JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים immunoprecipitation ששונה כרומטין יליד רצף (צ'יפ-seq) מתודולוגיה לדור של רצף datasets מתאים נוקלאוזום צפיפות שבב-seq מסגרת אנליטית שילוב נגישות נוקלאז micrococcal (MNase) עם מדידות שינוי היסטון.

Abstract

אנו מציגים immunoprecipitation ששונה כרומטין מקורית של רצף (צ'יפ-seq) נסיוני תואם עם תערובת גאוסיאנית ההפצה מבוססת ניתוח מתודולוגיה (צפיפות נוקלאוזום שבב-seq; ndChIP-seq) המאפשר את הדור של מדידות משולב של נוקלאז micrococcal (MNase) נגישות עם שינוי היסטון הגנום כולו. נוקלאוזום עמדה צפיפות המקומי ואת השינוי posttranslational של subunits שלהם היסטון, לפעול בהופעה לווסת את הברית שעתוק מקומיים. מדידות קומבינטורית של נוקלאוזום נגישות עם שינוי היסטון שנוצר על ידי ndChIP-seq מאפשר החקירה בו זמנית של תכונות אלה. המתודולוגיה ndChIP-seq ישימה על מספר קטן של תאים ראשי נגיש cross-linking מבוסס שבב-seq פרוטוקולים. יחדיו, ndChIP-seq מאפשר מדידת שינוי היסטון בשילוב עם צפיפות נוקלאוזום מקומיים כדי להשיג תובנות משותפות מנגנונים המסדירים שעתוק RNA בתוך התא הראשי נדיר אוכלוסיות חדשות.

Introduction

הגנום האיקריוטים נארז לתוך כרומטין באמצעות חזרה על מבנים נוקלאוזום המורכבים של שני עותקים של חלבוני היסטון ארבע (למשל, H2A, ויזת עבודה H2B, H3 ו- H4) ומוקפת על ידי 146 זוגות הבסיס של ה-DNA1,2. כרומטין שיפוץ מכלולי שליטה נוקלאוזום מיקום בתוך גבולות יזם ג'ין, להשתתף ברגולציה של ביטוי גנים על ידי שינוי הנגישות של ה-DNA גורמי שעתוק, מכונות RNA פולימראז3, 4.

אמינו מסוף זנבות של שינויים היסטוניים בתוך נוקלאוזום. נתונים למגוון שינויים קוולנטיות, כולל acetylation, מתילציה, זרחון, ubiquitylation, sumoylation, formylation ו hydroxylation של חומצות אמינו ספציפיות5 , 6 , 7 , 8. תפקידים ודרגות לבצע שינויים אלה להכתיב מצב כרומטין המשפיעים על מבנה כרומטין וגישה שליטה של מתחמי מולקולרית לאפשר הפעלה של שעתוק7. בהתחשב בכך שינוי צפיפות, היסטון בשני נוקלאוזום לשחק תפקיד שליטה מקומית של שעתוק גנים, פיתחנו בגישה צ'יפ מקורי המאפשרת את המדידה בו זמנית של נוקלאוזום צפיפות ו- שינוי היסטון9, 10.

צ'יפ מקורי-seq מנצל נוקלאז micrococci endonuclease (MNase) לעכל כרומטין ללא פגע במצבו המקורי בתוך גרעין11,12, שאותו יש כבר ממונף למפות נוקלאוזום מיקום13 , 14 , 15. צפיפות נוקלאוזום שבב-seq (ndChIP-seq) מנצל המאפיין של גישה מועדף של MNase כדי לפתוח את מחוזות כרומטין ליצירת מדידות המשלבות MNase נגישות עם שינוי היסטון10. ndChIP-seq מתאים פרופיל בדבר שינוי היסטון נדיר ראשי תאים, רקמות, תאים בתרבית. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט המאפשר את הדור של רצף datasets מתאים עבודה מסגרת אנליטית שתואר לעיל10 המשלבת פרגמנט גודל פוסט immunoprecipitation, נקבע על ידי לזווג-end להקריא את גבולות, במקביל לחקור MNase נגישות עם מדידות שינוי היסטון. בעבר, יישום של פרוטוקול זה על דם טבורי אנושי ראשוני 10,000 נגזר CD34+ תאים של תאי גזע עובריים חשף ייחודי קשרי הגומלין בין שינויים במבנה ואת היסטון כרומטין בתוך אלה תא סוגי10 . בהתחשב ביכולת למדוד בו זמנית נוקלאוזום נגישות והסבת היסטון, ndChIP-seq הוא מסוגל לחשוף epigenomic תכונות בקרב אוכלוסיה תא ברמה נוקלאוזום יחיד, ופתרון חתימות הטרוגנית לתוך שלהם היסודות המרכיבים. דוגמה של חקר אוכלוסיות הטרוגניות הסלולר על-ידי ndChIP-seq הוא חקירה של היזמים טרינארית, איפה הן H3K4me3, סימן פעיל H3K27me3, סימן הדיכוי, הן נוכח10.

Protocol

הערה: הקלט המינימלי עבור פרוטוקול זה הוא 10,000 תאים לכל תגובה חיסונית יחיד-משקעים (IP). להדפיס את גליון העבודה ניסיוני שסופקו ולנצל כקו מנחה כדי לתכנן הניסוי. Incubations בטמפרטורת החדר ההשעה ב ~ 22 ° c כולכם מהמתכונים מאגר ניתנים טבלה 1. כל של מאגרי צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, שמרה על קרח במהלך ההליך, אלא אם צוין אחרת.

1. תא הכנה

  1. תאים בתרבית
    1. לשטוף את התאים עם 1 מ ל תמיסת מאגר פוספט (PBS) ולקבוע באופן מדויק את הריכוז התא באמצעות hemocytometer. אם יש יותר ממיליון תאים, להגביר את עוצמת PBS.
    2. בהתבסס על ספירת, aliquot המקבילה של 70,000-100,000 תאים לתוך צינור mL 1.5 סטרילי, ספין למטה ב g x 500 דקות 6-4 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה של, אט-אט להסיר למחוק את תגובת שיקוע (מבלי להפריע בגדר תא) ואת resuspend בגדר המאגר הקר פירוק + 1 x פרוטאז מעכב קוקטייל (PIC) ריכוז של 1,000 תאים / µL. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30 פעמים. . זה קריטי תא גושים הם שיבשו לא לנסות ליצור בועות.
    3. להמשיך ישירות ל- 1 יום (סעיף 2) של הפרוטוקול ndChIP-seq או פלאש להקפיא בגדר תא חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. תאים ממוינים
    1. איסוף תאים ממוינים16 70,000-100,000 לתוך צינור 1.5 מ עם 350 µL של האנק במאגר תמיסת מלח (HBSS), או PBS + 2% סרום שור עוברית (FBS).
    2. ספין לאורך כל תא aliquot ב g x 500 דקות 6-4 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה של, לאט להסיר את תגובת שיקוע (מבלי להפריע בגדר התא), resuspend המאגר הקר פירוק + 1 x PIC כדי ריכוז סופי של 1,000 תאים / µL. מערבבים היטב במאגר פירוק על-ידי pipetting למעלה ולמטה 20 - 30 פעמים. ודא כי כגיהנום תא הם שיבשו. לא לנסות ליצור בועות.
    3. להמשיך ישירות ל- 1 יום (סעיף 2) של הפרוטוקול ndChIP-seq, או פלאש להקפיא בגדר תא חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.

2. יום 1: ndChIP-seq

  1. הכנה של המתחם נוגדן-חרוז
    1. הכנת אמבט מים 37 ° C, דלי קרח. עבודה על קרח, להכין 1 x IP מאגר/1 x PIC 1 x נוגדנים (אלב) דילול מאגר, ולשמור אותם על קרח. לאחזר beads מגנטי חלבון A (או G) (ראה דיון על קריטריוני הבחירה) מתוך 4 ° C אחסון ולאחר לערבב היטב על-ידי הדופק עדין-vortexing. . לשמור את זה על קרח.
      הערה: דופק-vortexing פירושו vortexing מופסק בכל פעם נוצרת מערבולת מלא בצינור.
    2. העברת 24 µL של חלבון A (או G) beads מגנטי לפי התגובה IP לתוך צינור 2 מ"ל. להקליט בכמויות החרוזים ולשמור את הצינורית על קרח. לדוגמה, עבור 7 IPs, להשתמש µL 24 x 7 = 168 µL.
    3. מניחים את הצינורית על המגנט צינור ולחכות הפתרון להיות ברור ההפרדה חרוז אנלוגיים. מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות להסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה ולמחוק. להשתמש ברכבת התחתית את המגנט צינור ומניחים אותו על קרח.
    4. הוסף אמצעי שווה (קרי, הנפח הראשוני של חרוזים) המאגר הקר IP + 1 x לערבב PIC. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. לא מערבולת.
    5. למקם את ה-IP מאגר + 1 x PIC + חרוזים בחזרה על המגנט צינור ולחכות הפתרון להיות ברור ההפרדה חרוז אנלוגיים. מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות להסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה ולמחוק. חזור על מאגר IP קר + 1 X שטיפת PIC שניים יותר פעמים בסך הכל 3 מנקי.
    6. לאחר השטיפה הסופית resuspend את החרוזים אמצעי שווה (קרי, הנפח הראשוני של חרוזים) המאגר הקר IP + 1 x PIC לערבב. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. לא מערבולת. שמור את הצינורית על קרח.
    7. על קרח, למזוג 10 מ"ל של מאגר ה-IP + PIC לשמורה בצורת V 25 מ. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 130 המאגר הקר IP + 1 x PIC לערבב לתוך בארות בודדים של V-התחתון 96-ובכן נקי צלחת. מילוי טוב לפי IP. לתייג את הצלחת כמו "מתחם Ab-חרוז".
    8. להוסיף 12 µL של חלבון A (או G) שטף מגנטי חרוזים לתוך כל טוב המכיל מאגר IP + PIC ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. שמור את החרוזים שטף הנותרים על קרח.
    9. השג נוגדנים המאומת שלהם אחסון הקרה, הפשרה על קרח, אם נדרש. עבודה על קרח, לדלל את הנוגדנים עם 1 x Ab דילול מאגר ריכוזי שמוצג בטבלה 2.
    10. כדי כל טוב של צלחת מורכב Ab-חרוז, להוסיף 1 µL של הנוגדן המתאים, מדולל (טבלה 1). להקליט את הבאר מפתח נוגדנים. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מערבבים כל שורה על-ידי pipetting למעלה ולמטה 20 פעמים. לשנות טיפים בין שורות. לאטום את הצלחת מורכבים Ab-חרוז טוב מאוד עם כיסוי אלומיניום, דגירה ב 4 ° C על פלטפורמה מסתובבת כבר לפחות שעתיים.
      הערה: הדגירה הזה ניתן להמשיך עד מוכן להתחיל שלב 2.4.
  2. מערכת העיכול, פירוק של כרומטין, תא
    1. עבודה על קרח, להכין 1 x מאגר פירוק + 1 x PIC ו 1 מ"ל של MNase אני דילול מאגר (טבלה 3) ולשמור אותם על קרח.
    2. לאחזר את כדורי תא אחסון שלהם-80 ° C (או קרח, אם טריה). הפשרת כל גלולה תא באמבט מים 37 ° C 10 s, אז העברה לקרח.
    3. כדי כל גלולה תא מיד להוסיף קרח 1 x מאגר פירוק + 1 x PIC כדי ריכוז סופי של 10,000 תאים/20 µL, ומיקס 10 פעמים על ידי pipetting למעלה ולמטה, ללא יצירת בועות. לדוגמה, עבור 70,000 תאי האחסון הסופי הוא 140 µL.
    4. עובד על קרח, aliquot 20 µL/טוב של lysates שנוצר לתוך צלחת 96-ובכן. כיסוי לצלחת עם חותמת פלסטיק דגירה על קרח במשך 20 דקות תווית צלחת "MNase העיכול", להקליט את הבארות למפתח תבנית. על מנת להבטיח העיתוי המדויק של התגובה עיכול כרומטין, לא להמשיך העיכול עם יותר מ- 2 שורות של דגימות בכל פעם.
    5. בדיוק לפני פירוק 20 דקות השלמת, לדלל את MNase אני האנזים עם MNase אני דילול מאגר, כדי ריכוז סופי של 20 U/µL, ותשמור את זה על קרח.
    6. עבודה על קרח, להכין את MNase אני עיכול מאסטר תערובת על פי טבלה 4 ו- aliquot 20 µL של המיקס לכל שורה של דוגמאות בתוספת 5 נפח מת µL לתוך שורה אחת של צלחת 96-ובכן מאגר ולשמור אותו בקרח. עבור שתי שורות, אמצעי האחסון צריכה להיות: (20 µL x 2) + 5 µL = 45 µL.
    7. לאחר lysates הסיום המקננת, הסר את לוחית עיכול MNase של קרח. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 20 µL של MNase אני עיכול מאסטר לערבב לתוך כל שורה של דוגמאות, ומערבבים 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בדיוק.
    8. לאחר 5 דקות, כדי לעצור את התגובה, השתמש פיפטה רב-ערוצי כדי להוסיף 6 µL של מיקרומטר 250 ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) לתוך כל שורה של דוגמאות ומערבבים למעלה ולמטה, כמה פעמים לשנות טיפים בין שורות. לאחר תוספת EDTA, לעבור את ההגדרה של פיפטה 20 µL ושילוב 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח עצירה מוחלטת של התגובה לעיכול. לשנות טיפים בין שורות.
    9. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, כל שורה של MNase דגימות מעוכל, להוסיף 6 µL של 10 x פירוק מאגר, לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים. מכסה פלסטיק חותם, דגירה על קרח למשך 15 דקות.
  3. ניקוי קדם והגליונות קלט
    1. לאחר 15 דקות הדגירה, עובד על הקרח, בריכת בארות כל עבור אותו תא גלולה/תבנית אחת סטרילי, טרום מקורר על קרח, צינור 1.5 mL (המסומנות מראש עם מזהה תבנית) לערבב ביסודיות אבל לאט לאט בעזרת פיפטה כדי להימנע קצף דטרגנט.
    2. כל גלולה תא/תבנית, להעביר לילה µL 8 של כרומטין מתעכל לתוך חדש סטרילי, שפופרת 0.5 mL (המסומנות מראש עם מזהה תבנית), חנות ב 4 ° C. זה ישמש פקד קלט.
    3. להפיץ נפח הנותרים כרומטין מתעכל ב 48 µL aliquots, לתוך צלחת 96-ובכן חדשה. תא גלולה/תבנית 1 נכנס בארות A01-A06, תא גלולה/תבנית 2 נכנס בארות A07-A12, וכו '. לתעד את הבארות למפתח תבנית. תווית את הצלחת "טרום קרחת".
    4. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 120 µL 1 x מאגר IP + 1 x PIC µL 12 של שטף beads מגנטי חלבון A (או G) לבאר כל צלחת טרום קרחת מהשלב 2.3.3. מערבבים כל שורה על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים. לשנות טיפים בין שורות. חותם את הצלחת היטב עם כיסוי אלומיניום, דגירה על פלטפורמה מסתובבת ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 2 h.
  4. תגובה Immunoprecipitation
    1. לפני תחילת שלב זה לוודא כי המשטח מורכב Ab-חרוז (שלב 2.1.10) וצלחת טרום קרחת (שלב 2.3.4) יש מתפשט כי לפחות 2 ה מהיר מסובבת צלחות הן על ידי צריך שתוציאו בשביל 10 s-200 x g.
    2. מניחים את הצלחת מורכבים של Ab-חרוז (מתוך שלב 2.1.10) על מגנט צלחת ולחכות 15 s עבור הפתרון להתבהר. בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה מבלי להפריע את החרוזים. הסר את הלוחית של המגנט צלחת ולשמור אותו בקרח.
    3. מניחים את הצלחת התגובה ניקוי קדם (מתוך שלב 2.3.4) על מגנט צלחת ולחכות 15 s עבור חרוזים להפריד, הפתרון להתבהר. מבלי להפריע את החרוזים, להעביר בזהירות את תגובת שיקוע בעזרת פיפטה הבארות המקביל של Ab-חרוז צלחת מורכב שמר על קרח, לערבב בעדינות 15 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. חותם הצלחת היטב עם אלומיניום צלחת כיסוי, דגירה בין לילה (12-18 h) ב 4 ° C על פלטפורמה מסתובבת. תווית מחדש את הצלחת "IP תגובה".

3. יום 2: ndCHIP-seq

  1. מנקי ו • תנאי
    1. הגדר המיקסר חימום 65 ° C. על קרח, להכין מאגר מלח נמוכה לשטוף עם מאגר מלח גבוהה לשטוף. מהר לסובב את הצלחת התגובה IP מהשלב 2.4.3 10 s-200 x g.
    2. מניחים את הצלחת התגובה IP על מגנט צלחת ולחכות 15 s עבור הפתרון להתבהר. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. לוקח את הצלחת את המגנט לצלחת ומניחים אותו על קרח.
    3. כל שורה של דוגמאות בצלחת תגובת ה-IP, להוסיף 150 µL של מלח נמוכה כקרח לשטוף מאגר לערבב לאט 10 פעמים למעלה ולמטה כדי resuspend באופן מלא את החרוזים.
    4. מקם את הצלחת התגובה IP בחזרה על המגנט צלחת לחכות החרוזים להפריד, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מבלי להפריע את החרוזים להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. מניחים את הצלחת בחזרה על קרח, חזור על הצעדים 3.1.3 ו 3.1.4 סך של 2 שוטף.
    5. על קרח, כל שורה של דוגמאות בצלוחית תגובת ה-IP, להוסיף 150 µL של מלח גבוהה לשטוף מאגר לערבב לאט 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend באופן מלא את החרוזים.
    6. מקם את הצלחת התגובה IP בחזרה על המגנט צלחת לחכות החרוזים להפריד, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מבלי להפריע את החרוזים להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. מניחים את הצלחת התגובה IP על קרח ולהירגע מראש צלחת 96-ובכן חדשה לידו.
    7. כל שורה של דוגמאות בצלחת תגובת ה-IP, להוסיף 150 µL של מלח גבוהה לשטוף מאגר לערבב לאט 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend באופן מלא את החרוזים. לאחר resuspension, העברת כל שורה של דוגמאות על השורה המתאימה של צלחת חדשה, טרום מקורר, 96-ובכן. תווית את הצלחת "IP תגובה". למחוק את הלוח הישנה.
    8. מניחים את הצלחת התגובה IP חדש על המגנט צלחת ולחכות החרוזים להפריד. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. לקחת את הצלחת בטמפרטורת החדר.
    9. כל שורה של דוגמאות בצלחת תגובת ה-IP, להוסיף 30 µL של המאגר • תנאי שבב (EB) ולערבב לאט 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. הקפידו למנוע היווצרות בועה.
    10. לאטום את הצלחת היטב עם כיסוי ה-PCR, דגירה במיקסר חימום ב 65 ° C עבור h 1.5 עם מהירות ערבוב של 1,350 סל ד.
    11. לאחר דגירה 1.5 h, ספין למטה הצלחת התגובה IP ב- g x 200 עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. שנה את ההגדרה של מיקסר חימום ל 50 מעלות צלזיוס.
    12. לאחר הספין, למקם את הצלחת התגובה IP על מגנט צלחת ולחכות הפתרון לנקות. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות להעביר 30 µL של תגובת שיקוע לתוך צלחת חדשה 96-ובכן. השתמש בעצות טריים עבור כל שורה. לתייג את הצלחת "IP תגובה" ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
  2. עיכול חלבון
    1. לאחזר 30% פג/1 M NaCl חרוז מגנטי17 (מאגר הרכב טבלה) פתרון מהמקרר 4 ° C ולשמור אותה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות קריטיות: לוודא הפתרון חרוז באופן מלא יגיע לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך.
    2. לאחזר דגימות הבקרה קלט 4 ° C (שלב 2.3.2) ואחסון סחרור מהיר. למדוד את האחסון באמצעות פיפטה ולהוסיף מים הנדסה גנטית כל פקד קלט עבור נפח סופי של 30 µL. להעביר את הדגימות פקד קלט הבארות קלט שנבחרו מראש (בארות ריק) בצלחת התגובה IP (שלב 3.1.12). להקליט את הבאר למפתח מדגם.
    3. על קרח, להכין את התמהיל מאסטר עיכול חלבון כפי שמוצג בטבלה 5 מסה ונפח שווה aliquot לתוך שורה אחת של צלחת 96-ובכן המאגר.
    4. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, כל שורה של דוגמאות בצלוחית תגובת ה-IP, להוסיף µL 40 של המיקס מאסטר עיכול חלבונים ולערבב לאט 10 פעמים למעלה ולמטה. לאטום את הצלחת היטב עם כיסוי ה-PCR, ספין למטה ב- g x 200 עבור 1 דקות, דגירה במיקסר חימום ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות שוכן בגובה 650 סל ד. בעוד הצלחת הוא המקננת, להכין טרי 70% אתנול (EtOH) ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
    5. בתום 30 דקות הדגירה, לסובב את הצלחת התגובה IP ב- g x 200 עבור 1 דקות, 4 מעלות צלזיוס. לקחת את הצלחת בטמפרטורת החדר.
      הערה: לנפח הכללי צריך להיות עכשיו ~ 70 µL/טוב.
  3. חרוז לנקות באמצעות 30% פג/1 M NaCl חרוז מגנטי פתרון
    1. Aliquot טמפרטורת החדר 30% פג/1 M NaCl מגנטי חרוז פתרון לתוך שורה אחת של צלחת נקי 96-ובכן אגירה (µL 75 לכל דגימה x מספר שורות).
    2. עובד בטמפרטורת החדר, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 70 µL (יחס 1:1) של הפתרון מגנטי חרוז פג/1 M NaCl 30% כל שורה של דוגמאות בצלחת התגובה IP ומערבבים 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. דגירה את הצלחת. בשביל 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מניחים את הצלחת על המגנט צלחת, תקופת דגירה של 5 דקות כדי לאפשר את החרוזים להפריד.
    4. באמצעות פיפטה של, מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. שמור את החרוזים.
    5. בעוד הצלחת התגובה IP הוא עדיין על המגנט צלחת, בעזרת פיפטה רב-ערוצי, כל שורה של דוגמאות, להוסיף 150 µL בטמפרטורת החדר 70% EtOH דגירה ב-30 s. לאחר 30 s, פיפטה רב-ערוצי, באמצעות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה עוד פעם אחת על סך של 2 שוטף.
    6. לאחר לשטוף את השני EtOH, דגירה על הלוחית 'יבש' המגנט צלחת עבור מינימלית 3 לבחון באופן חזותי את הצלחת כדי לוודא כי כל EtOH זה התאדו. אם לא, דגירה את הצלחת. בשביל דק 1. ייבוש יתר על המידה בתוצאות חרוזים תשואה נמוכה יותר.
    7. לוקח את הצלחת את המגנט צלחת ושימוש של פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 35 EB (טבלה של חומרים). מערבבים היטב על ידי pipetting 10 פעמים למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות ל- elute.
    8. לאחר דגירה, למקם את הצלחת התגובה IP בחזרה על המגנט צלחת, דגירה למשך 2 דקות. צריך להפריד החרוזים, הפתרון יהיה ברור.
    9. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות להעביר את תגובת שיקוע לתוך הבארות המקביל של צלחת 96-ובכן חדשה.
    10. לאטום את הצלחת עם כיסוי אלומיניום תווית "עזרת + קלט DNA", לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או ב-20 ° C לטווח ארוך (> 48 שעות) אחסון.

4. יום 3: ספריית בנייה

  1. זרחון ותיקון קצה
    1. הקלט עבור התגובה סוף תיקון/זרחון הוא עזרת + קלט צלחת מהשלב 3.3.10. לאחר מפשיר, לסובב את הצלחת למטה ב- g x 200 עבור 1 דקות ב 4 ° C ולשמור אותו בקרח.
    2. לאחזר מ-20 ° C מקפיא כל ריאגנטים (מלבד אנזימים) הדרושים עבור התגובה סוף תיקון/זרחון (טבלה 6), להפשיר אותם בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להעביר מיד לקרח.
    3. עבודה על קרח, בצע טבלה 6 כדי להגדיר את התמהיל סוף תיקון/זרחון מאסטר בצינור microcentrifuge של 1.5 mL סטרילי. לאחר התוספת של כל הרכיבים שאינם-אנזים, מערבבים היטב בעזרת דופק-vortexing ולמקם את הצינור בחזרה על קרח.
    4. לאחזר אנזימים הרלוונטיות שלהם אחסון הקרה ותעבורה לספסל במעמד מגניב צינור צוננת. לערבב כל אנזים על ידי מצליף את הצינור, סיבוב מהיר, ומקם אותו בחזרה בארון צינור צוננת מגניב. כאשר pipetting את האנזים, תשאף באיטיות כדי להבטיח העברה נפח מדויק. לאחר התוספת, לשטוף את הטיפ בתערובת הראשי על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    5. פעם האנזימים נוספים, בעדינות דופק-מערבולת הבסיס מערבבים 5 פעמים כדי להבטיח ריפודי כתופיים של כל הרכיבים, ואז סיבוב מהיר ומניחים מיד את הצינור בחזרה על קרח.
    6. על קרח, aliquot אמצעי אחסון המתאים של המיקס סוף תיקון/זרחון מאסטר לתוך שורה אחת של צלחת 96-ובכן מאגר חדש; לאמצעי האחסון להיות aliquoted: (15 µL x מספר שורות) + 5 µL נפח מת. חישוב לדוגמה עבור שתי שורות: (15 µL x 2) + 5 µL = µL 35/טוב.
    7. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 15 של המיקס סוף תיקון/זרחון מאסטר כל שורה של דוגמאות ומערבבים 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. לאטום את הצלחת עם כיסוי פלסטיק, ספין למטה ב- g x 200 עבור 1 דקות ב 4 ° C, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  2. חרוז לנקות לאחר סיום ותיקון זירחון
    1. מהמקרר 4 ° C, לאחזר את 20% פג/1 M NaCl חרוז מגנטי פתרון והפתרון פג/1 M NaCl 30%, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות.
      הערה: הפתרון פג/1 M NaCl 30% אינן מכילות beads מגנטי.
    2. לאחר שני פתרונות להגיע לטמפרטורת החדר, עבור כל דגימה להכין µL 80 של 1:2 שילוב של 30% פג/1 M NaCl, 20% פג/1 M NaCl חרוז מגנטי פתרונות. דוגמה עבור דגימות 24: µL 80 x 24 = 1,920 µL (640 µL של 30% פג/1 M NaCl, µL 1,288 של 20% פג/1 M NaCl חרוז מגנטי פתרונות).
    3. Aliquot הפתרון חרוז לערבב, נפח שווה, לתוך שורה אחת של צלחת מאגר 96-ובכן, שיהיה בטמפרטורת החדר. Aliquot מאגר EB (µL 40 לדגימה x מספר שורות) לתוך שורה אחת של צלחת מאגר נקי 96-ובכן. דוגמא עבור שתי שורות: µL 40 x 2 = 80 µL/טוב.
    4. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 75 של המיקס חרוז מוכנים להיכנס 4.2.2 כל שורה של דוגמאות מהשלב 4.1.7 ומערבבים לאורך 10 פעמים. לשנות טיפים בין שורות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות המשך ההליך לנקות חרוז כפי שמתואר בספר צעדים 3.3.3-3.3.10. כיסוי לצלחת עם חותמת פלסטיק, סחרור מהיר ומניחים אותו על קרח. המשך לשלב 4.3.
  3. התגובה A-עוקב
    1. לאחזר מהמקפיא-20 ° C כל ריאגנטים (מלבד אנזימים) הדרושים עבור התגובה A-עוקב (טבלה מס ' 7), להפשיר אותם בטמפרטורת החדר ואז להעביר מיד לקרח.
    2. עבודה על קרח, בצע טבלה 7 כדי להגדיר את התמהיל מאסטר א-עוקב בצינור microcentrifuge של 1.5 mL סטרילי. בצע את הוראות ההתקנה של המבשלה אנזימטי הכללית כפי שמתואר בספר צעדים 4.1.4-4.1.6.
    3. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 15 של המיקס מאסטר א-עוקב כל שורה של דוגמאות ומערבבים 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. לאטום את הצלחת עם כיסוי ה-PCR, ספין למטה ב- g x 200 עבור 1 דקות ב 4 ° C, דגירה ב thermocycler ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לסובב את הצלחת למטה ב- g x 200 עבור 1 דקות ולשמור אותה בטמפרטורת החדר.
  4. חרוז לנקות לאחר A-עוקב
    1. בצע את השלבים המתוארים שלב 4.2. כיסוי לצלחת עם חותמת פלסטיק, תווית "זנב A + לפני הספירה", ספין מהירה, ומניחים אותו על קרח. המשך לשלב 4.5.
  5. מתאם מצדו
    1. לאחזר מהמקפיא-20 ° C כל ריאגנטים (מלבד אנזימים) הדרושים עבור התגובה מצדו מתאם (טבלה 8), להפשיר אותם בטמפרטורת החדר ואז להעביר מיד לקרח.
    2. לאחזר 10 מיקרומטר PE מתאם (משלימה טבלה 1) פתרון מניות ו לדלל כדי 0.5 מיקרומטר באמצעות EB. מערבבים היטב בעזרת דופק vortexing. אמצעי האחסון הנדרש הוא 3 µL x מספר דוגמאות. עובד על קרח, aliquot מתאם 0.5 מיקרומטר PE, נפח שווה, לתוך בארות 12 של צלחת מאגר נקי 96-ובכן. . לשמור את זה על קרח.
    3. עבודה על קרח, בצע טבלה 8 כדי להגדיר את התמהיל מאסטר מצדו מתאם צינור microcentrifuge 1.5 mL סטרילי. בצע את הוראות ההתקנה של המבשלה אנזימטי הכללית כפי שמתואר בספר צעדים 4.1.4-4.1.6. ודא כי 5 X מהירה מצדו מאגר מלא המופשרים ולערבב היטב לפני השימוש.
    4. על קרח, aliquot אמצעי אחסון המתאים של המיקס מתאם מצדו מאסטר לתוך שורה אחת של צלחת 96-ובכן המאגר החדש. לדוגמה, חישוב עבור שתי שורות: (23 µL x 2) + 5 µL = µL 51/טוב. לקחת את הצלחת על קרח.
    5. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 2 µL של 0.5 מיקרומטר סוף לזווג (PE) מתאם לתוך כל שורה של דגימות שלב 4.4.1 ושילוב. לשנות טיפים בין שורות.
    6. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 23 של המיקס מתאם מצדו מאסטר כל שורה של דוגמאות ומערבבים 15 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. לאטום את הצלחת עם כיסוי מתכת, תווית "מצדו", ספין למטה ב- g x 200 עבור 1 דקות ב- 4 ° C, דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  6. יום 4: חרוז לנקות #1 לאחר מתאם מצדו
    1. מהמקרר 4 ° C, לאחזר את הפתרון מגנטי חרוז פג/1 M NaCl 20%, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות. בעוד הפתרון הוא equilibrating להכין טרי 70% EtOH.
    2. Aliquot הפתרון מגנטי חרוז פג/1 M NaCl 20%, µL 55 לדגימה, לתוך שורה אחת של מאגר 96-ובכן צלחת ולשמור אותה בטמפרטורת החדר. דוגמא עבור שתי שורות: µL 55 x 2 = 110 µL/טוב.
    3. מאגר EB aliquot, µL 50 עבור דגימה, לתוך שורה אחת של צלחת מאגר נקי 96-ובכן. דוגמא עבור שתי שורות: µL 50 x 2 = 100 µL/טוב.
    4. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 48 של הפתרון מגנטי חרוז פג/1 M NaCl 20% לתוך כל שורה של דוגמאות בצלחת מצדו מהשלב 4.5.6 ולערבב לאורך 10 פעמים. לשנות טיפים בין שורות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות המשך ההליך לנקות חרוז כפי שמתואר בספר צעדים 3.3.3-3.3.7.
    5. . קח את לוחית הרישוי של פיפטה רב-ערוצי, המגנט צלחת ושימוש להוסיף 45 µL EB (טבלה של חומרים). מערבבים היטב על ידי pipetting 10 פעמים למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. תקופת דגירה של טמפרטורת החדר במשך 3 דקות ל- elute.
    6. לאחר דגירה, למקם את הצלחת התגובה IP בחזרה על המגנט צלחת תקופת דגירה של 2 דק בעזרת פיפטה רב-ערוצי, מבלי להפריע את החרוזים, להעביר בזהירות את תגובת שיקוע לתוך הבארות המקביל של צלחת 96-ובכן חדשה. תווית את הצלחת "מצדו + 1 לפני הספירה".
    7. על כל טוב מוסיפים 5 µL 10 x PCR דיוק גבוה מאגר ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. כיסוי לצלחת עם חותמת פלסטיק, סיבוב מהיר, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
  7. חרוז לנקות #2 לאחר מתאם מצדו
    1. לבצע ניקיון חרוז כמתואר בסעיף 4.6 עם השינויים הבאים: להוסיף 60 µL 20% פג/1 M NaCl חרוז מגנטי לפתרון מכל קידוח פעיל מצדו + צלחת 1 לפנה ס (שלב 4.6.7), elute של החרוזים באמצעות µL 35 EB המאגר. לתייג את הצלחת "מצדו + 2 לפנה ס" ולשמור אותו בקרח.
  8. PCR-הגברה
    1. לאחזר מהמקפיא-20 ° C כל של ריאגנטים (מלבד אנזימים) הדרושים עבור התגובה PCR (טבלה 9), להפשיר אותם בטמפרטורת החדר ואז מיד למקם אותם על קרח.
    2. עבודה על קרח, בצע טבלה 9 כדי להגדיר את התמהיל PCR מאסטר בצינור microcentrifuge של 1.5 mL סטרילי. בצע את ההוראות הגדרת כללי המבשלה כפי שמתואר בספר צעדים 4.1.4-4.1.5. על קרח, aliquot אמצעי אחסון המתאים של המיקס PCR מאסטר לתוך שורה אחת של צלחת 96-ובכן המאגר החדש. . לשמור את זה על קרח. ראה שלב 4.5.4 לחישובי הדגימה.
    3. עובד על קרח, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מוסיפים 2 µL של כל מיקרומטר 12.5 ייחודי PCR הפוך אינדקס פריימר (משלימה בטבלה 2) לבאר כל ב מצדו + צלחת 2 לפני הספירה (שלב 4.7.1) ומערבבים לאט לאט למעלה ולמטה. לשנות טיפים בין שורות. לקחת את הצלחת על קרח.
    4. עבודה על קרח, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 23 של המיקס מאסטר PCR לתוך כל שורה של דוגמאות שלב 4.8.3 ושילוב 10 פעמים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. לאטום את הצלחת עם כיסוי ה-PCR, לסובב אותו למטה-200 g x עבור 1 דקות, דגירה ב thermocycler (ראה טבלה 10 תנאי הרכיבה PCR).
  9. חרוז לנקות לאחר ה-PCR-הגברה
    1. לאחר ה-PCR הגברה לסובב את הצלחת ב g x 200 עבור 1 דקות, 4 מעלות צלזיוס. לבצע חרוז הניקיון כמתואר בסעיף 4.6 עם השינויים הבאים: להוסיף µL 51 של 20% פג/1 M NaCl חרוז מגנטי פתרון כל התגובה PCR, elute של החרוזים באמצעות µL 25 EB המאגר. לאטום את הצלחת עם חיפוי אלומיניום ו ספין למטה ב g 200 x דק 1 חנות הדגימות ב-20 ° C.
    2. כדי לאמת את ספריות שלא נבנה, לבצע כימות DNA שימוש assay מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית, להמחיש את המוצר הסופי באמצעות מנתח מבוססי שבב אלקטרופורזה נימי (assay רגישות גבוהה), ולהפעיל העשרה PCR כמותי (qPCR) (ראה נציג תוצאות, אימות של ndChIP-seq איכות לספריה על-ידי qPCR).

תוצאות

כרומטין עיכול פרופילים
אופטימיזציה של עיכול MNase חיוני להצלחת פרוטוקול זה. זה קריטי ליצירת פרופיל עיכול נשלט על ידי יחיד נוקלאוזום פרגמנט גדלים, כל עוד לא מעוכל יתר על המידה, כדי לאפשר התאוששות של קטעים נוקלאוזום סדר גבוהה יותר. פרופיל אידיאלי העיכול מורכבת רוב של שברי נוקלאוזום יחיד עם חלק קטן המייצגים שברים קטנים יותר, גדול יותר נוקליאוזומים יחיד. איור 1 מציג דוגמאות של פרופילים הפצה גודל אידיאלי יתר מעוכל, תחת-מעוכלים. שימו לב כי העיכול תת אופטימלית של כרומטין גם יהיה גלוי בפרופיל של הספרייה רצף הנוצר מתוך החומר IP (איור 2).

אימות באיכות ספריית ndChIP-seq מאת qPCR
qPCR היא שיטה ומבוססת על הערכה של האיכות של שבב18,19,20. בעת ביצוע ndChIP-seq על 10,000 תאים את התשואה של חומצת גרעין אחרי IP יהיה מתחת 1 ng. לכן, חיוני לבצע qPCR לאחר בניית ספריה כדי להעריך את העשרת היחסיים אזורי היעד על רקע. כדי לספק הערכה רקע, נוצרים ספריות בנוי על MNase מתעכל כרומטין (קלט). עבור כל ספריית ה-IP, נדרשים שני סטים של צבעי יסוד (ראו המשלימיםטבלה 3 לקבלת רשימה של צבעי יסוד סימני היסטון נפוץ). סט פריימר אחד צריך להיות ספציפי עבור אזור גנומית משויכת באופן עקבי השינוי היסטון עניין (יעד חיובי) ואזור אחר שאינו מסומן עם השינוי היסטון עניין (יעד שלילי). האיכות של הספרייה שבב-seq ייבחנו כמו לקפל העשרה ביחס ספריית קלט. קיפול העשרה ניתן לחשב באמצעות המשוואה הבאה כי ההנחה הגברה מעריכית של אזור היעד גנומית: 2Ctקלט-CtIP. מותאמים אישית שלנו עשוי חבילת תוכנה סטטיסטית R, qcQpcr_v1.2, היא מתאימה לניתוח העשרה qPCR של נמוך קלט יליד שבב-seq ספריות (קובצי קוד משלים). איור 3 מייצג תוצאה qPCR עבור ספריות שבב-seq ושנכשלו. הערך העשרה קיפול הצפוי המינימלי עבור ספריות ndChIP-seq באיכות טובה הם 16 עבור סימני צר, כגון H3K4me3 ו- 7 עבור סימני רחבה, לדוגמה H3K27me3.

מידול MNase נגישות
ניתוח חישובית של שבב-seq הוא מורכב וייחודי עבור כל הגדרה ניסיוני. סט של הנחיות נוסדה על ידי הבינלאומי האנושי Epigenomic Consortium (IHEC), האנציקלופדיה של ה-DNA אלמנטים (קידוד) ניתן להשתמש כדי להעריך את האיכות של ספריות שבב-seq21. חשוב לציין כי העומק רצף של הספריות משפיע את זיהוי והרזולוציה של אזורים מועשר20. מספר פסגות זוהה גידול ואת הגישות מישור כמו עומק קריאה בעליות. אנו ממליצים ndChIP-seq ספריות שנקבע בהתאם להמלצות IHEC של 50 מיליון לזווג-סינכרוניות (25 מיליון רסיסים) עבור סימני צרים (למשל, H3K4me3) וקורא 100 מיליון לזווג-(50 מיליון רסיסים) עבור סימני רחבה ( למשל, H3K27me3) קלט22. במעמקי רצף אלה מספקים היישורים רצף מספקת לצורך זיהוי של הפסגות המשמעותי ביותר תוך שימוש נרחב בשימוש שבב-seq המתקשרים שיא, כגון MACS2 והומר, בלי להגיע רוויה23,24. ספרייה ndChIP יונקים-seq באיכות גבוהה יש שיעור כפולות ה-PCR של < 10% והפניה הגנום יישור שיעור > 90% (כולל קריאות כפולים). NdChIP מוצלחת-seq ספריות יכיל משכפל מאוד מתואם עם חלק ניכר (> 40%) של קריאות מיושר בתוך MACS222 מזוהה מועשר פסגות ו פיקוח הקריאות מיושר על דפדפן הגנום לחשוף באופן חזותי enrichments לזיהוי בהשוואה הספרייה קלט (איור 4). בנוסף, ניתן להשתמש ndChIP-seq להעריך נוקלאוזום בצפיפות על ידי שימוש באלגוריתם הפצה תערובת לפי עקומת גאוס (w1 * n(x; Μ 1,σ1) + w2 * n(x; μ2, σ2) = 1) ב- MACS2 לזהות אזורים מועשר דגם נוקלאוזום לדחיסות כפי שהוגדרו על ידי גבולות נגיש MNase. במודל זה, w1 מייצג מונו-נוקלאוזום חלוקת משקל ו- w2 מייצג משקל הפצה di-נוקלאוזום. איפה w1 הוא גדול מ- w2, יש דומיננטיות של קטעים מונו-נוקלאוזום ולהיפך. ניתוח זה דורש כי ספריות היה לסדרם אופנה לזווג-קצה כך גדלים פרגמנט יכולה להיות מוגדרת. כדי להחיל את האלגוריתם הפצה תערובת לפי עקומת גאוס, אזורים מועשר סטטיסטית מזוהים לראשונה. אנו ממליצים להתקשר שיא עם MACS2 באמצעות קלט כפקד, עם הגדרות ברירת המחדל עבור סימני צר על קיצוץ ערך q של 0.01 עבור סימני רחבה. מספר החבילות הסטטיסטיות העסקת באלגוריתם התפלגות לפי עקומת גאוס תערובת של חבילות תוכנה סטטיסטית בשימוש נרחב זמינים. ניצול גודל ממוצע פרגמנט, נקבע על-ידי גבולות קריאה לזווג-end הדגימות עזרת, הפצות-MACS2 זיהה היזמים מועשר ולאחר באלגוריתם התפלגות לפי עקומת גאוס תערובת שניתן להחיל על כל יזם באמצעות החבילה R-סטטיסטי Mclust בגירסה 3.025 לחישוב התפלגות משוקלל. ביישום זה, אנו ממליצים על ביטול היזמים המכיל פחות מ 30 קטעים מיושר כי מתחת לסף זה המשקל וכתוצאה מכך הערכות להיות לא אמינים. ספרייה ndChIP-seq באיכות טובה יוצרת התפלגות לפי עקומת גאוס תערובת מורכבת משני רכיבים עיקריים עם רשע ערכים המייצגים מונו-, די-נוקלאוזום שבר אורכי.

figure-results-5058
איור 1 : הערכה של MNase העיכול לפני דור הספרייה. פרופילים מבוססי שבב אלקטרופורזה נימי מנתח של MNase האופטימלית (A), תחת מעוכל (B), מתעכל יתר מתעכל כרומטין (C). משכפל ביולוגי מוצגים עקבות, אדום, ירוק וכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5655
איור 2 : הערכה של MNase העיכול אחרי דור הספרייה. (א) פוסט ספריית פרופילים הבנייה של קלט מתעכל בצורה אופטימלית (משכפל ביולוגי; אדום, ירוק, שחור) ו- IP (משכפל הביולוגית; טורקיז, סגול, כחול) קלט תת אופטימלית (B) (משכפל ביולוגי; אדום, ירוק, כחול) ו- IP ( משכפל ביולוגי; ספריות ציאן, סגול, כתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6321
איור 3 : פוסט הבנייה ספריית ה-PCR כמותי יכול לשמש כדי להעריך את האיכות של ספריות ndChIP seq. קיפול העשרה של H3K4me3 IP ספריות ביחס ספריות קלט מחושב כ- 2(Ct של קלט - Ct של IP) עבור מטרות חיוביות ושליליות באמצעות qcQpcr_v1.2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6896
איור 4 : הספרייה ndChIP נציג-seq נבנה מ- 10,000 CD34 ראשי+ כבל כדוריות דם. מתאם פירסון H3K4me3 אות (קורא לכל מיליון קריאות ממופה) מחושבת באופן היזמים (TSS + /-2Kb) בין משכפל ביולוגית 3, שכפול (א) 1 ו-2, (B) לשכפל 1 ו- 3, שכפול (ג) 2 ו- 3. (ד) UCSC בתצוגת דפדפן של אשכול גנים HOXA של שבב צולבים-seq שנוצר מתאי 1 מיליון לפי IP, ndChIP מוצלחת-seq מתאי 10,000 לכל IP ו- ndChIP לא מוצלח-seq מתאי 10,000 לכל IP. (אדום: H3K27me3, ירוק: H3K4me3, ושחור: קלט). (E) שבר הקריאות ממופה בתוך MACS2 לזהות אזורים מועשר של H3K4me3 (שחור), H3K27me3 (אפור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מאגר הרכב
A.1-מאגר Immunoprecipitation (IP)
20 מ מ טריס-HCl pH 7.5
2 מ מ EDTA
150 מ מ NaCl
0.1% טריטון X-100
0.1% Deoxycholate
Butyrate נתרן 10 מ מ
שטיפת מלח נמוכה מאגר A.2.
20 מ מ טריס-HCl pH 8.0
2 מ מ EDTA
150 מ מ NaCl
1% טריטון X-100
0.1% מרחביות
שטיפת מלח גבוהה מאגר A.3.
20 מ מ טריס-HCl pH 8.0
2 מ מ EDTA
500 מ מ NaCl
1% טריטון X-100
0.1% מרחביות
• תנאי שבב מאגר A.4.
NaHCO 100 מ מ3
1% מרחביות
A.5-1 x פירוק מאגר – 1 מ"ל
0.1% טריטון
0.1% Deoxycholate
Butyrate נתרן 10 מ מ
A.6-Ab דילול מאגר
0.05% (w/v) אזיד
0.05% בספקטרום רחב מיקרוביאלית (למשל ProClin 300)
ב- PBS
A.7-30% פתרון חרוז מגנטי של פג / 1M NaCl (הפניה16)
30% פג
NaCl 1 מ'
10 מ מ טריס HCl pH 7.5
1 מ מ EDTA
1 מ"ל של חרוזים פאראמגנטיים סופר שטף
A.8. 20% פתרון חרוז מגנטי של פג / 1M NaCl (הפניה16)
30% פג
NaCl 1 מ'
10 מ מ טריס HCl pH 7.5
1 מ מ EDTA
1 מ"ל של חרוזים פאראמגנטיים סופר שטף

טבלה 1: ndChIP-seq מאגר הרכב.

שינוי היסטוןריכוז (µg/µL)
H3K4me30.125
H3K4me10.25
H3K27me30.125
H3K9me30.125
H3K36me30.125
H3K27ac0.125

טבלה 2: כמות נוגדנים הדרושים עבור ndChIP-תת סעיף.

Reganetנפח (µL)
מים טהורים אולטרה478
ז טריס-HCl 1 pH 7.510
0.5 EDTA מ'10
NaCl 5 מ'2
גליצרול500
הנפח הכולל1,000

טבלה 3: מתכון MNase דילול מאגר.

מגיבנפח (µL)
מים טהורים אולטרה13
20 מ מ DTT1
10 x MNase מאגר4
20 U/µl Mnase2
הנפח הכולל20

טבלה 4: מתכון מיקס מאסטר MNase.

מגיבנפח (µL)
• תנאי מאגר30
מאגר G28
פרוטאז2
הנפח הכולל40

טבלה 5: מתכון מיקס מאסטר טיהור DNA.

מגיבנפח (µL)
מים טהורים אולטרה3.3
10 x מאגר הגבלת Endonuclease (למשל NEBuffer)5
25 מ מ ATP2
dNTPs 10 מ מ2
T4 Polynucleotide קינאז (U 10/µl)1
T4 DNA פולימראז (U 3/µl)1.5
Dna פולימראז אני, שבר גדול (Klenow) (U 5/µl)0.2
הנפח הכולל15

טבלה 6: מתכון סוף תיקון מאסטר מיקס.

מגיבנפח (µL)
מים טהורים אולטרה8
10 x מאגר הגבלת Endonuclease (למשל NEBuffer)5
10 מ מ dATP1
Klenow (3 - 5' exo-)1
הנפח הכולל15

טבלה 7: מתכון מיקס מאסטר א-עוקב.

מגיבנפח (µL)
מים טהורים אולטרה4.3
5 x מאגר מצדו מהירה12
T4 DNA ליגאז (2000 U/µl)6.7
הנפח הכולל23

טבלה 8: מתכון מיקס מאסטר מצדו מתאם.

מגיבנפח (µL)
מים טהורים אולטרה7
25. PCR פריימר 1.02
5 x מאגר HF12
דימתיל סולפוקסיד1.5
DNA פולימראז0.5
הנפח הכולל23

טבלה 9: מתכון מיקס מאסטר PCR.

שמתוכננים (° C)משך (s)מספר מחזורי
98601
9830
651510
7215
723001
4. תחזיק. תחזיק

טבלה 10: PCR להפעיל שיטה.

Oligoרצףהשינוי
PE_adapter 15'-/ 5Phos/גת CGG AAG AGC GGT TCA GCA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה ATG CCG AG-3'5. שינוי: זירחון
PE_adapter 25' - ACA CTC TTT CCC טק ACG ACG CTC TTC CGA TC * T - 3'3' שינוי: * T הוא קשר phosphorothioate

משלימה טבלה 1: רצפים Oligo לדור של מתאם PE.

פריימר שםרצףאינדקסIndexRevC (שישמש עבור רצף)
PCR הפוך אינדקס פריימר 1CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGTGATatcacg
PCR הפוך אינדקס פריימר 2CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTGATCgatcag
PCR הפוך אינדקס פריימר 3CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGGGGTTaacccc
PCR הפוך אינדקס פריימר 4CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTGGGTacccag
PCR הפוך אינדקס פריימר 5CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCGCTagcgct
PCR הפוך אינדקס פריימר 6CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTTTTGcaaaag
PCR הפוך אינדקס פריימר 7CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTGTTGGccaaca
PCR הפוך אינדקס פריימר 8CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCTAGctagct
PCR הפוכה פריימר אינדקס 9CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCATCgatgct
PCR הפוך אינדקס תחל 10CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGATTAtaatcg
PCR הפוך אינדקס פריימר 11CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATTCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCATTCAtgaatg
PCR הפוך אינדקס פריימר 12CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGGAACTagttcc
PCR הפוך אינדקס פריימר 13CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTACATCGcgatgt
PCR הפוך אינדקס פריימר 14CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAAGCTAtagctt
PCR הפוך אינדקס פריימר 15CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCAAGTTaacttg
PCR הפוך אינדקס פריימר 16CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCCGGTaccggc
PCR הפוך אינדקס פריימר 17CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGCCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGGCCTaggccg
PCR הפוך אינדקס פריימר 18CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTAGTTGcaacta
PCR הפוך אינדקס פריימר 19CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCGTGGccacgc
PCR הפוך אינדקס פריימר 20CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGTATAGctatac
PCR הפוך אינדקס פריימר 21CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTTGCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCCTTGCgcaagg
PCR הפוך אינדקס פריימר 22CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCTGTAtacagc
PCR הפוך אינדקס פריימר 23CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTATGGCAtgccat
PCR הפוך אינדקס פריימר 24CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTGACATatgtca

משלימה בטבלה 2: ה-PCR הפוך אינדקס פריימר רצפים.

תחלרצף
ZNF333_genic_H3K9me3_F5'-AGCCTTCAATCAGCCATCATCCCT-3'
ZNF333_genic_H3K9me3_R5'-TCTGGTATGGGTTCGCAGATGTGT-3'
HOXA9-10_F5'-ACTGAAGTAATGAAGGCAGTGTCGT-3'
HOXA9-10_R5'-GCAGCAYCAGAACTGGTCGGTG-3'
GAPDH_genic_H3K36me3_F5'-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3'
GAPDH_genic_H3K36me3_R5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'
GAPDH-F5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'
GAPDH-R5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'
שינוי היסטוןמטרה חיוביתהיעד שלילי
H3K4me3GAPDHHOXA9-10
H3K4me1GAPDH_genicZNF333
H3K27me3HOXA9-10ZNF333
H3K27acGAPDHZNF333
H3K9me3ZNF333HOXA9-10
H3K36me3GAPDH_genicZNF333

3 טבלה משלימה: רשימה של צבעי יסוד סימני היסטון נפוץ (H3K4me3, H3K4me1, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3 ו- H3K36me3).

משלימה קובץ 1: גליון ndChIP-seq. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובצי קוד משלים: qcQpcr_v1.2. R חבילת תוכנה סטטיסטית לניתוח העשרה qPCR של ספריות נמוך שבב-seq קלט מקורית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

בהתחשב באופי קומבינטורית כרומטין השינוי ואת נוקלאוזום מיצוב בתקנה תעתיק, שיטה המאפשרת מדידות סימולטני של תכונות אלה סביר לספק תובנות חדשות תקנה epigenetic. פרוטוקול ndChIP-seq המוצג כאן הוא פרוטוקול שבב-seq יליד ממוטבת כדי לאפשר חקירה סימולטני של שינוי היסטון וצפיפות נוקלאוזום תאי יסוד נדיר9,10. ndChIP-seq מנצל עיכול אנזימטי של כרומטין, כאשר מצמידים רצף מקביל בנפט לזווג-end ודגם הפצה תערובת לפי עקומת גאוס, מאפשר השינויים היסטון החקירה ברמה נוקלאוזום יחיד ו deconvolution של פרופילים epigenomic מונע על ידי הטרוגניות בתוך אוכלוסיה. באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו דיווחו בעבר כי התפלגות ייחודיים בגדלים פרגמנט זירז חיסונית, נקבע על ידי זיווג-end לקרוא גבולות, שקשורות במדינות כרומטין ספציפיים שהוגדרו על-ידי ChromHMM10,24.

האיכות של ספרייה ndChIP-seq תלוי גורמים רבים, כגון ירידה לפרטים נוגדן, רגישות, תנאים אופטימליים של עיכול MNase איכות כרומטין. יחודיות של הנוגדנים בשימוש חיוני בהפקת ספריית ndChIP מוצלחת-seq. נוגדן אידיאלי מראה זיקה גבוהה נגד epitope עניין עם תגובתיות צלב קטן עם epitopes אחרים. חשוב לא פחות לבחור beads מגנטי עם האהדה הגבוהה הנוגדן של בחירה.

MNase עיכול הוא תגובה קריטיות ולא זמן הריכוז-והרגיש של פרוטוקול זה. לכן, בעת עיבוד הדגימות מרובים, זה חשוב כי כל תגובה מודגרת למשך כמות שווה של זמן (ראה שלב 2.2). האיכות של כרומטין היא גורם נוסף המשפיע באופן משמעותי את התוצאה של ndChIP-תת סעיף Fragmented כרומטין מוביל פרופיל תת אופטימלית של מערכת העיכול MNase ותוצאות בספריות עם קליטה נמוכה יחס הרעש. דוגמאות ראשי עם נמוך תא הכדאיות או מושפל כרומטין, כמו פורמלין-תיקון רקמות (FFPE) פרפין-מוטבע לא מומלצים עבור פרוטוקול זה.

התוספת של PIC במהלך החילוץ כרומטין מפחית לא רצויות (קרי, אקראי) כרומטין ולהפיק שומר על תקינות היסטון זנבות. ככזה, PIC צריך להוסיף מאגר פירוק ומאגר immunoprecipitation רגע לפני השימוש. בעת בחירת תאים באמצעות cytometry זרימה, בחר עבור התאים קיימא ולהבטיח תאים ממוינים בספיקה נמוכה כדי להגביר את הדיוק של הערכת מספר התא ואת הכדאיות של תאים. הימנע מיון תאי ישירות לתוך מאגר פירוק. המאגר נדן לדלל את המאגר פירוק ומונע permeabilization יעיל של קרום התא כדי MNase. בהתאם לסוג תאים או אורגניזם, טיטור של MNase עשויים להידרש לקבל לעיכול אופטימלי.

ndChIP-seq בתאי יונקים מחייב רצף מינימלי לעומק של 50 מיליון לזווג-סינכרוניות (25 מיליון רסיסים) עבור סימני צר וקורא 100 מיליון לזווג-(50 מיליון רסיסים) עבור קלט וסימוני רחבה. האלגוריתם התפלגות לפי עקומת גאוס תערובת לא יבצע בצורה אופטימלית על ספריות יש כבר וסודרו לעומק באופן משמעותי להלן המלצה זו. ndChIP-seq לא תסווג היזמים עם מעט הפרדה בין ערך משוקלל הפצה עבור מונו - ו di-נוקלאוזום שבר אורכי לתוך מונו - או di-נוקלאוזום נשלט היזמים. לכן, אלה היזמים להסירו בניתוח עוקבות. ניתן להפיק משכפל ביולוגי כדי להגביר את האמון התפלגויות חזויות וזהה השתנות טכני בבניית לעיכול, ספריית MNase.

בניגוד חזרות הקודם של יליד שבב-seq פרוטוקולים, ndChIP-seq מספק את האמצעים כדי לחקור את השפעת שינוי המבנה של היסטון כרומטין קומבינטורית על ידי ניצול פרגמנט גודל פוסט immunoprecipitation לשלב נוקלאוזום צפיפות, נקבע על ידי נגישות MNase, עם מדידות שינוי היסטון. יישום של ndChIP-seq על ראשי תאים ורקמות לספק הרומן תובנות לגבי טבע אינטגרטיבית של תקנה epigenetic, מאפשר זיהוי של חתימות epigenetic בשל הטרוגניות בתוך האוכלוסייה.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

א. ל נתמכה על ידי מלגה לתואר שני קנדי מן המכון הקנדי של בריאות המחקר. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קולומביה הבריטית הגנום והמחקרים קנדי מוסדות של בריאות (CIHR-120589) כחלק אפיגנטיקה הקנדי, הסביבה ועל הבריאות מחקר קונסורציום היוזמה על ידי התוכנית מכון מחקר פוקס טרי פרוייקט גרנט #TFF-122869 מ. ה, מכון המחקר של שועל טרי חדש החוקר פרס (גרנט # 1039) ל מ. ה

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1M Tris-HCl –pH 7.5Thermo Scientific15567-027
1M Tris-HCl –pH 8Thermo Scientific15568-025
0.5M EDTAThermo ScientificAM9260G
5M NaClSigma1001385276
Triton X-100Sigma1001412354
Sodium-DeoxycholateSigma1001437582
SDSThermo Scientific15525-017
Sodium-BicarbonateFisher ScientificS233-500
100% EtOHNANA
V-bottom 96 well plate (AB 1400)Thermo ScientificAB-1400-L
Gilson P2 pipetmanMandelF144801
Gilson P10 pipetmanMandelF144802
Gilson P20 pipetmanMandelF123600
Gilson P100 pipetmanMandelF123615
Gilson P200 pipetmanMandelF123601
Gilson P1000 pipetmanMandelF123603
Micrococcal Nuclease NEBM0247S
Thermo Mixer C (Heating block mixer)Eppendorf5382000023
Multi 12-channel Pippet P20Rainin17013803
Multi 12-channel Pippet P200Rainin17013805
1.5 ml LoBind tubeEppendorf22431021
0.5 ml LoBind tubeEppendorf22431005
Plastic Plate CoverEdge Bio48461
PCR coverBio RadMSD-1001
Aluminum Plate CoverBio RadMSF-1001
Elution buffer (EB buffer)Qiagen19086
1M DTTSigma646563
Eppendorf 5810R centrifuge Eppendorf22625004
Ultrapure waterThermo Scientific10977-015
Protein G dynabeadsThermo Scientific10001D
Protein A dynabeadsThermo Scientific10001D
Protease inhibitor CocktailCalbiochem539134
Rotating platformMandel1b109-12052010
Plate magnetAlpaqua2523
Domed 12-cap stripBio RadTCS1201
Buffer G2Qiagen1014636
ProteaseQiagen19155
Tube Magnet (DynaMag-2)Thermo Scientific12321D
Tube Magnet (DynaMag-2)LabCore730-006
V shape Plastic reservoirMandelS0100A
VortexMandelC1801
Mini FugeMettler ToledoXS2035
Analytical scaleMandelLB109-12052010
Quick Ligation Reaction Buffer, 5XNEBB6058S
DNA Polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBM0210S
Klenow Fragment (3'-5' exo)NEBM0212S
T4 DNA PolymeraseNEBM0203S
T4 Polynucleotide KinaseNEBM0201S
Deoxynucleotide Solution mix, 10mMNEBN0447S
dATP Solution 10mMNEBN0440S
Quick T4 DNA LigaseNEBM0202T
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP), 25mMNEBP0756S
DNA PolymeraseThermo ScientificF549L
NEBuffer 2NEBB7002S
Hank's buffered salt solutionThermo Scientific14025076
Fetal bovine serum Thermo ScientificA3160702
phosphate buffer saline Thermo Scientific10010023
H3K4me3Cell Signaling9751S
H3K4me1DiagenodeC15410037
H3K27me3DiagenodepAb-069-050
H3K36me3Abcamab9050
H3K9me3DiagenodeC15410056
SeraMag  super-paramagnetic beads

References

  1. Simpson, R. T. Nucleosome Positioning: Occurrence, Mechanisms, and Functional Consequences. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40, Issue C 143-184 (1991).
  2. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundmamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
  3. Schones, D. E., et al. Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome. Cell. 132 (5), 887-898 (2008).
  4. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
  5. Shiio, Y., Eisenman, R. N. Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. PNAS. 100 (23), 13225-13230 (2003).
  6. Li, L., Lorzadeh, A., Hirst, M. Regulatory variation: An emerging vantage point for cancer biology. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 6 (1), 37-59 (2014).
  7. Jiang, J., et al. Investigation of the acetylation mechanism by GCN5 histone acetyltransferase. PLoS ONE. 7 (5), (2012).
  8. Kouzarides, T. Histone methylation in transcriptional control. Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2), 198-209 (2002).
  9. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat. Commun. 6, 6033(2015).
  10. Lorzadeh, A., et al. Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility. Cell Rep. 17 (8), 2112-2124 (2016).
  11. Noll, M., Kornberg, R. D. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1. J. Mol. Biol. 109 (3), 393-404 (1977).
  12. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding. eLife. 4, 09225(2015).
  13. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. , (2012).
  14. Cui, K., Zhao, K. Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq. Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).
  15. Mieczkowski, J., et al. MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility. Nat. Commun. 7, 11485(2016).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). JOVE. (41), (2010).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
  18. Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 445 (7130), 936-940 (2007).
  19. Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes. Science. 319 (5864), 819-821 (2008).
  20. Mendenhall, E. M., et al. Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat. Biotechnol. 31 (12), 1133-1136 (2013).
  21. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  22. Reference Epigenome Standards - IHEC. , Available from: http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/ (2017).
  23. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  24. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat. Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  25. Fraley, C., Raftery, A. E. MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis. J. Classif. 16 (2), 297-306 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

130Epigenomicsimmunoprecipitationmicrococcal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved