JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כמו קולטן קולטן (TLR) איתות משחק תפקיד חשוב פתופיזיולוגיה של מחלות דלקתיות רבות של האדם, ואת הסדרת תגובות TLR על ידי חלקיקי ביו צפוי להיות מועיל בתנאים דלקתיים רבים. תאי ה- THP-1 מבוססי תאים מספקים פלטפורמה סינון רב-תכליתי וחזק לזיהוי מעכבים חדשים של איתות TLR.

Abstract

תקנה פרמקולוגית של קולטן תשובות קול (TLR) תגובות מבטיח הבטחה גדולה לטיפול במחלות דלקתיות רבות. עם זאת, היו תרכובות מוגבלות זמין עד כה כדי להחליש איתות TLR ולא היו מעכבי TLR אושרה קלינית (למעט תרופות נגד מלריה hydroxychloroquine) בשימוש קליני. לאור ההתקדמות המהירה בננוטכנולוגיה, מניפולציה של היענות חיסונית באמצעות ננו-מכשירים עשויה לספק אסטרטגיה חדשה לטיפול במחלות אלו. כאן, אנו מציגים שיטת תפוקה גבוהה התפוקה לזיהוי במהירות חלקיקים ביואקטיביים חדשים המעכבים איתות TLR בתאי החיסון phagocytic. זו פלטפורמת ההקרנה בנויה על THP-1 תאים תאים מבוססי תא עם מבחני colorimetric ו בלוציפראז. תאים הכתב מהונדסים האדם THP-1 קו התא monocytic ידי שילוב יציב של שני בונה כתב inducible. אחד מהם מבטא גנים מופרדים של פוספטז אלקליין (SEAP)תחת שליטה של ​​יזם inducible על ידי גורמי שעתוק NF-κB ו- AP-1, והשני מבטא גן לוציפראז מופרש הגן תחת שליטה של ​​יזמים המושרה על ידי גורמים אינטרפרון רגולטורית (IRF). לאחר גירוי TLR, תאים כתב גורמי שעתוק ולאחר מכן לייצר SEAP ו / או בלוציפראז, אשר ניתן לזהות באמצעות ריאגנטים המצע המתאימים שלהם. בעזרת ספריה של כלאיים של ננו-חלקיקים (GNP) של פפטיד-זהב, שהוקמו במחקרינו הקודמים כדוגמה, זיהינו פפטיד אחד-גנפ היברידי שיכול לעכב באופן יעיל את שתי הזרועות של TLR4 איתות אשד מופעלות על ידי ליגנד, lipandyscharide (LPS) שלה. הממצאים אושרו על ידי טכניקות ביוכימיות סטנדרטיות כולל immunoblotting. ניתוח נוסף קבע כי זה היברידית להוביל היה ספקטרום מעכב רחב, הפועל על מסלולי TLR מרובים, כולל TLR2, 3, 4, ו 5. גישה זו ניסיוני מאפשר הערכה מהירה של whetheRa nanoparticle (או תרכובות טיפוליות אחרות) יכול לווסת ספציפי איתות TLR בתאי החיסון phagocytic.

Introduction

קולטנים דמויי חיוג (TLR) הם אחד המרכיבים העיקריים במערכת החיסון המולדת התורמת לקו ההגנה הראשון מפני זיהומים. TLRs אחראים לחישה של פתוגנים פולשים על ידי זיהוי רפרטואר של דפוסי מולקולרית הקשורים פתוגן (או PAMPs) והגברת התגובות הביטחון באמצעות מפל של התמרה האות 1 , 2 . ישנם 10 TLRs האדם מזוהים; למעט TLR10 שעבורם הליגנד (ים) עדיין לא ברור, כל TLR יכול לזהות קבוצה ייחודית, משומרת של PAMPs. לדוגמה, TLR2 ו- TLR4, הממוקמים בעיקר על פני התא, יכולים לזהות ליפופרוטאינים וגליקוליפידים מחיידקים חיוביים של גראם וחיידק גראם, בהתאמה; בעוד TLR3, TLR7 / 8 ו TLR9, בעיקר נוכח תאים endosomal, יכול לחוש RNA ו- DNA מוצרים מווירוסים וחיידקים 3 . כאשר מגורה על ידי PAMPs, TLRs להפעיל חיסון תגובות חיוניות על ידי שחרור pro-infמתווכי lammatory, גיוס והפעלת מפעיל תאים חיסוניים, ותיאום אירועים חיסוניים אדפטיבית עוקבים 4.

את האותות TLR איתות יכול להיות פשוט מסווג לשני מסלולים עיקריים 5 , 6 . האחת תלויה בחלוקה למינון חלבון מיאלואיסטי 88 (MyD88) - מסלול תלוי ב- MyD88. כל TLRs למעט TLR3 לנצל את המסלול הזה כדי להפעיל גורם גרעיני kappa-light-chain משפר של תאים B פעיל (NF-κB) ו מיטוגן הקשורים חלבון קינאזות (MAPKs), המוביל הביטוי של מתווכים פרו דלקתיים כגון TNF- Α, IL-6 ו- IL-8. המסלול השני משתמש ב- TIF-domain המכיל מתאם-אינטרפרון אינטרפרון-β (TRIF) - מסלול תלוי-תלות ב- TRIF או MyD88 - כדי להפעיל גורמים רגולטוריים של IFF (IRF) ו- NF-κB, וכתוצאה מכך ייצור הקלד I IFNs. איתות TLR שלםהוא קריטי להגנה היומי שלנו מפני זיהומים מיקרוביאליים ויראליים; ליקויים במסלולי איתות TLR יכולים להוביל לחוסר חיסונים ולעתים קרובות מזיקים לבריאות האדם. 7

עם זאת, איתות TLR הוא "חרב פיפיות" והפעלת מופרזת, בלתי מבוקרת של TLR מזיקה. תגובת יתר TLR תגובות לתרום הפתוגנזה במחלות רבות דלקתיות אנושיות כרוניות כרוניות 8 , 9 . לדוגמא, אלח דם המאופיין בדלקת מערכתית ובפציעה מרובה איברים, נובעת בעיקר מתגובות חיסוניות חריפות כלפי זיהומים, כאשר TLR2 ו- TLR4 ממלאים תפקיד מכריע בפתופיזיולוגיה של 10 , 11 , 12 . בנוסף, TLR5 נמצא לתרום דלקת ריאות כרונית של חולים עם סיסטיק פיברוזיס 13, 14 יתר על כן, dysregulated endosomal TLR איתות (למשל, TLR7 ו TLR9) קשורה קשר הדוק עם התפתחות והתקדמות של מחלות אוטואימוניות מספר כולל זאבת מערכתית erythematosus (SLE) ו דלקת מפרקים שגרונית (RA) 15 , 16 . קווים אלה מתכנסים של עדויות לזהות איתות TLR כיעד פוטנציאלי פוטנציאלי עבור מחלות דלקתיות רבות 17 .

למרות התרופות הפרמקולוגיות של תגובות TLR צפוי להיות מועיל בתנאים דלקתיים רבים, למרבה הצער, יש כיום מעט מאוד compounds זמין קלינית כדי לעכב TLR איתות 9 , 17 , 18 . זה בחלקו בשל המורכבות ואת יתירות של מסלולי TLR מעורב בהומיאוסטזיס החיסונית המחלה פתולוגיה. לכן, מחפש רומן, potenT סוכני טיפול למקד מסלולי איתות מרובים TLR יכול לגשר על הפער הבסיסי, ולהתגבר על האתגר של קידום מעכבי TLR לתוך המרפאה.

לאור ההתקדמות המהירה nanoscience ו ננוטכנולוגיה, nanodevices מתעוררים כמו מודולים TLR הדור הבא בשל תכונות ייחודיות שלהם 19 , 20 , 23 . גודל ננו מאפשר אלה nano-therapeutics יש ביו הפצה טוב יותר במחזור מתמשך 24 , 25 , 26 . הם יכולים להיות פונקציונליים נוספת לפגוש את הרצוי פרמקודינמי פרופילים פרמקוקינטי 27 , 28 , 29 . יותר מרגש, הפעילות ביו של אלה nanodevices הרומן נובעת התכונות הפנימיות שלהם, אשר יכול להיות מותאם עבוריישומים רפואיים ספציפיים, ולא רק מתנהג כמו רכב מסירה עבור סוכן טיפולי. לדוגמה, צפיפות גבוהה ליפופרוטאין (HDL) כמו nanoparticle נועד לעכב איתות TLR4 על ידי scavenging ליגנד TLR4 LPS 23 . בנוסף, פיתחנו פפטידי זהב nanoparticle מערכת היברידית, שבו פפטידים מעוטרים יכולים לשנות את תכונות פני השטח של חלקיקי זהב, ולאפשר להם יש שונים ביו פעילויות 30 , 31 , 32 , 33 . זה עושה להם סוג מיוחד של סמים (או "ננו סמים") כמו הדור הבא ננו-תרפויטים.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה לזהות סוג חדש של פפטיד זהב זהב nanoparticle (פפטיד, GNP) היברידים שיכולים לעכב מספר רב של מסלולי איתות TLR ב phagocytic תאים החיסון 32 , '33 . הגישה מבוססת על זמינות מסחרית THP-1 שורות תאים כתב. תאי הכתב מורכבים משני מבנים יציבים, בלתי ניתנים להזרקה: אחד נושא גנים מופרדים של אלקליין פוספטאז (SEAP) עוברי (SEAP) תחת שליטה של ​​יזם המושרה על ידי גורמי שעתוק NF-κB ו activator חלבון 1 (AP-1); השני מכיל גן לוציפראז מופרש הגן תחת שליטה של ​​היזמים המושרה על ידי גורמים אינטרפרון הרגולציה (IRFs). על גירוי TLR, התמרה האות מוביל ההפעלה של NF-κB / AP-1 ו / או IRFs, אשר הופכת את גנים כתב לסוד SEAP ו / או בלוציפראז; אירועים כאלה ניתן לזהות בקלות באמצעות ריאגנטים המצע המתאים שלהם עם ספקטרופוטומטר או luminometer. באמצעות גישה זו המסך המסך שהוקם בעבר שלנו של כלאיים פפטיד- GNP, זיהינו מועמדים להוביל שיכולים לעכב נתיבים איתות TLR4. הפעילות המעכבת של הפפטיד המוביל -Hyperids GNP אושר לאחר מכן באמצעות גישה ביוכימית אחרת של immunoblotting, והעריכו על מסלולי TLR אחרים. גישה זו מאפשרת סינון מהיר ויעיל של סוכנים חדשים הממקדים מסלולי איתות TLR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת תרבות תאים מדיה ריאגנטים

  1. הכינו את התרבות כולה תא בינוני R10 על ידי הוספת תוספי 10% בסרום שור עוברית (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין ו 1 מ"מ נתרן pyruvate לתוך המדיום RPMI-1640.
    1. הכן את המדיום הבחירה בינוני R10-Z על ידי הוספת אנטיביוטיקה Zeocin (200 מיקרוגרם / מ"ל) כדי R10 לשמירה על הביטוי של SEAP תחת שליטה של ​​NF-κB / AP-1 ההפעלה. כדי לבחור תאים המבטאים הן SEAP ו גנים לוציפראז כתב, להוסיף גם זאוצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו blasticidin (10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי R10 (כמו R10-ZB).
  2. הכן את פתרון המצע SEAP ידי המסת שקיק אחד של אבקת המצע (ה .g., Quanti-כחול) לתוך 100 מ"ל ultrapure, מים חינם רעלן פנימי בבקבוק 125 מ"ל זכוכית נקייה.
    1. מערבולת הפתרון בעדינות דגירה אותו על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות כדי להבטיח את הפירוק המלא של מצעים.
    2. לסנן את הפתרון באמצעות קרום 0.2 מיקרומטר כדי להבטיח את העוקץ שלה (אופציונלי), ולאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות לפני השימוש.
  3. הכן את הפתרון המצע בלוציפראז על ידי המסת שקיק אחד של אבקת המצע ( למשל , קוואנטי לוק) לתוך 25 מ"ל ultrapure, מים חינם endotoxin בצינור צנטריפוגה סטרילית 50 מ"ל.
    1. לאחר המסת אבקה לחלוטין, להשתמש מיד פתרון. לחלופין, לאחסן את הפתרון ב 4 ° C (עד שבוע) או ב -20 ° C (עד חודש) לפני השימוש.
      זהירות: שני פתרונות המצע הם רגישים לאור, ויש להימנע מחשיפה לאור בכל עת. מספר מחזורי הקפאת ההפשרה של הפתרון עלול לגרום לחוסר יציבות של המצע ולקצר את חיי המדף שלו.
  4. הכן את פתרון המניות של phorbol 12-myristate 13 אצטט (PMA) ב dimethyl sulfoxide כיתה מולקולארית (DMSO) יש ריכוז של 500 מיקרוגרם / מ"ל. הפוך aliquots של פתרון המניות (10 μL בצינור 500 μL) ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
  5. הכן LPS (E-coli K12) פתרון מלאי במים סטריליים, אנדוטוקסין חינם בריכוז של 5 מ"ג / מ"ל, ולעשות aliquots לאחסון לטווח ארוך ב -20 מעלות צלזיוס. הכן פתרון LPS עובד על ידי דילול LPS המניות לתוך פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​חנות ב -20 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    זהירות: הכנה מגיב לשימוש תרבותי צריך להתבצע בארון biosafety, וכל המכלים צריך להיות מעוקרים לפני השימוש. הקפאה חוזרת ונשנית של מחזורי הפשרה של PMA ופתרונות LPS יש להימנע.

2. תרבות של THP-1 כתב תא מקרופאגים הנגזרים

  1. השתמש בשני שורות תאים THP-1 כתב: THP-1-XBlue ו THP-1-Dual תאים. לשעבר יש גן הכתב SEAP נשלט על ידי NF-κB / AP-1, והאחרת יש מערכת גן כפול כתב, אותו הגן הכתב SEAP ו IRF נשלט בלוציפראז הגן. הIR נהלים תרבותיים זהים למעט התקשורת תרבות הבחירה.
    1. ההפשרה מלאי תא עובד (~ 5 x 10 6 תאים) ב 10 מ"ל של המדיום R10, לסובב את התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. תאים Resuspend ב 10 מ"ל של המדיום R10, ולהעביר אותם לתוך בקבוק T75 תרבות. שערי המדיום תרבות כל 2-3 ימים עד תאים להגיע צפיפות של 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
    2. כאשר צמיחת תאים מגיע יכולתו, תאים המעבר כדי להפחית את צפיפות התאים בטווח של 2-5 x 10 5 תאים / מ"ל, כך התאים יכולים להמשיך לגדול.
    3. לאחר לפחות מעבר אחד, להתחיל תרבות התאים במדיום הבחירה בינוני: R10-Z עבור THP-1-XBlue, ו R10-ZB עבור THP-1-Dual. לאחר culturing התאים עם בינוני תרבות הבחירה עבור מעבר אחד לפחות, תאים מוכנים הניסוי.
      זהירות: גידול יתר של תאים עלול לגרום למוות משמעותי של תאים; את הכדאיות התא צריך לשמור> 98%. שמור תיעוד של מספר המעבר כמו celאני יכול להתנהג אחרת אחרי קטעים רבים (20 מעברים).
      הערה: צלוחיות תרבות תאים ניתן לעשות בה שימוש חוזר מספר פעמים כדי לחסוך בעלויות; עם זאת, בפועל זה עשוי להגביר את הסיכון של זיהום כללי זיהום צולבות בין צלוחיות שונות (אם טיפול שורות תאים שונים בו זמנית). במהלך חילופי התקשורת המעבר התא, צנטריפוגה מוגדר 300 xg במשך 5 דקות.
  2. כדי לבצע assay תא הכתב, תאים זרע לתוך 96-היטב שטוחה בתחתית תרבות התא התא ולהבדיל אותם מקרופאגים. הנהלים מתוארים להלן.
    1. מעבירים את התאים מן הבקבוק כדי צינור צנטריפוגות, לסובב את התאים ב XG 300 במשך 5 דקות, resuspend אותם במדיום R10 בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מ"ל. הוסף aliquots של פתרון PMA לתוך המתלים התא עם ריכוז סופי של 50 ng / מ"ל.
    2. העברת 100 μL של המתלים התא לתוך כל טוב של 96-WeLl באמצעות פיפטה מרובת ערוצים. לדגור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס (בתא תרבות חממה) במשך 24 שעות.
    3. לאחר הדגירה, להסיר בזהירות את המדיום תרבות באמצעות aspirator ואקום (או עם פיפטה רב ערוצי), ולשטוף בעדינות את התאים עם PBS (100 μL / טוב) פעמיים; להוסיף 100 μL של מדיום R10 טריים היטב כל אחד. הנח את התאים במשך 2 ימים בחממה לפני ביצוע assay הכתב.
      זהירות: הצעד מנוחה חשוב מאוד לאפשר לתאים להירגע לאחר גירוי PMA למצב השקט הרגיל שלהם. זה יכול להפחית באופן משמעותי את אותות הרקע של גנים הכתב בתנאים unstimulated.
      הערה: לאחר 24 גירוי עם PMA, התאים נבדלים פנוטיפ דמויי מקרופאג, עם מאפיין של הידבקות התא בתחתית הבאר, וכן תכונה מורפולוגית של pseudopodia.

3. הקרנה עבור פוטנציאליים TLR4 Nano מעכבי באמצעות תאים כתב

הערה: מאז איתות TLR4 מנצל שני מסלולים תלויי MyD88 ו- TRIF, הוא נבחר כיעד העיקרי להקיף מגוון רחב של מסלולי איתות TLR. THP-1-XBlue תאים כתב משמשים בעיקר לבחון את ההפעלה NF-κB / AP-1 בעוד THP-1-Dual תאים הם עבור הפעלת IRF מן התמרת האות תלוי TRIF.

  1. זיהוי מינון LPS אופטימלי על ידי יצירת עקומת מינון התגובה לפני ההקרנה.
    1. לדלל את פתרון LPS עובד לריכוז סופי של 0.01 - 100 ng / mL במדיום R10 (לעשות דילול בסולם log10). פריסת צלחת עיצוב ולעשות דילול של 96-היטב עגול תרבות בתחתית. ודא כי כל טוב יש מינימום של 110 μL של פתרון לאחר דילול.
    2. הסר בעדינות את המדיום תרבות מהצלחת seeded (מ 2.2.3) באמצעות אספירטור ואקום.
    3. העברת LPS המכיל בינוני R10 מוכן בצלחת דילול (3.1.1) iאל צלחת התרבות על פי הפריסה של הדגימות. לדגור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס (בתא תרבות חממה) במשך 24 שעות.
    4. בשעה 24 שעות, בזהירות להעביר את supernatants (80 μL / טוב) לתוך צלחת 96-היטב חדש בתחתית. בצע את assay colorimetric ו / או בלוציפראז הארה על פתרונות אלה באופן מיידי או לאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס (כמה שעות) או -20 מעלות צלזיוס (ימים) לפני הפיתוח assay.
      הערה: העיצוב של פריסת צלחת צריך להיות פשוט וברור לניסוי וניתוח נתונים. עבור כל תנאי, 2-4 משכפל צריך להיחשב. כלול תמיד קבוצת בקרה שלילית (LPS null). מומלץ להשתמש בתאי THP-1-XBlue להפעלת NF-κB / AP-1, שכן התאים הכפולים בעלי רקע גבוה יחסית של הפעלת NF-κB / AP-1 לאחר הפיכתם למקרופאגים. עם זאת, זה אפשרי להשתמש בתאים כפולה לדיווח הן NF-κB / AP-1 ו IRF ההפעלה.
  2. לפתח את הצבעAssay imetric עבור NF-κB / AP-1 ההפעלה ואת assay הארה בלוציפראז עבור הפעלת IRF.
    1. כדי להעריך את ההפעלה NF-κB / AP-1, העברת 20 μL של supernatant של כל דגימה לתוך צלחת חדשה 96-היטב בתחתית שטוחה; ולהוסיף 180 μL של מראש חימם SEAP פתרון המצע לתוך כל טוב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 - 2 שעות כדי לאפשר את פיתוח צבע (ורוד כחול כהה). לאסוף את הקליטה ב 655 ננומטר על קורא צלחת.
      זהירות: זמן הדגירה יכול להיות מגוונות על בסיס התפתחות צבע (30 דקות עד הדגירה לילה). מומלץ לחכות עד צפיפות אופטית (OD) של הצבע הכהה מגיע מעל 1, תוך הימנעות הרוויה של התפתחות צבע (OD> 3).
    2. לניתוח של הפעלת IRF, להעביר 10 μL של supernatant של כל דגימה לתוך צלחת שטוחה שטוחה 96 שטוח גם לבן. מוסיפים את הפתרון בלוציפראז (50 μL) ומיד לאסוף את w הארה wזה בסדר.
      הערה: מומלץ מאוד להשתמש הקורא צלחת הארה עם פונקציה הזרקת אוטומטי כדי להבטיח את עקביות הקרינה האור מ היטב גם מהצלחת לצלחת. אם פתרונות המצע מוזרקים באופן ידני, אנא הקפידו על זמן דגירה עקבי וקביעת הגדרות עבור כל אחד מהם.
  3. ביצוע assay ההקרנה על כלאיים שונים ppide-GNP עם 10 ng / מ"ל ​​LPS גירוי (מבוסס על 3.1). בצע את ההליך אותו 3.2 עבור פיתוח assay כתב.
    1. לרכז את כלאיים פפטיד-GNP ל 200 ננומטר במדיום R10 באמצעות שיטת צנטריפוגה. צנטריפוגה 20 כרכים של הפתרון היברידי (10 ננומטר) ב XG 18,000 במשך 30 דקות, בזהירות להשליך supernatants. לאסוף את כלאיים (בחלק התחתון של הצינור) לתוך צינור, לשטוף אותם עם PBS פעמיים, ולהשעות מחדש את הכלאיים בנפח אחד של המדיום R10.
    2. מערבבים כרכים שווים של היברידים מרוכזיםLPS (20 ng / mL) המכיל R10 בינוני יש ריכוז סופי של היברידים LPS להיות 100 ננומטר 10 ng / מ"ל, בהתאמה.
    3. הסר את המדיום תרבות מהצלחת תרבותי (2.2.3) ולהוסיף 100 μL של הפתרון המעורב לתוך כל טוב (3 משכפל עבור כל תנאי); לכלול שליטה שלילית (בינוני בלבד) ו LPS שליטה (10 ng / mL LPS ללא כלאיים).
    4. לאחר הדגירה 24 שעה על 37 מעלות צלזיוס, להעביר את המדיום של כל טוב לתוך צינור צנטריפוגה צינורות ב XG 18,000, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. איסוף supernatants (50-80 μL / צינור) לתוך צלחת 96-גם בתחתית, ולבצע assay הכתב כמתואר 3.2.
      זהירות: בעת השלכת supernatants לאחר צנטריפוגה, לא לסחוט את ההיברידיות בתחתית הצינור.
      הערה: צנטריפוגה בשלב 3.3.4 חשוב מאוד להסיר את כלאיים nanoparticle מופנם מן המדיום התרבות, והוא יכול למנוע את ההפרעה של כלאיים עם שיתוףלורימטרי / הקרינה הארה. הסיבה לכך היא חלקיקים זהב יכול לספוג אורכי גל רחב של אור בהתאם לגודל שלהם ו agglomeration.

4. אימות ההשפעה המעכבת של המועמדים הפוטנציאליים

הערה: כדי לאשר את ההשפעה המעכבת של המועמדים הפוטנציאליים מהמיון, מועסקים שתי גישות. אחת מהן היא לבחון את תגובות המינון של הממריצים (LPS) בריכוז היברידי קבוע (או להיפך); השני הוא ישירות להסתכל על עיכוב על NF-κB / AP-1 ו IRF3 אותות באמצעות immunoblotting.

  1. בגישה 1, לבצע assay הכתב עם 100 ננומטר של היברידיות עופרת ושני ריכוזי LPS ב 1 ng / mL ו 10 ng / mL הבאים אותם הליכים המתוארים 3.3. כלול היברידית לא פעילה (בהתבסס על תוצאות ההקרנה) כביקורת היברידית לשם השוואה.
  2. עבור הגישה immunoblotting, אנא פעל לפי תקן eנהלים קלים.
    1. תרבות THP-1 תאים במדיום R10, זרע התאים לתוך צלחת 12 גם תרבות (2 x 10 6 תאים / טוב), ולהבדיל אותם מקרופאגים על ידי טיפול בתאים עם 50 ng / mL PMA עבור 24 שעות ואחריו מנוחה עבור 2 ימים.
    2. לאחר התמיינות תאים, לעורר תאים עם 10 ng / mL LPS עם / ללא היברידיות (100 ננומטר) לאורך זמן (עד 4 שעות). בנקודות זמן שונות (0, 5, 15, 30, 60, 120 ו 240 דקות), להכין את lysates התא עבור immunoblotting. כלול היברידי לא פעיל כביקורת.
    3. בדוק את האותות של IκBα, posphorylated p65, ו phosphorylated IRF3 לבחון את ההשפעה המעכבת של היברידיות עופרת על ההפעלה של NF-κB ו IRF3. בדוק את β- אקטין ו IRF3 סך האותות כמו בקרות פנימיות.
      הערה: התמרה האות לעתים קרובות מתרחשת מהר יותר (בעוד כמה שעות) ואז את הביטוי של האנזים עיתונאי SEAP ו בלוציפראז (24 שעות). מומלץ מאוד גם perforAssay הכדאיות של היברידים נבדק ב 24 שעות כמו שיטת אימות נוספת.

5. הערכת ייחוד ה- TLR

הערה: כדי לחקור את סגוליות ה- TLR של הפפטיד-GNP ההיברידי, נבדקים מסלולי איתות TLR אחרים, כולל TLR2, TLR3 ו- TLR5. TLR7, 8 ו 9 אינם נכללים כי מקרופאגים הנגזרים THP-1 לא מגיבים היטב לגירוי של אלה TLRs בשל היעדר TLR7, 8 ו 9 ביטוי מקרופאגים 34 .

  1. מבחן ריכוזים שונים (1 ng / mL ל 25 מיקרוגרם / מ"ל) של ligands ספציפיים TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (פולי אני: C) ו TLR5 (flagellin) על שני תאים כתב הנגזרים מקרופאגים להשיג את הריכוז האופטימלי הבא הליך 3.1 ו -3.2.
  2. טפל בתאים עם תערובות של היברידית עופרת (100 ננומטר) וכל ליגנד TLR בריכוז המתקבל 5.1 כדי להעריך את הספציפיות המעכבת של h להובילYbrid על פי הנוהל הניסוי המתואר 3.3. כלול את היברידית לא פעילה כבקרה להשוואה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הגישה הניסויית הכוללת מתוארת באיור 1 . שני שורות תא הכתב THP-1, THP-1-XBlue ו- THP-1-Dual, משמשים לתצוגה מהירה של תגובות ה- TLR על-ידי בחינת ההפעלה של NF-κB / AP-1 ו- IRF, בהתאמה. ההפעלה של NF-κB / AP-1 יכול להיות מזוהה על ידי assay colorimetric SEAP, בעוד ההפעלה IRF הוא פיקוח ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאז TLRs מעורבים הפתוגנזה של מחלות דלקתיות רבות, הם צמחו כמטרות טיפוליות עבור אפנון של תגובות החיסון ותנאי דלקת. עם זאת, הפיתוח הקליני של טיפולים כדי לעכב מסלולי איתות TLR יש הצלחה מוגבלת עד כה. התרופה antimalarial hydroxychloroquine אשר מעכב TLR7 ו TLR9 הוא בשימוש קליני 35 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות בתמיכת התוכנית של פרופסור למינוי מיוחד (Scholar) במוסדות להשכלה גבוהה בשנחאי (HY), קרן החל מהבית החולים העממי הראשון בשנחאי (HY), גאופנג קליני רפואה גראנט מגנטאי ג'יאוטונג בית הספר לרפואה של האוניברסיטה (HY), ואת המימון של קרוהן ו קוליטיס קרן של קנדה (CCFC) (SET ו HY).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
THP-1-XBlue reporter cellInvivoGenthpx-spkeep cell culture passage under 20
THP-1-Dual repoter cellInvivoGenthpd-nfiskeep cell culture passage under 20
RPMI-1640 (no L-glutamine)GE Health CareSH30096.02Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10
Fetal bovine serum (qualified)Thermo Fisher Scientific12484028Heat inactivated; 10% in RPMI-1640
L-glutamineThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM in the complete medium R10
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360-0701 mM in the complete medium R10
Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesiumGE Health CareSH30028.02Use for cell washing and reagent preparation
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1SEAP substrate
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Luciferase substrate
ZeocinInvivoGenant-zn-1Selection antibiotics for reporter cells
BlasticidinInvivoGenanti-bl-1Selection antibiotics for reporter cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biologySigmal-AldrichD8418-100MLUse for reagent preparation
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biologySigmal-AldrichP1585-1MGUse for cell differentiation
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12InvivoGentlrl-eklpsTLR4 ligand
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsTLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-picTLR3 ligand
Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapureInvivoGentlrl-epstflaTLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 microplate readerMolecular DevicesN/ARead colorimetric assay
Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectorsTecanN/ARead luminiscience
Microfuge 22R centrifugeBeckman CoulterN/ATemperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)
Allegra X-15R centrifugeBeckman CoulterN/ATemperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)
Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treatedCorning Costar3903Used for luminiscence assay

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461(2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265(2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374(2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125nanodrugnanoparticleTLR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved