מדידת In Vivo שינויים עצביים חוץ-תאית במהלך טבעי מתגמל בהתנהגויות של אוגרים סוריים הנשי

Summary

מאמר זה מפרט השימוש של הקלטות amperometric פוטנציאל קבוע באמצעות אלקטרודות סיב פחמן וטכנולוגיה ביוסנסור אנזימטיות כדי למדוד את שחרורו של דופמין, גלוטמט עם רזולוציה טמפורלית גבוהה במהלך טבעי מתגמל התנהגות אוגר נקבה.

Abstract

היכולת למדוד את שחרור נוירוטרנסמיטר בקנה מידה זמן מהיר מאפשר דפוסי עצבית כדי להיות מקושר התנהגויות ספציפיות או מניפולציות; כלי רב-עוצמה ב שחקרתי כבסיס מנגנונים ואת המעגלים. בעוד בטכניקה של microdialysis שימש במשך עשרות שנים כדי למדוד את analyte כמעט בכל עניין במוח, טכניקה זו מוגבל ברזולוציה הטמפורלית. לחלופין, סריקה מהירה וולטמטריה הוא באופן מדויק וגם רגיש ביותר; עם זאת, מאחר שיטה טכנית קשה זו מסתמך על electroactivity של analyte עניין, האפשרות לזהות חומרים nonelectroactive (למשל, את גלוטמט נוירוטרנסמיטר) חוסלה. מאמר זה מפרט את השימוש של מערכת הובלת המשלבת פוטנציאל קבוע amperometry biosensing אנזימטיות כדי למדוד נוירוטרנסמיטורים הן electroactive והן nonelectroactive עם דיוק טמפורלית. הזיווג של אלה שתי טכניקות חזק מאפשר לשקילת טוניק והן עצבית phasic בקלות יחסית, וכן מאפשרת הקלטה של נוירוטרנסמיטרים מרובים בו-זמנית. המטרה של כתב יד זה היא להדגים את התהליך של מדידה דופמין, גלוטמט עצבית ויוו השימוש בהתנהגות מתגמלת באופן טבעי (כלומר, התנהגות מינית) באוגרים הנקבה, עם המטרה הסופית של הצגת הישימות הטכנית של זה וזמינותו לבחינת אחרים התנהגויות, פרדיגמות ניסיוני.

Introduction

היכולת למדוד את שחרור נוירוטרנסמיטר בבעלי להתנהג ער מאפשר לחוקרים לקשר התנהגויות ספציפיות עם יכולות דפוסי עצבית-a כלי רב עוצמה כדי לחקור מנגנונים ואת המעגלים שבבסיס שניהם טבעי והתנהגויות operant בזמן אמת. מבחינה היסטורית, microdialysis כבר מועסקים למדוד חומרים גם תגובתי חשמלית וגם nonreactive ב חצרו חוץ-תאי המוח¹. שיטה זו משתמשת זרימה רצופה של תמיסה מימית הקומפוזיציה יוניים דומה לנוזל חוץ-תאית, באמצעות בדיקה microdialysis מורכב של מוט קטן עם טיפ עשוי קרום הולופייבר semipermeable². לאחר ההוספה של המכשיר, נוירוטרנסמיטרים או אחרים analytes עניין יכול לחצות את ממברנה חדירה למחצה על ידי דיפוזיה פסיבית לפני נאסף במרווחי זמן לצורך ניתוח מאוחר יותר על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (hplc, קורס), כימיה אנליטית טכניקה בדרך כלל מנוצל כדי להפריד, לזהות, ולכמת את הרכיבים השונים תערובת הטרוגנית³.

למרות microdialysis היא טכניקה רגיש יכול לשמש כדי למדוד את analyte כמעט לכל עניין, הפתרון הזמני הוא נמוך, עם שיעורי דגימה מקסימלית הסדר דקות ועד עשרות דקות^1,2. ההמצאה של סריקה מהירה וולטמטריה (FSCV), טכניקה המסתמך על הפוטנציאל חמצון-חיזור של מינים electroactive, יכול להבהיר ליד ריכוזי מיידית analyte של עניין נוזל חוץ-תאי. בקצרה (ראה רובינסון. et al. ⁴ עבור סקירה מקיפה), אלקטרודה מוחל על מעלים ומורידים את המתח אופנה גל משולש על סולם הזמן המהיר⁴. כאשר המתח בטווח הנכון, המתחם עניין שוב ושוב מחומצן, מופחתת. Oxidization וצמצום התוצאה תנועה של אלקטרונים שיוצר זרם חילופין קטן. סרוק את המחירים מתקיים בסולם פחות משנייה עם oxidization וצמצום של תרכובות המתרחשים במיקרו. על ידי הפחתה של הרקע הנוכחי שנוצרו על ידי המכשיר הנוכחי וכתוצאה מכך אחד ניתן ליצור מתח לעומת ייחודית לכל המתחם הנוכחי עלילה. מאז ציר הזמן של תנודות מתח ידוע, נתונים אלה ניתן לחשב מגרש של הזרם כפונקציה של הזמן. לפיכך, הריכוזים היחסיים של המתחם עשוי להיקבע כל עוד מספר האלקטרונים מועברים ב כל חמצון, הפחתת התגובה ידועה⁴.

זו ירידה לפרטים כימיים ברזולוציה הטמפורלית גבוהה הופכים FSCV טכניקה חזקה לגילוי שינוי ריכוזים כימי ויוו. עם זאת, למרות היתרונות הללו סעפת, טכניקה זו דורשת מומחיות טכנית, ציוד יקר, תוכנית ההתקנה. יתרה מזו, nonelectroactive נוירוטרנסמיטורים (למשל, גלוטמט) לא ניתן למדוד בעזרת טכניקה זו. למרבה המזל, פיתוחים טכנולוגיים בתחום של אלקטרוכימיה⁵, וכן המסחור של ההמצאות האלו, הציג גישה פשוטה יחסית כדי למדוד את הלא-electroactive נוירוטרנסמיטורים בבעלי להתנהג ער מבלי להתפשר על זמני דיוק-a טכניקה המכונה טכנולוגיית ביוסנסור אנזימטיות. שיטה זו משתמשת אנזימטי המרה של נוירוטרנסמיטר nonelectroactive עניין לתוך שני מצעים, שאחת מהן היא electroactive חמצן שמזוהה בשם הנוכחי חמצון בעל דירוג amperometric שנוצר על ידי הפוטנציאל אפלייד⁵ . הגששים ביוסנסור זמינים מסחרית (ראו איור 1) למדוד באופן סלקטיבי analytes עניין על-ידי הפחתת והשמה התרומה של interferents אנדוגני. במקרה של גלוטמט, התרומה של חומצה אסקורבית interferent (AA) נפוצות והשמה תקטן הזרם נמדד על ידי שיתוף לוקליזציה אוקסידאז AA על גבי המשטח אנזימטי פעיל של החיישן, המרת AA הלא-electroactive dihydroascorbate ומים. בנוסף, שכבה פולימר Nafion טעונים שלילית נוכח מתחת לשכבת האנזים אינו כולל תרכובות anionic אנדוגני.

הגדרת הניסוי באותו הזה ביוסנסור יכול למדוד נוירוטרנסמיטורים electroactive כמו FSCV, אבל במקום זה היא מעסיקה פוטנציאל קבוע הקלטה⁶. בניגוד המתח נדנוד המוחלת ב- FSCV, בהקלטה פוטנציאל קבוע המתח נשמרת ב חמצון-חיזור פוטנציאל analyte עניין. למרות שהוא פחות מבחינה כימית סלקטיבית יותר FSCV כמו נוירוטרנסמיטורים מרובים חמצון-חיזור אותו פוטנציאל, באזורים במוח באופן גורף להטות לכיוון אחד מוליך עצבי, הטבע מפתח הפעלה של גישה זו עולה חוסר כימית ירידה לפרטים.

היכולת למדוד גם electroactive וגם nonelectroactive עצבי במהדורה ליד בזמן אמת ולקשר אותה לאירועים התנהגותיים ספציפיים מספק הזדמנות לבחון את שחרור נוירוטרנסמיטר מתכנסים. כתב יד זה מפרט את השימוש במערכת זו לחקור עצבית דופמין והן גלוטמט בתגובה תגמול טבעי ב ער אוגרים להתנהג. מטרת מאמר זה היא לפרט את התהליך של מדידה זה שחרור נוירוטרנסמיטר במהלך התנהגות מינית אוגרים הנקבה, במטרה להפגין את ההיתכנות לבחינת אחרים התנהגויות, פרדיגמות ניסיוני.

אוגרים הם מודל אידיאלי לשימוש בהקלטות אלקטרוכימי
מבחינה היסטורית, מודלים עכברוש ועכברים יש כבר מועסקים במחקר של התנהגות מינית. מינים אלה מכרסמים לעסוק רצף copulatory דינמי, מעורבים התנהגויות שידול נקבה רבים כוללים מקפץ, יקדו האוזן נענוע לפתות את הזכר לרדוף והר בסופו של דבר את הנקבה⁷. ההרכבה על ידי הזכר (עם או בלי חדירה נרתיקית) נמשך רק כמה שניות, במהלכן הנקבה עוסקת התנהגות מינית היציבה שלה (הנקרא lordosis) גם רק שניות ספורות לפני חידוש התנהגויות שידול פעיל. דפוס זה של התנהגות, המורכב רמות גבוהות של פעילות וביניהם תקופות קצרות של התזוזה, הוא בעייתי למדידת עצבית בחיות מתנהגות. ראשית, יכולה להיות תנועה חפצים בהקלטות amperometric שאינן קשורות לפעילות עצבית. שנית, ומכניקה משויכת השחרור של הנוירוטרנסמיטרים מסוים באזורים מסוימים במוח. לדוגמה, שחרור דופמין כבר זיווג לפעילות גינקולוגיות ב סטריאטום הגבי ו הגחון^8,9, ממצא זה היוו את הבסיס למדידות microdialysis של דופמין בעקבות psychostimulant ניהול¹⁰. כי ההתנהגויות שידול נקבה-אופייני ב- most מכרסמים לערב רמות גבוהות של פעילות גינקולוגיות, מיוצגים על-ידי עיקר מבחן ההתנהגות המינית 10 דקות, זה מקשה לייחס שינויים עצבית מרכיבי התנהגות מינית מפורשת באופן קולקטיבי מעמד רק . דקות.

כדי לנתח את הפרופיל עצבית של התנהגות מינית נשית, המעבדה הזאת חיפשה זן בהם יש פעילות מינימלית גינקולוגיות המלווה התנהגות מינית. רצף copulatory אוגרים סורים (Mesocricetus אם לדייק) הינו אידיאלי עבור הקלטות עצבית עקב המחסור של התנהגויות שידול טיפוסי אצל חולדות, עכברים¹¹. כתוצאה מכך, אוגרים הנקבה להזין ולשמור על היציבה lordosis עבור למעלה מ- 9 דקות מתוך 10 דקות בדיקות הפעלה¹². עם חוסר תנועות גינקולוגיות חיצוניים באמצעות ה נקבה, ויוו ניתן להשיג הקלטות אלקטרוכימי, זה יכול להיות קשור עם רכיבים של אינטראקציות מיניות עם הזכר.

Copulatory הקרבות של אוגרים
לאחר המבוא של חיה זכר הגירוי לחדר בדיקות, הזכר יעסקו בתחילה בחקירה anogenital (AI) של הנקבה לפני הרכבה שלה (איור 2א). על מנת הזכר לטעון, הנקבה חייב להניח שהתנוחה מינית לרעיונות המכונה lordosis, שבו היא קשתות אותה בחזרה, הודף את הזנב שלה כך הזכר הרכבה יוכלו לקבל גישה הפין לנרתיק שלה. הזכר לטעון הנקבה, כשהוא לופת את אחוריו עם שתי כפות (איור 2B), ולהתחיל הדיפת בניסיון להשיג intromission הפין (איור 2C). הזכר לטעון את הנקבה (ללא ההכנסה), כמו גם intromit מספר פעמים לפני בסופו של דבר להשגת שפיכה. רצף זה של mounts ו intromissions שמוביל שפיכה הנקרא "התקף copulatory". הזכרים יהיו מספר התקפי copulatory בתוך מושב בודד.

Protocol

כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מינסוטה, הם לפי המדריך טיפול, שימוש של חיות מעבדה ¹³ .

1. חיות וניתוח תעלות

1. קבל סורית אוגרים מן הספק בעלי חיים הנפוצים כ 55 ימים של גיל-
   הערה: אף העידן של בעלי חיים משתנים עקב האילוצים של פרדיגמות שונות ניסיוני, על ההתנהגות המינית חשוב לקבל חיות בגרו כל בערך באותו הגיל.
2. חיות הבית מבוקר טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס) וסביבה תאורה (14 h אור ואחריו כהה עם אורות ב- 13:00 h 10 h), עם מים ואוכל זמינים ad libitum למעט בתקופות של בדיקה ניסויית.
   הערה: מאז אוגרים עונתיות להתרבות, זה 14:10 מחזור/כהה מחקה את תנאי גידול טבעי שלהם.
3. לאחר שבוע אחד להתאקלמות למעבדה, לבצע ovariectomies דו-צדדיים aseptic ואת cannulations stereotaxic תוך-גולגולתי בהרדמה כללית (למשל, פנטוברביטל), ולפקח המתאים כמוסד שאושרו על-ידי כאבים לאחר הניתוח וטיפול אנטיביוטי כאמור תיאר ^{14 , 15}-
   הערה: לצורך המחקר של התנהגות מינית, ovariectomies נחוצים להסיר את המקור העיקרי אנדוגני של הורמונים מיניים כך החיות יכולות להתעורר בצורה אחידה כדי פתיחות מינית עם הורמון אקסוגני על פי ציר הזמן ניסיוני.
   1. להשתלה בדיקה וכולינרגיים והן glutamatergic, stereotaxically שתל מדריך גליליים (בקוטר 0.7 מ מ; איור 3) לשטח של הריבית (למשל, המעבדה הזאת לפלח את צודקת גרעין האקומבנס (NAc)) כמתואר בפירוט stepwise במקום ¹⁵.
      הערה: למרות הנתונים המוצגים של חיישן בודד הקלטות של רגש גלוטמט או דופמין אחד לכל בעל חיים, מערכת זו מאפשרת הקלטה בו זמנית של עד 4 חיישנים חיים בודד; לפיכך, כגון 1-4 יכול להיות מושתלים בהתאם להזמנה עיצוב ניסיוני ותוצאות.
      1. לקבוע את נקודות הציון של השתל של האזור עניין שימוש על האטלס stereotaxic (למשל, המוח אוגר הזהב מאת מורין & עץ), הוא משאיר בראש כי החיישן מרחיב 1 מ מ מתחת הצינורית לתוך רקמת המוח.
   2. לאחר בצינורית הוא הוריד stereotaxically למיקום הגבי הגחוני / הרצוי, יצויינו זה הגולגולת באמצעות כובע בנוי שיניים אקרילי, מאובטח עם ברגים עצם פלדת אל-חלד וראש פלסטיק הר ( איור 3 ; ראה ¹⁵ לפרטים נוספים).
   3. לבדיקה סיבי פחמן, להוסיף על אלקטרודה הפניה (350 μm קוטר, באורך כולל של 7.5 מ"מ) לתוך האונה contralateral.
      הערה: מיקום ספציפי או מרחק הצינורית לא נדרש; אלקטרודות ייחוס אפשר למקם בכל מקום בחצי הכדור contralateral נוח.

2. ביוסנסור ובדיקות סיב פחמן

1. לאחר שבוע אחד של התאוששות מהניתוח, לנהל את משטר לקרקע הורמון לזירוז פתיחות מינית.
   1. להזריק subcutaneously 10 µg של אסטרדיול בנזואט ב 0.1 מ של שמן זרעי כותנה (ש), כ 48 שעות ו- 24 שעןת לפני ההתנהגות המינית בדיקות, כדי לעודד פתיחות מינית כלפי גברים ¹¹.
   2. 500 להזריק µg של פרוגסטרון ב 0.1 מ של שמן כותנה, ספורטינג, 4 שעות לפני כניסתה של הזכר כדי לעודד פתיחות מינית ¹¹.
2. לבדוק כל החיות בתחילת השלב כהה של המחזור היומי שלהם, כמו גם התנהגויות חברתיות של מכרסמים רלבנטי תחת אור לבן, אור אדום בדיקות תנאי ^{16 , 17 , 18}.
3. ביוסנסור אנזימטי גלוטמט בדיקה, לכייל את החיישנים במבחנה ( איור 4) לפני השימוש כפי שתואר לעיל ^{15 , 19}.
   1. לעשות הכיול פתרונות טרי ביום של בדיקות 20 מ ל זכוכית צנטריפוגה צינורות. עבור הפתרון analyte, יתמוסס 7.4 מ ג של חומצה גלוטמית-L 10 מ"ל של אולטרה טהור H ₂ O על ידי היפוך בעדינות את הצינור. להפוך את הפתרון interferent על ידי המסת מ"ג 176.1 AA ב 10 מ"ל של אולטרה טהור H ₂ O.
   2. להגדיר עבור הכיול על-ידי הצבת של פגים על בסיס עמדה טבעת מעבדה בסיסית. מקום 20-mL גביע המעטפת על גבי פגים, מלחציים במקום באמצעות מלחציים 2 חריצים בינוני. בר
      1. הוסף למהומה מגנטי, 20 מ"ל של 100 מ מ פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) לתוך כשהספל המעטפת. להתחבר כשהספל במקטורן באמבט מים במחזור לחמם את הפתרון מאגר 37 מעלות צלזיוס.
         הערה: הכיול ביוסנסור אנזימטי חייב להתבצע בטמפרטורת הגוף מאז פעילות אנזימטי מושפע על ידי טמפרטורה.
   3. למקם המחזיק כיול חיישן על גבי כשהספל במקטורן והגדר של מגבר 4 ערוצים כיול קדם עליון, המאבטחים במקום באמצעות מלחציים מאונכים. לחבר מגבר קדם את הנתונים מיזוג ורכישה התקן כיול רשומות נתונים.
   4. לבדוק את הרגישות של כל ביוסנסור אנזימטי גלוטמט (או אחרים analytes עניין עבור אחרים זמינים מסחרית ביוסנסור הגששים למשל, גלוקוז) לפני ההקלטה ניסיוני על-ידי הצבת המכשיר לתוך המחזיק כיול על גבי גביע במקטורן, השוקע על חלל חישה, חלק מן ההפניה כסף כלוריד (AgCl). חוטים של בופר.
      1. לפני שתחבר כל חיישן (עד 4) נבדק ליציאה במחשב מגבר 4 ערוצים כיול קדם, ליזום הקלטות חדשות על ממשק המחשב ניצול רכישה להורדה חינם תוכנה. לאפשר את החיישנים. להגיע אל בסיס יציב.
   5. להתחיל להוסיף את הזריקות analyte כאשר החיישן הגיעו בסיס יציב. השתמש החור המחזיק כיול להכיר טיפ פיפטה בופר. השתמש בכלי ביאור מפתח מהירה בתוכנת הצריבה כדי להוסיף ביאורים כשמתבצע זריקה. ΜL
      1. לעשות 10 מיקרומטר תוספות של גלוטמט ב-40 pipetting של הפתרון analyte לתוך בופר. לחכות חיישן להתייצב בין תוספות. להוסיף 3 זריקות של analyte פתרון לפני הוספת זריקה אחת מ- AA interferent פתרון (50 μL הזרקת נפח לשינוי μM 250 בריכוז).
         הערה: הכיול מאפשר המרה של השינויים בתוך האות amperometric (לראות במהלך ההקלטה ניסיוני אנזימטי בשלב 2.12) לשינויים בריכוז גלוטמט, אם רצונך בכך. ראה התייחסות ¹⁵ stepwise מנהלת הדרכה. הגששים וכולינרגיים בשימוש על ידי המעבדה הזאת מכוילים במהלך תהליך הייצור על ידי ספק מסחרי. חייב להיות מכויל גלוטמט הגששים בזמנו של שימוש כמו את רגישותם יכול להקטין לאורך זמן כמו הרכיבים אנזימטי לבזות ¹⁹. כי סיב פחמן אלקטרודות אינם עוברים השפלות, הכיול שבוצעה על ידי החברה לפני משלוח מספיקה לאורך כמו t. הנה הסבירות מוגברת של פגיעה של סיבי פחמן דק (קוטר 350 μm) דרך טיפול נוספת.
4. קו לחדר הבדיקה עם מצעים שנלקחו החיה ' כלוב הביתה s.
   הערה: פעולה זו מגדילה את הנקבה ' קאמרית s היכרות עם הבדיקה, כמו גם חושף את הזכר מגרה מינית רמזים ההזדווגות חוש הריח את זה. הופצו על ידי הנקבה בתגובה לטיפול אסטרדיול.
5. בקלילות עזים ומתנגד החיות לפני הכניסה של המכשיר באמצעות איזופלוריין או אחר נדיף הרדמה בחדר אינדוקציה-
6. להסיר את obdurator ריטלין הצינורית מדריך, ולהוסיף סיבי פחמן האלקטרודה או בדיקה אנזימטי דרך הפיר מדריך.
7. לאחר ההוספה בדיקה, למקם את החיה בבית הבליעה בדיקות.
   הערה: זו המעבדה משתמשת אקווריום זכוכית 10-גל (24.5 x 48.9 x 29.4 ס מ), אך גם יכול להיות מועסק עגול לשכות שווה באזור.
8. להתחיל להקליט את האות amperometric ווידאו נעול זמן תוכנה זמינים מסחרית, תיאר בפירוט במקום ¹⁵.
9. לחבר את החיישן למערכת הקלטה: potentiostat באמצעות כבל מוגן חשמלית של סיבוב חשמלי. לייצב את חיבור חיישן בכך שהתבטלה קובץ מצורף pin אל ראש ההר. לחזק את החיבור באמצעות מעבדה הסרט במידת הצורך.
   הערה: מחבר מותאם אישית יש צורך לצרף סיב פחמן האלקטרודה והן התייחסות אלקטרודה potentiostat, ואילו החיישנים גלוטמט אנזימטי ניתן לחבר ישירות potentiostat.
10. לאפשר את החיישן equilibrate במוח לפני בדיקה ניסויית.
    הערה: פעמים Equilibration משתנות בהתאם החיישן הקלטה (למשל חיישנים אנזימטי דורשות equilibration h 2-4, בעוד סיבי פחמן אלקטרודות רק דורשים בערך 30 דקות). אם שני סוגי חיישנים מושתלים, equilibrate בפעם חיישן אנזימטי יותר.
11. לאחר equilibration חיישן, להציג את זכר הגירוי לחדר הבדיקה.
12. בעקבות ההר הראשון עם הפין ההכנסה (הנקרא intromission) על ידי הזכר גירוי, להמשיך הקלטה ' מזערי ' 10-30 נוספים, בהתאם למטרות ניסיוני.
13. בעקבות בדיקה התנהגותית, נתק את הנקבה ' s חיישן.
14. להסיר שני אוגרים לחדר הבדיקה. הסר את המצעים. ולנקות את התא באמצעות אתנול 70%-
    הערה: עקב קצר equilibration נדרש עבור הקלטות סיבי פחמן, צעדים 2.3-2.14 שיכול לחזור לבדיקת חיות מרובים באותו יום. לעומת זאת, מכיוון החיישנים אנזימטי דורשים בערך 4 שעות של equilibration, מבחן בעל חיים אחד בלבד ליום להגביל וריאציה בין נושא אפשרי עקב הבדלים בעלי החיים ' סדר היום בזמן בדיקות.

3. הקרבה זלוף

1. עמוקות בתום תקופת הבדיקה, עזים ומתנגד הנבחן נקבה עם סוכן euthanizing (למשל, המעבדה הזאת משתמשת זריקה בקרום הבטן של פניטואין 0.2 מ"ל פתרון פנטוברביטל) .
2. Transcardially perfuse החיה עם 25 מ מ, PBS, pH 7.6, כדי להסיר את כל הדם במחזור, ואחריו אובססיה 20 דקות באמצעות 4% paraformaldehyde-PBS.
3. מסירים את המוח ואז postfix ב ~ 30 מ של הפתרון 4% paraformaldehyde 50-mL חרוט צינור לילה.
   1. חנות המוח ב- 10% סוכרוז-PBS פתרון עד מוכן למקטע טורי.
      הערה: המוח ניתן לאחסן כדי 2 שבועות, בשינויים פתרון סוכרוז שבועי כדי למנוע את פוטנציאל הצמיחה של מזהמים.
4. טורי סעיף המוח ב- 40 µm שפורס באזור מושתל עם גם מיקרוטום הקפאה או cryostat כפי שצוין בעבר תיאר ¹⁹.
5. הר פרוסות באופן סדרתי בשקופיות מצופה דבק זמינים מסחרית (או לראות ²⁰ לעשות). אפשר להתייבש, לפחות ללילה.
6. מכתים את השקופיות עם צבע cresyl, ויולט, ברור, ותיאר coverslip כאמור ²⁰-
7. תמונה השקופיות באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר כדי לאשר את המיקום האנטומי של החיישן.

4. Coding התנהגותית

1. תצוגה ומפרשות את קטעי וידאו באמצעות תוכנה חופשית להורדה מסחרית (ראו טבלה של חומרים) בהילוך איטי כדי בדיוק התנהגויות קוד נעילת הזמן לאות amperometric.
   הערה: כדי להשתמש בקוד MATLAB בניתוח (ראה להלן-), ביאורים את להתחיל ואת סופו של כל אחד הנקבה ' s וזכר ' s התנהגויות.
   1. להוסיף הערות startLordosis במסגרת כאשר הנקבה יוזם dorsoflexion של אותה בחזרה, פגמים את הזנב שלה כלפי מעלה. ביאור endLordosis כאשר הנקבה מסתיימת תנוחה זו, אשר מתרחשת לעתים קרובות כאשר הנקבה יכולה למיקום אחר בחדר הבדיקות.
   2. ביאור startAI כאשר הנקבה ביציבה lordosis הזכר מעביר את האף שלו כלפי הנקבה ' באזור anogenital s, שבו מרחרח, ליקוק או מזמוז של אזור הפרינאום שלה עלולה להתרחש. ביאור endAI כאשר הזכר מסיר חוטמו ומקרבה הנקבה ' באזור anogenital s.
   3. ביאור startMount כאשר הזכר מתקרב ומניח forepaws שלו על הנקבה בתנוחה הרכבה, משנה הכיוון של הניסיון הר (למשל, בצד, עכוז).
   4. ביאור startIntromission בעת הדיפת מוצלחת משיג גישה הפין הגברי הנטען הנקבה ' הנרתיק s.
      הערה: intromission היא להבחין בהתנהגותו הנטען בדחיפה זה מתרחש לפני intromission, הזכר בעליל מושך את גפיו העליונות כלפי גופו, מיוערת הירכיים קדימה, תלתלים הזנב שלו כלפי מעלה, המציין חדירה (ראה < מחלקה חזקה = "xfig" > איור 4 C).
      1. בעת הצורך, ביאורים שפיכה.
         הערה: בסוף הקרב ההזדווגות, בשילוב עם intromission מוצלחת הזכר שפיכה. אף אחד אינו מסוגל לדמיין הפליטה בפועל, אוגרים זכר יש מאפיין דורך תנועה עם הרגליים האחוריות שלהם במהלך intromission ²¹, ובכך להוסיף ביאורים עצירת השפיכה בעת ההתרחשות של תנועת הרגל.
   5. ביאור endIntromission ו- endMount בו זמנית במסגרת כאשר הזכר הסיר שלו שתי כפות הקדמי ויש לכן, בלי קשר עם הנקבה. עקב חוסר בתדירות גבוהה כדי להמחיש פרישתו, בו זמנית קוד התנהגויות שני כדי לאפשר את העקביות והמהימנות מעבר להזדווגות התקפי.
      הערה: התקף החיזור אחרי שפיכה מוצלח או כאשר הנקבה שובר היציבה lordosis בעקבות אחד לפחות הר-

5. ניתוח נתונים לדוגמה

הערה: השימוש של סיב פחמן פוטנציאל קבוע והקלטות אנזימטי של דופמיןגלוטמט nd, בהתאמה, מאפשר היכולת למדוד טוניק והן phasic דפוסי שחרור אלקטרוכימי. המעבדה הזאת משתמש במערכת מסחר חינם, ברכישת והקליט תוכנה להקליט, להמיר אותות אנלוגי לדיגיטלי (הטיה 0.600 V, קצב הדגימה = 1 הרץ).

1. תיאור של פרוטוקול ניתוח נתונים לדוגמה
   1. למרות שניתן להשתמש בתוכניות אחרות, לכמת את טוניק ושינויים phasic (ארעי) בתוך האות אלקטרוכימי מוקלט באמצעות MATLAB.
      1. עבור הנתונים שהוצגו, לחשב את האות טוניק באמצעות מסנן ממוצע נע 50 נקודות. ייצוג מנורמל ארעי בלבד של האות מחושב על-ידי חיסור טוניק האיתות הנתונים הגולמיים. בשעת זיהוי פסגות phasic, קיימות אפשרויות אלגוריתמית שונות (למשל, תיוג פסגות כשינויים בתוך האות יותר מאשר 1 SD מעל הממוצע).
      2. לזהות את מיקומם של אלה פסגות, קרי, maxima מקומיים, האות מנורמל באמצעות הפונקציה של MATLAB peakfinder משרעת השיא המינימליות להגדיר את שורש ממוצע הריבועים של האות. המיקום של פסגות זוהה האות מנורמל שימש כדי לחלץ את משרעת השיא לכל. היכולת לזהות פסגות מאפשר זיהוי כל הזמן נעול התנהגויות עשוי להיות בד בבד עם, או נהיגה השיא היחסי עצבית תחת חקירה.
   2. קטע הנתונים מעובדים לפי הביאורים התנהגותית (ראה שלב 3); סטודנט ' s t-מבחן שימש כדי להעריך את ההבדלים בין רמת טוניק עצבי, המופע של תופעות מעבר, את משרעת של תופעות מעבר במהלך lordosis לגבי מראש ההזדווגות לעומת lordosis במהלך ההזדווגות התקפי. כדי למדוד שינויים טוניק דפוסים של שחרור אלקטרוכימי, נקודות הנתונים המתרחשים במהלך התנוחה Lordosis ישירות לפני התקף ההזדווגות (קרי, lordosis לגבי ההזדווגות מראש), לעומת נקודות הנתונים במהלך התקף ההזדווגות הפעלה באמצעות t-בדיקה של
2. הכנת נתונים גולמיים עבור פרוטוקול ניתוח הנתונים המתוארים
   הערה: כאמור, למרות תוכניות או ניתוחים אחרים עשוי להיות לא פחות אפשרויות קיימא, על מנת להשתמש בקוד MATLAB המתוארים לעיל, הנתונים הגולמיים חייב להיות מוכן ב בדרך הבאה:
   1. לייצא את הקבצים ביאור ומתח. כדי לעשות זאת, מתחת ' קובץ ' בכרטיסיה, בחר ' ייצוא ' לתפקד ובחר ' ביאורים ' טאב כדי להציל את הביאורים. תחת ' קובץ ' בכרטיסיה, בחר ' ייצוא ' לתפקד ובחרו " TSV ' tab כדי לשמור את המידות מתח TSV סיומת קובץ.
   2. לפתוח כל קובץ עם תוכנית גיליון אלקטרוני ולשמור ככל ' xls/xlsx ' כדי להפוך את הקבצים התואמים ל- MATLAB-
      : הערה ' ביאור ' קובץ, יש נוספת בביאורי זה עליך באופן ידני הוסיף שלאחר ייצוא בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי להכתיב את להתחיל ואת הסוף של שנינו ההזדווגות מראש לגבי lordosis (מבואר כמו PreMBlordorsis ) ו לתחרות ההזדווגות כך נקודות זמן אלה ניתן ישירות להשוות כאמור בשלב 5.1.2.
   3. ביאור תחילת ההזדווגות מראש דעתך lordosis (startPreMBlordosis) בו זמנית כמו התנהגות lordosis מתחיל (startLordosis) גם זה כולל התנהגות של הר, גם בתחילת חדש ההזדווגות דעתך אם הנקבה נשאר בתנוחה lordosis.
   4. ביאור סוף lordosis ההזדווגות מראש דעתך (endPreMBlordosis) הראשון לטעון מתחיל.
   5. ביאור תחילת התקף ההזדווגות (startMB) בו זמנית של endPreMBlordosis, כמו זה מסמל את תחילת התקף ההזדווגות.
   6. ביאור בסוף התקף ההזדווגות (endMB) בסוף או הר הכולל של שפיכה (ראה שלב 4.1.4.1), או בעקבות הנקבה ' s סיום של היציבה lordosis (endLordosis).

תוצאות

שימוש אלקטרוכימי והתנהגותית קידוד המתודולוגיה המתוארת לעיל, המעבדה הזאת החלה לאפיין טוניק והן תנודות phasic דופמין והן גלוטמט במהלך ויוו הקלטות של התנהגות מינית. בשל אופן מדויק חנותם מתודולוגיה זו, ניתן לאפיין בצורה מדויקת יותר עצבית במהלך ההתנהגות המינית; כמו גם ליי?...

Discussion

למרות פשוטה יחסית, בעיות יכול להיווצר בעת העסקת בטכניקה זו. ראשית, הצבת stereotaxic הגששים. חייב להיות מדויק: בניגוד microdialysis זה דוגמאות ברדיוס רחב יותר של חצרו חוץ-תאית סביב החללית, טכניקה זו מאפשרת רק המידה של נוירוטרנסמיטר במגע ישיר עם המכשיר. שנית, במקרה של ההקלטה סיבי פחמן, עקב רוחב קטן של סיבי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.