יכול רק לראות את שברי ה- DNA מופרדים כאשר הניסוי הוא סיים. יתר על כן, ethidium bromide (EtBr), אשר נפוץ ב SGE 9 ,התחת = "xref"> 10, הוא mutagenic ו סרטן 11 , 12 . לכן, כפפות תמיד צריך להיות משוחק כאשר מסירת ג'לים המכילים EtBr.

נימי אלקטרופורזה (CE) יש יתרונות רבים 13 , 14 , 15 , 16 , 17 לעומת SGE, כגון פעולה אוטומטית, זמן ההפרדה קצר, וצריכה נמוכה יותר. עם זאת, מכשיר CE הוא די יקר. לכן, כדי להתגבר על המגבלות הללו, פותחה מערכת ( איור 1 ) להפרדת הדנ"א. מערכת כזו יכולה לא רק לצמצם באופן משמעותי את הצריכה הכימית ולשמור על זמן הניסוי SGE (<8 דקות), אבל זה יכול גם לבצע מעקב בזמן אמת של תהליך ההפרדה DNA ב agarose ג'ל על ידי הטלפון החכם. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, סטודנטים shouיהיה מסוגל לעצב לפברק את שבב SGE, להכין את הג'ל agarose שבב, להקים מערכת פשוטה SGE עם הטלפון החכם, ולתעד את תהליך הגירה דנ"א של agarose ג'ל.

Protocol

1. עיצוב בסיסי של שבב SGE

  1. השתמש בכל פלסטיק שקוף, כגון polymethylmethacrylate (PMMA) או פוליקרבונט.
    הערה: שבב SGE מודגם בתרשים 1B . שבב SGE מורכב חורים גלילי עבור חיץ TBE, ערוצי הפרדת DNA, ושני נתיבים מוטבע לאורך החורים של האלקטרודה.
  2. מייצרים מערכים של ערוצי SGE בלוק PMMA באמצעות לייזר מכונת חריטה.
    הערה: הפרמטרים הגיאומטריים של השבב תלויים בגודלו של הדנ"א שיופרדו. לדוגמה, הפרמטרים אופטימלי ערוץ עבור שבב SGE הם 2.5 מ"מ x 4.0 מ"מ x 90 מ"מ (רוחב x עומק x אורך) אם קטע ה- DNA הוא קטן מ 1000 bp.
  3. בהתבסס על עיצוב SGE, לפברק מסרקים כדי ליצור את הבארות שבב לטעינת דגימת DNA.

2. הכנת ג'ל Agarose

  1. הכן 0.5 × TBE על ידי ערבוב 10 × TBE (1 × TBE =89 מ"מ טריס, 89 מ"מ חומצת בור, ו 2 מ"מ EDTA; PH 8.4) ומים מזוקקים ביחס 1:19.
  2. הכן ג'ל agarose 1.0% עבור ההפרדה של סולמות DNA 100-BP.
    הערה: ריכוז agarose במאגר TBE 0.5x תלוי בגדלים של שברי ה- DNA להיות מופרדים.
  3. מקום 0.1 גרם של agarose לתוך בקבוק להוסיף 10 מ"ל של חיץ TBE 0.5x.
    הערה: נפח הפתרון מוכן צריך להיות פחות מ 1/3 קיבולת של הבקבוק.
  4. חותם את הבקבוק עם סרט משמר ולאחר מכן לחמם את תערובת agarose / חיץ במיקרוגל (בינוני, 1.0 דקות). לפני לשים את הבקבוק לתוך המיקרוגל, לעשות כמה חורים בסרט המשמר במקרה של פיצוץ.
  5. יוצקים 2.7 מ"ל של תמיסת agarose מומס לתוך 4 ערוצים של שבב SGE. מניחים את המסרק לתוך פתרון agarose כדי ליצור את הבארות.
    הערה: הפתרון agarose נמס יהיה להתקרר למצב ג'ל בטמפרטורת החדר 3 דקות מאוחר יותר.
  6. הסר את המסרק מ gEls להוסיף 0.9 מ"ל של חיץ TBE 0.5x כדי לכסות את הג'ל.

3. הפעלת אלקטרופורזה ב SGE שבב

  1. הפעל את מקור האור LED ו במקום 425 ל 505 ננומטר bandpass מסנן מעל מקור האור.
  2. מערבבים 14.4 μL של סולם DNA 100 BP ו 1.6 μL של SYBR גרין באמצעות וורטקסר.
  3. טען 4 μL של תערובת לתוך כל טוב של ג'ל agarose שבב SGE ( איור 2 ).
  4. שים את האלקטרודה לתוך שני נתיבים של שבב SGE.
  5. מניחים 550 עד 700 ננומטר bandpass מסנן מעל שבב SGE.
  6. הפעל את מקור המתח. הגדר את המתח החשמלי ל - 180 וולט (20 V / cm). הפעל את הטלפון החכם כדי להקליט את תהליך הפרדת דנ"א קטע ( איור 3 ).
  7. כאשר אלקטרופורזה הוא סיים 10 דקות מאוחר יותר, לכבות את מקור החשמל ואת האור LED.
  8. נקה את שבב SGE.

תוצאות

איור 4 , איור 5 , ואת איור 6 מייצגים תוצאה אופיינית לאחר ג'ל אלקטרופורזה של 50, 100, ו 1000 bp DNA סולמות. לאחר הניסוי, שברי הדנ"א היו מופרדים היטב. יתר על כן, דגימות אותו הופרדו 4 ערוצים של שבב SGE, מראה כי שברי DNA של אותו גודל ל?...

Discussion

Agarose ג'ל אלקטרופורזה מועסק נרחב עבור הפרדת DNA, RNA, וחלבון. עבודה זו מציעה שיטה חדשה להחליף את פרוטוקול אלקטרופורזה ג'ל המסורתית. תוצאות מדגימות כי 50, 100, ו 1000 bp סולמות DNA ניתן להפריד היטב כזה מכשיר קטן התאספו. היתרון הגדול של שיטה זו הוא כי לא רק זה יכול להפריד בין חומצו...

Disclosures

שום ניגוד אינטרסים לא הוכרז.

Acknowledgements

אנו מודים בהכרת תודה לתמיכה של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '21205078) וקרן המחקר לתכנית הדוקטורט להשכלה גבוהה של סין (No.20123120110002). עבודה זו נתמכה חלקית על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח של סין (2016YFB1102303), התוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (973Program, 2015CB352001), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (61378060).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10×TBEBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.T1051
50 bp DNA ladderTakara Bio Inc.3421A
100 bp DNA ladderTakara Bio Inc.3422A
1 kbp DNA ladderTakara Bio Inc.3426A
SYBR GREENTakara Bio Inc.5760A
AgaroseSigma-Aldrich CorporateV900510

References

  1. Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
  2. McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
  3. Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
  4. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
  5. Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
  6. Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
  7. Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
  8. Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
  10. Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
  11. Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
  12. Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
  13. Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
  14. Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
  15. Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
  16. Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
  17. Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
  18. Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124AgaroseDNASYBR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved