מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Summary

אנו מדגימים שיטה לתמונה מולקולות מרובות בתוך מבנים ננו הטרוגניים בדייקנות מולקולה בודדת, תוך שימוש בחוזקה מחודשת ובזהירות של נוגדנים שכותרתו fluorescently.

Abstract

הדמיה מבנים הסלולר הטרוגנית באמצעות מיקרוסקופית מולקולה אחת מולקולה כבר הפריע על ידי דיוק לוקליזציה מספקת יכולת ריבוב. באמצעות נוי פלורסנט סמנים fiducial ננו, אנו מתארים את תיקון סחיפה הליכי יישור נדרש להשיג דיוק גבוהה מיקרוסקופית לוקליזציה מולקולה אחת. בנוסף, אסטרטגיה חדשה ריבוב, madSTORM, מתואר שבו מולקולות מרובות ממוקדות באותו תא באמצעות מחייב רציף elution של נוגדנים פלורסנט. MDSTORM מודגם על תא T מופעל כדי לדמיין את מיקומם של מרכיבים שונים בתוך מבנה מרובה חלבון, מרובת חלבון הנקרא מיקרו קולסטר קולטן התא. בנוסף, היישום של madSTORM ככלי כללי להדמיה של מבנים רב חלבונים נדון.

Introduction

מגוון רחב של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה טכניקות פותחו כדי להתגבר על גבול עקיפה של מיקרוסקופ אור (~ 200 ננומטר). בין אלה היא קטגוריה של טכניקות הנקראות מולקולה מולקולה לוקליזציה מיקרוסקופית (SMLM) הכוללת צילום לוקליזציה לוקליזציה מיקרוסקופ (PALM) ו סטוכסטי שחזור אופטי מיקרוסקופ (STORM). טכניקות SMLM לשתף את השימוש fluorophores כי ניתן לעבור בין (פלורסנט) ו כבוי (כהה / צילום), המאפשר לוקליזציה רצף של הקרינה מ מולקולות בודדות ^{1 , 2 , 3} .

בשל תאימותו עם צבעים מסחריים זמינים מיקרוסקופים, ישיר STORM (dSTORM) הפך טכניקה SMLM שאומצה נרחב ⁴ . DSTORM יכול להשיג באופן קבוע ~ 10 ננומטר לוקליזציה דיוק, מוגדר אי ודאות בחישוב מרכז diffractיון מוגבל נקודת פונקציית התפשטות (PSF). עם זאת, למרות דיוק גבוהה מוערך באמצעות אלגוריתמים לוקליזציה ^{5 , 6 , 7} , קביעת מדויקת של המיקום בפועל של מולקולות בודדות כבר הקשו על ידי מספר נושאים. ראשית, תנועה מכנית של הבמה מיקרוסקופ במהלך רכישת התמונה מוסיף אי ודאות משמעותית דיוק לוקליזציה. כמו תמונות SMLM מתקבלים במשך אלפי מסגרות זמן לשגות, תנועות בקנה מידה ננו של הבמה מיקרוסקופ יכול לפגוע באופן משמעותי את הדיוק של התמונה ברזולוציה הסופי הסופי ⁸ . כדי לפצות על תנועת הבמה במהלך רכישת התמונה, סחיפה שלב הוא מוערך בדרך כלל מן ההתאמה מבוסס רגרסיה של לוקליזציה binned מן התמונה עצמה (קורלציה צולבת) או לוקליזציות רצף מ סמנים fiducial (תיקון fiducial) ^{1 , 9} . Howevאה, שיטות אלה דורשים אופטימיזציה של פרמטרים מרובים עבור כל מחסנית תמונה, ולא יכול להסביר את תנועות הבמה על קשקשים זמן קצר כגון רטט מכני. ננו-חלקיקי זהב וחרוזי ניאון רב-צבעוניים שימשו סמנים fiducial ב- SMLM, אך הם אינם תמונה יציבה, וכתוצאה מכך דיוק נמוך משמעותית לאחר תיקון סחיפה מאשר חנקן מרכז ניאון פלואורסצנטי נינו-יהלומים (FNDs) בשימוש In madSTORM ¹⁰ .

בנוסף למגבלה עקיפה, מיקרוסקופ אור מוגבלים עוד יותר על ידי גבולות ספקטרליים. הדמיה סימולטנית של מטרות מרובות דורש בדיקות פלואורסצנטי עם שאינם חופפים פרופילים ספקטרלית, בדרך כלל הגבלת מיקרוסקופ אור מבוסס פלואורסצנטי ל 6 צבעים ו SMLM ל 2-3 צבעים ^{4 , 11 , 12} . יתר על כן, סטייה כרומטית לא ליניארית גורמת לאי-התאמה של תמונות רב-גוניות, wHich דורשים נהלים יישור נרחב באמצעות סמנים fiducial רב צבעוני ^{8 , 13} . כדי להתגבר על המגבלות הללו, מחקרים קודמים צילמו מספר מטרות באמצעות photobleaching חוזרות או מרווה כימית של fluorophores ¹⁴ ברצף ^{, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} . בעוד שיטות אלה יכולים להתגבר על גבולות ספקטרליים של מיקרוסקופיה, הלבנת הקרינה ידוע להיות תהליך רעיל ²⁰ , הלבנה ממושכת או מרווה עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות כגון אובדן crosslinking. יתר על כן, הצטברות של בדיקות ניאון יכול להוביל חסימה סטרית של אתרי מחייב במדגם, מניעת ריבוב בקנה מידה גדול ומיקוד חזקים של epitopes. כדי למנוע הפרעות סטריליות כאלה, s האחרונותTudy מושגת ריבוב באמצעות חילופי סטוכסטיים של שברי חלבונים מתפזרים באופן חופשי ²¹ . בעוד שיטה זו מאפשרת תיוג צפוף של מבנים הסלולר, זה דורש הכנה ביוכימי נרחב לבודד שברים פפטיד, לא ניתן לאתר עמדות מולקולה אחת, ולא בקלות להקל על ריבוב בקנה מידה גדול באמצעות בדיקות זמינות מסחרית. אנו מציגים פרוטוקול וידאו מפורט המתאר את מחייב רציף elution של נוגדנים fluorescently עבור multiplexed, נוגדן גודל מוגבל dSTORM (מדסטורם) הדמיה, ושימוש של ננו פלורסנט יהלומים כדי להשיג תיקון סחיפה מדויקת ויישור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

זהירות: יש לעיין בכל הגיליונות הרלוונטיים של נתוני בטיחות (MSDS) לפני השימוש. כמה מן הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה רעילים מסרטנים. אנא השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים בעת ביצוע הפרוטוקול, כולל שימוש בבקרת ההנדסה (מכסה המנוע, מכסה הכפפות) וציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעליים סגורות).

1. Multiplexed הדמיה של תאים T הופעל

1. ישירות נוגדנים מצמידים עם Alexa-647 (A647) צבע באמצעות אלקסה 647 ערכת תיוג נוגדנים. עקוב אחר פרוטוקול תיוג המסופק על ידי היצרן.
   הערה: דיאליזה של תמיסת נוגדנים 1x PBS מומלץ לפני שלב זה כדי להגביר את יעילות תיוג נוגדנים.
2. ספין שכותרתו נוגדנים 5 דקות ב 20,800 rcf ו לאסוף supernatant כדי להסיר נוגדנים צבירה.
3. הכנה של coverslips פלואורסצנטי ננו-יהלום מצופה
   1. מעיל 8-היטב coverslip תאי (ראה מגיב / רשימת חומר) עם 250 μL 0.01% פולי-ליזין (PLL) במשך 15 דקות, לשאוב, ויבש על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. (לא לשטוף לפני ייבוש.)
   2. הכנת דילול של 100 ננומטר FNDs ב 1x PBS. בדוק דילולים שונים כדי להבטיח מספיק FNDs גלויים כל שדה של נוף בשלב 1.2.7 (אנו משתמשים דילול 1: 200 של FNDs המסופק על ידי היצרן).
   3. וורטקס FNDs מדולל במשך 1 דקות.
   4. סוניקטור fnd supernatant עבור 30 s לעבר הגדרת כוח גבוהה.
   5. דגירה supernatant FND sonicatant בתא PLL מצופה 8-well coverslip במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. לשטוף 5x עם 1x PBS לדמיין את החדר מצופה FND באמצעות עירור 647 ננומטר לייזר על מיקרוסקופ TIRF. באופן אידיאלי, 4-10 FNDs הפרט צריך להיות גלוי בתחום הראייה בהתחשב דילול המתאים של FNDs בשלב 1.2.2 (אנו משתמשים במטרה 100X עם 256 x 256 הגדרת פיקסל המצלמה להניב 61 x 61 מיקרומטר שדה תצוגה) עםלפחות אחד FND נוכח בכל רבע של שדה הדמיה. אם FNDs נראה מקובצים ( כלומר, FNDs עם אות גבוה משמעותית מאשר FNDs שמסביב ו פונקציה להפיץ נקודה גדול מ 200 ננומטר), צנטריפוגות FNDs ב 6,800 rcf במשך דקה 1, וחזור על הליך ציפוי באמצעות supernatant FND.
   7. הוסף 250 μl של נוגדנים נוגדי CD3 (10 מיקרוגרם / מ"ל) היטב כל דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   8. הסר פתרון ולהוסיף 1x PBS למשך 30 שניות. חזור על צעד זה לשטוף 5 פעמים (לשטוף 5x).
4. הפעלת תאי T יורקת
   1. ספין 1 מ"ל של תאים Jurkat T ב 800 rcf במשך 6 דקות resuspend ב 300 μl פתרון 1x HBS. תאים Jurkat T צריך אידיאלי להיות בריכוז של 0.5-1.0 x 10 ⁶ תאים / מ"ל ​​לפני ספינינג. 1x HBS פתרון מורכב HEPES חיץ מלוחים עם אלבומין 1% בסרום בסרום כפי שתואר לעיל ²² .
   2. הוסף 150 μLשל פתרון 1x HBS היטב כל דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
   3. הוסף 50 μL resuspended תאים Jurkat לכל טוב דגירה במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   4. הוסף 300 μL של Paraformaldehyde 4% היטב כל דגירה למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   5. לשטוף 3x עם 1x PBS.
   6. תאים Permeabilize ידי הוספת 250 μL של 0.1% Triton-X פתרון במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. לשטוף 3x עם 1x PBS.
   8. הוסף 250 μL 1% פתרון ג'לטין דגים 1x PBS לכל טוב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   9. לשטוף 3x עם 1x PBS.
5. הדמיה מופעלת Jurkat T תאים באמצעות madSTORM
   1. הוסף 200 μL של נוגדנים שכותרתו ב 0.1-0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לתאים קבועים במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
   2. לשטוף 5x עם 1x PBS.
   3. הוסף 1 מ"ל של חיץ STORM לכסות את החדר עם coverslip זכוכית להגביל את החשיפה לאוויר. המאגר STORM תוארה בעבר ¹⁰ . אנו ממליצים על MAהמלך חדש STORM חיץ עבור כל סיבוב של הדמיה ספינינג למאגר STORM ב 20,800 rcf במשך 2 דקות כדי להסיר משקעים.
   4. באמצעות נמוך 647 ננומטר כוח לייזר במצב TIRF, לאתר תא מוכתם עם לפחות 3 FNDs בתחום התצוגה. כדי לסייע באיתור FNDs, עירור יחד עם 568 ננומטר לייזר ניתן להשתמש כדי להגדיל את בהירות האות FND.
      הערה: הביצועים של תיקון fiducial ממוצעת המתואר בסעיף 2.1 משפר עם הכללה של יותר FNDs.
   5. הגדל 647 ננומטר כוח לייזר לרכוש תמונות. אנחנו בדרך כלל לרכוש 10,000 מסגרות בחשיפה 200 ms, 125 mW 647 ננומטר לייזר, 100X TIRF אובייקטיבי העדשה (1.49 NA), 100X EM רווח (5 MHz ב 16 ביט, המרה המרה 1). פרטים על הגדרת ההדמיה שלנו תוארו בעבר ¹⁰ .
   6. לשטוף 5x עם 1x TBS.
   7. מוסיפים 1 מ"ל oF חיץ elution (3.5 M MgCl ₂ , 20 מ"מ צינורות, 0.1% Tween-20, pH 6.5) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות.
   8. חזור על elution 3 פעמים. (תנאי elution המדויק ומספר שטיפות elution הדרושים כדי להסיר את האות יש לבדוק עבור כל נוגדנים בשימוש).
   9. לשטוף 3x עם 1x TBS ולהוסיף 1 מ"ל של 1x PBS.
   10. Photobleach באמצעות 647 ננומטר לייזר בעוצמה גבוהה (125 mW) עם לייזר 405 ננומטר ב 2-5 mW לתצלום-להפעיל צבעים A647 במצב כהה. המתן עד שכל האות הנותר של נוגדנים שאינם eluted הוא photobleached. בדרך כלל זה לוקח 2-5 של חשיפה לייזר. רכישת תמונות לדוגמה (~ 100 מסגרות) באמצעות הגדרות STORM ב 1.3.5 לאחר elution ו photobleaching מומלץ לאשר הסרת אות.
       אנחנו בדרך כלל להסיר 99.8% של האות באמצעות שיטה זו. אנו ממליצים לבדוק את יעילות elution של כל נוגדן לפני השימוש ב MadSTORM כפי שמוצג בעבר ¹⁰ .
   11. הוסף 250 Paraformaldehyde μL 4% במשך 15 דקות. זה יחסי ציבוראירועים crosslinking הפוכה של מולקולות קבועים בתא.
   12. לשטוף 3x עם 1x PBS.
   13. חזור על שלבים 1.3.1-1.3.12 לתיוג רציף של מספר מטרות. איור 1 מציג תמונה מרוכבת של מולקולות מרובות בתא Jurkat T מופעלת רכשה באמצעות madSTORM.

2. להיסחף תיקון ויישור של ערימות תמונה מרובות

1. תיקון להיסחף של ערימות התמונה madstorm
   1. פתח תמונות באמצעות ImageJ. אנו ממליצים להמיר את קובצי התמונות לתבנית TIFF לפני פתיחת ImageJ. השתמש ROI מלבן כדי לבחור FND אחד. לשחק את הזמן לשגות כדי לוודא כי FND גלוי בכל מסגרת של מחסנית התמונה. השתמש בניתוח הפעלה בפלאגין ThunderSTORM כדי למקם את ה- FND. עבור שיטת תיקון fiducial ממוצעת המתוארת 2.1.5, חשוב כי FND יחיד הוא מקומי בכל מסגרת תמונה ( כלומר מספר פסגות מזוהה צריך להיות דוארQual למספר המסגרות).
   2. אם FND אינו מזוהה בכל מסגרת, בחר FND אחר. אם מספר פסגות ממוקמות במסגרת אחת, להסיר את הפסגה החורגת ביותר מן הפסגות הקודמות.
   3. חזור על 2.1.2 עבור כל FND בערימת התמונות. יש לזכור כי חלק FNDs לא צריך להיכלל בתהליך תיקון סחיפה, כך שהם יכולים לשמש מד עצמאי עבור דיוק תיקון נסחף כמתואר בשלב 2.1.7.
   4. עבור תיקון סחיפה מהיר יותר, מדויק יותר, השתמש במתאם הצלב או באלגוריתמים לתיקון fiducial הכלולים ב- ThunderSTORM כדי לתקן את תמונות FND. בדרך כלל, אנו משתמשים 100 bins, 5 הגדלה, ו 0.1 מסלול החלקה גורם עבור המתאם הצלב ו 10 מרחק מקסימלי, 0.1 דקות יחס הראות סמן, ו 0.01 מסלול החלקה גורם תיקון fiducial. המתאם הצולב תיקון fiducial תניב קובץ תיקון אשר ניתן להחיל על FNDs אחרים כדי לבדוק את תיקון תיקון נסחף.
   5. לקבלת תיקון קפדני יותר, מדויק יותר להסחף, להשתמש באלגוריתם תיקון fiducial ממוצעת (AFC) כפי שתואר לעיל ¹⁰ . תהליך זה אינו דורש אופטימיזציה של הפרמטרים והתשואות דיוק לוקליזציה גבוהה יותר מאשר חזה על ידי אלגוריתמים לוקליזציה SMLM. עם זאת, תיקון סחיפה ממוצעת דורש לפחות 4 FNDs ו עבור FNDs להיות מקומי בכל מסגרת של מחסנית התמונה. תיקון סחיפה AFC מבצעת טוב יותר עם הכללת FNDs יותר כי מספר גדול של FNDs מקומיים יפחית את האפקט המעוות של פסגה outlier במסגרת נתון.
   6. למקם את כל הפונקציות להפיץ נקודה בתוך מחסנית התמונה באמצעות ThunderSTORM כמתואר לעיל ¹⁰ . אנו משתמשים בדרך כלל בגודל פיקסל של 100 ננומטר, photelectrons לכל A / D ספירה של 4.28, רמת הבסיס A / D לספור של 100, רווח EM של 100, PSF: לוקליזציה גאוס משולב, רדיוס 5 פיקסל מתאים, שיטת הסתברות מקסימלית, 1.3 פיקסל סיגמא הראשונית.
   7. החל את גורם תיקון הסחיפה שנרכש מ FNDs ל לוקליזציות מכל ערימת התמונה כולה. ראייה לבדוק את התמונה הסופית כדי להבטיח תיקון הנסחף הנכון ( איור 2 ). גורם תיקון הסחיפה המתקבל צריך להיות נבדק באופן עצמאי על FNDs לא נכלל בהליך AFC כדי למדוד את רמת דיוק תיקון נסחף. הדיוק של FNDs העצמאיים המתוקנים, צריכים להיות קרובים לערך הדיוק / אי-הוודאות הממוצע המחושב מאלגוריתם לוקליזציה שניצלו בשלב 2.1.6.
   8. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.7 עבור ערימות התמונות של MEDSTORM של נוגדנים שכותרתו ברצף. זכור, כי לוקליזציה של אותה קבוצה של FNDs בכל מחסנית תמונות של madSTORM היא קריטית עבור הליך היישור הבא.
2. יישור תמונות מדסטורם
   1. חישוב עמדת centroid של נסחף לתקן FNDs בכל התמונה madSTORM. כדי לעשות זאת, למצוא את הממוצע x ו y ציר פועבור כל FND מקומי, ממוצע ממוצע x ו- y עמדות של כל FNDs בכל התמונה madSTORM. אלגוריתם מפורט עבור שלב זה תוארה בעבר ¹⁰ . יישר תמונות madStorM רציף באמצעות עמדות centroid של סמנים fnucial FND. כדי לבצע את היישור, לחשב את קיזוז בין שתי תמונות madSTORM מקומי על ידי חיסור עמדת centroid של FNDs בתמונה madSTORM השני מן הראשון. לאחר מכן לחסר את סכום היסט מכל לוקליזציות בתמונה madSTORM השני.
   2. אנו ממליצים להשתמש בתמונה הראשונה של madSTORM כתמונת עיון וחזרה על שלב היישור בין הראשון והשלישי, הראשון והרביעי, וכו '. בדוק את דיוק היישור על ידי מדידת הקיזוז בין FNDs שלא נכללו בתהליך היישור. קיזוזים גדולים עשויים להצביע על קבוצות שונות של FNDs שימשו בעת חישוב עמדות centroid של תמונות madStORM רציף.
   3. אם כן, צעדים 2.2.1-2.2.2 shouד לחזור באמצעות אותה קבוצה של FNDs לבצע יישור.
      הערה: קודים מותאמים אישית עבור שני תיקוני הסחיפה AFC ו הליכי יישור מסופקים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שיטת elution רציף שיטת מכתים שימש לייצר את התמונה multistlexed madStorM של microclusters ומבנים אחרים בתא T מופעל Jurkat ( איור 1 , לבדוק את היישור דמות). כל תמונה pseudo בצבע מייצג סיבוב אחד של הדמיה madSTORM רכשה צעדים 1.1.1-1.3.13. כפי שתואר לעיל ¹⁰ , שדה ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ההעתקה הסידורית, תיקון הסחיפה ויישורי היישור ב- madStORM מאפשרים הדמיה מדויקת ומרובת מאוד של מבנים הטרוגניים בתאים. ¹⁰ בנוסף, MadSTORM נמנע את המגבלות של צבע רב STORM כגון סטייה כרומטית ותת-אופטימלי photoswitching / תכונות פליטה של ​​צבעי אדום לא ^{9 ,}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8 well coverslip chamber	Lab-tek	155409
0.1% Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond	Adamas	Red FND
anti-CD3ε antibody	BD Biosciences	555329
Bovine serum albumin, Fraction V	KSE Scientific	98-100P
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
10% Paraformaldehyde	EMS	15712	Carcinogen
Gelatin from fresh water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041
Alexa 647 antibody labeling kit	Thermo Fisher	A20186
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	138924
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7154	Highly toxic, air sensitive
Cysteamine	Sigma-Aldrich	30070	Highly toxic
Cyclooctatetraene 98%	Sigma-Aldrich	138924	Highly toxic, air sensitive
10x PBS	KD Medical	RGF-3210
10x TBS	KD Medical	RGF-3385