יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

Summary

התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.

Abstract

תאים להציג מורפולוגיות שונות ויחסים האנטומי מורכב. כיצד תאים אינטראקציה עם שכניהם? האינטראקציות נבדלים בין סוגי תאים או אפילו בתוך סוג מסוים? אילו סוגים של חוקים מרחבי הם בצע? תשובות כאלה שאלות עקרוניות ויוו יש כבר הקשו עד כה על ידי חוסר כלים עבור תיוג תא בודד ברזולוציה גבוהה. . הנה, פרוטוקול מפורט היעד תאים בודדים עם טכניקה ססגוניות FlpOut (MCFO) הינו מסופק. שיטה זו מתבססת על שלושה אחרת מתויג עיתונאים (HA, דגל ו- V5) תחת שליטה UAS שנשמרים שקט מאת בסיים תעתיק ולצדו והשפלתם שני אתרים (והשפלתם-עצור-והשפלתם). דופק הלם החום המניע את הביטוי חום הנוצרות על-ידי הלם Flp recombinase, אשר באופן אקראי מסירה את הקלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם תאים בודדים: ביטוי מתרחשת רק בתאים המבטאים גם מנהל התקן GAL4. זה מוביל מערך של תאים בצבעים שונים של סוג תא נתון המאפשר את החזיית תא בודד מורפולוגיות ברזולוציה גבוהה. כדוגמה, הטכניקה MCFO יכול להיות משולב עם נהגים GAL4 גליה ספציפיים כדי להמחיש את מורפולוגיות מסוגי המשנה גליה שונים במוח דרוזופילה למבוגרים.

Introduction

עכשיו, דונלד, האוכלוסייה הלא-דופאמינרגיים של מערכת העצבים (NS), זמן האמינו לספק מסגרת סטטי של נוירונים, לכן לא נחקרו בפירוט. עם זאת, אצל בני אדם, עכשיו, דונלד מהווים את הרוב המכריע של תאים שריכזה (~ 90%), מחולקים למספר קטגוריות שונות, כולל האסטרוציטים, oligodendrocytes להפוך, מיקרוגלייה תאי שוואן. דרוזופילה, עכשיו, דונלד מהווים כ- 10% של תאים שריכזה. מסקרן, מורפולוגיות והפונקציות שלהם דומים להפליא אלה שנמצאו בעלי חוליות^1,2. מורפולוגיות שלהם כוללים את מחסום הדם - מוח (BBB) ויוצרים epithelia, ensheathing ותאים אסטרוציט דמוי.

מערכת העצבים המרכזית (CNS) דרוזופילה מורכב המבנים העיקריים הבאים: קליפת אזורים המכילים את הגופות תאים עצביים; neuropils זה הנמל קשרים סינפטיים; ספינלי האקסון קטנים וגדולים המחברים את neuropiles שונים; העצבים ההיקפיים המחוברים אברי החישה והשרירים עם מערכת העצבים (איור 1). עכשיו, דונלד נמצאים המשויכים כל מבנים אנטומיים אלה: קליפת עכשיו, דונלד (CG) באזורים קורטיקליים, אסטרוציט כמו עכשיו, דונלד (נועה) ו- ensheathing עכשיו, דונלד (למשל) באזורים neuropile, ensheathing עכשיו, דונלד קשורים גם עם ספינלי האקסון המרכזית, ההיקפית העצבים (EGN), ולבסוף, שני גיליון עכשיו, דונלד, עכשיו, דונלד perineurial (עמוד) subperineurial (SPG), אשר ביחד יוצרים שכבה רציפה שמכסה את NS כולו (איור 2).

מחקרים קודמים הראו כי עכשיו, דונלד תפקיד חשוב בהתפתחות NS; הם לפקח דופאמינרגיים מספרים על ידי מגיב מערכתית במחזור דמוי אינסולין הפפטידים, לספק תמיכה עם מחלות את הנוירונים, כגון המעבורת לקטט אסטרוציט-נוירון, ולחסל נוירונים גוססים על ידי phagocytosis^{3,4 , 5 , 6}. שריכזה בוגרת, עכשיו, דונלד לשמור על BBB, תופסים נוירוטרנסמיטורים לשמור על הומאוסטזיס יוניים, לשמש התאים החיסוניים הגדולות המחלקה שכן המקרופאגים לא יכול לפרוץ BBB, לווסת את פעילות סינפטית, כמו גם התנהגות בעלי חיים^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

אם תתי סוגים שונים גליה לבצע פונקציות מיוחדות נותרת שאלה פתוחה חשוב. עם זאת, ניתוח הגנום כולו שיטתית של עכשיו, דונלד, במיוחד אצל אדם בוגר, יש כבר הקשו על ידי חוסר המתאימה לכלים שלהם מניפולציה גנטית. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת אפיון תא צורות ללמוד אינטראקציות מורכבות תא תא יעיל וקל. טכניקה זו הוחל לאפיין המורפולוגיה של גליה תתי-סוגים שונים במוח דרוזופילה למבוגרים, אבל, בהתאם הנהג GAL4 ספציפי בשימוש, זה יכול להיות מותאם ללמוד נוירונים^12,13 , כל סוג של תאים בזה, באופן עקרוני כל רקמות בשלבים התפתחותיים כלשהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-הכנת זבובים לניסויים ססגוניות FlpOut (MCFO)

הערה: MCFO הטכניקה מתייחס גירסה שונה של קלטת בתיווך Flp עצור שנקרא הכריתה (FlpOut). זבובים MCFO הטרנסגניים לשאת מקדם הלם חום (hsp)-Flp recombinase ובקרת כתבים שונים תחת UAS. כל עיתונאי מורכב שדרה משותף של myristoylated (myr) ירוק סופר תיקיה פלורסנט חלבון (sfGFP), בעוד איזה 10 עותקים של תג epitope (למשל., HA, דגל או V5) נוספו. החלבונים הלא-פלורסנט וכתוצאה מכך נקראים " מפלצת הספגטי GFPs " (smGFPs) ¹⁴, ניתן להבחין באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד התגים השונים epitope.

1. קרוס טס עם הקלטת MCFO, את hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) לקווי המתאים גליה GAL4 מנהל ההתקן (ראה טבלה של חומרים) .
   1. Hsp פעיל כבר 25 ° c, כמה תאים עשוי לעבור רקומבינציה המוביל תיוג לא ספציפי, להגדיר חוצה ב 18 ° C כדי להימנע leakiness של המערכת. המתן כ- 20 ימים ב 18 ° C כדי להשיג את הדור F1. לאחר החום לחשמל (ראה שלב 2), לשמור על זבובים 25 ° c ( איור 3).

2. מחממים הלם

הערה: בהתאם הכניסה לאתר, היעילות של hsp-Flp עשויים להיות שונים; לכן, הזמן הלם חום אופטימלי חייב להיות מותאם. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש MCFO מניה לטוס בו הוכנס hsp-Flp על כרומוזום ה-X (ראה טבלה של חומרים).

1. העברה הוא צאצא של הצלב בשלב 1.1 (F1 דור זבובים, בן 3-4 ימים) לתוך חדש מבחנות שמכילות אוכל וחימום לזעזע אותם ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
   הערה: זבובים צעירים (בן 1-2 ימים) רגישים מאוד הלם חום. לחכות 1 או 2 ימים לפני ביצוע ההלם חום על מנת להפחית את שיעור התמותה הנגרמת על ידי הטיפול. שימוש של הדור F1 זבובים כפקד, ללא זעזועים חום.
2. במהלך הלם חום, לשמור על זבובים בקבוקונים נורמלי עם אוכל על מנת להקטין את שיעור התמותה מפגינות. להכניס נקבות וזכרים נפרד בקבוקונים.
3. הקפידו לטבול את המבחנה כולו במים כדי להבטיח הלם חום הומוגניות. השתמש הלם 5-8 דקות כנקודת התחלה מתאימים עבור תיוג דלילה של עכשיו, דונלד תאים עם קווים רבים של הנהג GAL4; משך הלם חייב להיות אופטימיזציה עבור כל מנהל התקן וניסוי (ארוכה או קצרה יותר חום הלם פעמים עשוי להיות נחוץ).
4. לאחר הלם חום, להניח את הבקבוקונים אופקית על הספסל לכמה דקות כדי לאפשר את הזבובים להתאושש מההלם חום.
   הערה: אין צורך לשנות את הבקבוקונים.
5. לשמור על הזבובים 25 ° c ומנתחים (ראה שלב 3 ו- 4) אותם ימים 2 או יותר לאחר ההלם חום לביטוי כתב אופטימלית.

3. ניתוח והכנה פתרונות

1. היום של הקרע, להכין פתרון מקבע טריים ב 200 µL המבחנות על ידי ערבוב µL 180 S2 תא תרבות בינוני עם 20 µL של 20% paraformaldehyde (PFA) כדי להשיג פתרון מחברים 2%. לשמור על הפתרון מקבע על הקרח לפני ובמהלך את הקרע.
   התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות.
   הערה: מערבבים µL 160 S2 תא תרבות בינוני עם 40 µL של 20% paraformaldehyde (PFA) בצינור PCR 200 µL כדי להכין פתרון PFA 4% במקום פתרון 2%-
2. להשתמש שפופרת אחת PCR לכל גנוטיפ עם מקסימום של 8-10 המוח למחזור לקבלת תוצאות מיטביות, מכתימים.
3. להכין המוח למבוגרים שטיפה פתרון: 0.5% אלבומין שור, 0.5% X-100 Triton ב- PBS.
   הערה: בהתאם ההכתמה, פתרון המכיל 1% טריטון X-100 עשוי להיות נחוץ. ריכוז גבוה יותר של טריטון X-100 מגביר את החדירה של הנוגדן לתוך הרקמה, זה הכרחי לאזורים הכתם שקר עמוק בתוך הרקמה (למשל, סינפטית אזורים במוח דרוזופילה למבוגרים).
4. להכין את הפתרון חסימה: סרום עז רגיל 3% 3% חמור נורמלית בסרום, 0.5% X-100 Triton ב- PBS.
5. המוח למבוגרים שטיפה פתרון והפתרון חסימה שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
6. לשים צלחת זכוכית בארות דיכאון עמוק על הקרח ומלא כל טוב עם הפתרונות הבאים: אחד עם 70% אתנול, אחד עם PBS, ואחד S2 תא תרבות בינונית.

4. ניתוח מוחי למבוגרים

1. מקם 3 ס לנתח מאכל על הבמה של stereomicroscope ולמלא אותו קר S2 תא תרבות בינוני. לנהל את כל והניתוחים במדיום הזה כדי להבטיח הרקמה יישאר בריא במהלך ההליך לנתיחה.
   הערה: תבשיל ויבתר רצוף מספר מילימטרים של סיליקון שחור אשר מספקת קונטרסט רקע טובה (בתמונות) ושימוש לשמר את המלקחיים בזמן.
2. עזים ומתנגד הזבובים של גנוטיפ הרצוי עם CO ₂.
3. עם מלקחיים, לתפוס הזבוב על ידי הכנפיים, לשטוף אותה אתנול 70% קר ב-30 s, ואז עם PBS קר ב-30 נוספים ס
4. להעביר לטוס לתוך טוב הדיכאון העמוק הממולא S2 תא תרבות בינונית.
5. חוזר את ההליך עבור כל הזבובים של גנוטיפ באותה ולתחזק אותם קר S2 תא תרבות בינוני עד לנתיחה, אשר תשמר את הרקמה.
   הערה: עזים ומתנגד רק המספר של זבובים יכולים ניסויים תוך פרק זמן של-30 דקות זמן דגירה פעמים ב S2 תא תרבות בינוני עלול לגרום נזק לרקמת.
6. לתפוס הזבוב עם מלקחיים ויציפו, תחת stereomicroscope, הזבוב במדיום תרבות של S2 תא.
7. לנתק את הראש משאר חלקי הגוף. למחוק את הגוף ולשמור את הראש מתחת למים S2 תא תרבות בינוני. . זה מאוד חשוב לי להחזיק את הראש עם מלקחיים לכל משך הקרע. אם הראש מתחיל לצוף, זה יהיה קשה להחזיר אותו ללא פגיעה הרקמה.
8. מתחילים את הקרע על-ידי הוצאת עין אחת, בעוד אתה מחזיק את הראש עם מלקחיים אחד לפחות בכל עת. ודא כי הקצה של המלקחיים הוא מתחת הרשתית כדי למנוע פגיעה הרקמה שמתחת. למשוך את העין השנייה, מתחילים להסיר את הקוטיקולה להופעת המוח.
9. להסיר כל רקמות והכו אותי ואת לציפורן סביב המוח עד הרקמה נראה נקי. הקפד להסיר את כל הרקמה והכו אותי סביב המוח לקבלת תוצאות מיטביות, צביעת; הרקמות. אתה מוכן להיות קבוע, מוכתם.
10. לשמור על כל המוחות ביתור תוך קר S2 תא תרבות בינוני לפני העברת אותם לתוך הפתרון מחברים כדי זמן השלב קיבעון.

5. צביעת המוח למבוגרים

< ol>

להעביר את המוח מבודדים עם פיפטה P10 הפתרון PFA בטמפרטורת החדר (RT). כדי למנוע נזק לרקמות, אף פעם לא להשתמש מלקחיים להעברת המוח לאחר הקרע. לבצע את כל השלבים ב 200 המבחנות µL על nutator.

עבור כל השלבים, לפני מחיקת הפתרון הישן עם פיפטה P200, לאפשר את השכל להתיישב על החלק התחתון של הצינור. לנסות להסיר את תגובת שיקוע ללא כ רפה בעברית הרקמה. להגן על הרקמה מפני חשיפה קלה.

לתקן את המוח µL 200% 2 מחברים ב S2 תא תרבות בינוני לשעה או ב- 4% PFA במשך 30 דקות. לשמור על קיבוע פעמים זהים בין דוגמאות על מנת להגדיל הפארמצבטית.

לאחר 3 (או יותר) שוטף של 15 דקות כל אחד ב- 200 µL של המוח למבוגרים שטיפה פתרון, לחסום את הרקמות עם 200 µL של חסימת פתרון במשך 30 דקות. זמן הדגירה פעמים בחסימה פתרון אפשריות.

Incubate השכל לילה ב 4 ° C עם נוגדנים העיקרי מדולל במוח למבוגרים שטיפה פתרון בהנפח הכולל של 200 µL.
הערה: טיימס הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הנוגדן בשימוש. Incubations עוד עשוי להיות נחוץ.

1. עבור תיוג שלושה סמנים MCFO, דגירה את השכל עם אנטי-HA (שבערך), אנטי-דגל (DYKDDDDK epitope) (1: 100), ואת ראשי נוגדנים anti-V5.
2. ראשי ישירות-מצומדת נוגדנים יכול לשמש במקום השילוב הרגיל ראשי + המשני (למשל., אנטי-549 V5:DyLight (1:200)). במקרה זה, לטפל את הנוגדנים ישירות-מצומדת נוגדנים משניים.
   הערה: עבור כל גנוטיפ, שמור קצת שכל כפקדי כדי לוודא יחודיות של צביעה. לדלג הדגירה נוגדן ראשוני ולעבור ישירות אל השלב הבא.

לרחוץ את רקמות 3 פעמים עבור 1 h ב 200 µL של המוח למבוגרים שטיפה פתרון (שלב 3.3), דגירה אותם עם משני fluorophore-conjugates/ראשי ישירות-מצומדת נוגדנים מדולל במוח למבוגרים שטיפה פתרון בן לילה ב-4 ° C או במשך 4 שעות ב- RT, בהנפח הכולל של 200 µL
הערה: דוגמאות של נוגדנים המתאימים: 488 AlexaFluor (1:250), אנטי-549 V5:DyLight (1:200) ו- DyLight 647 (1: 100)-מצומדת נוגדנים.

לשטוף את המוח 3 פעמים עבור 1 h ב- 200 µL של המוח למבוגרים שטיפה פתרון, ולאחריה שטיפה סופית ב- µL 200 ל- PBS בן לילה ב 4 ° C או 1-2 h ב- RT; השלב הסופי כביסה ב- PBS מסיר עקבות של טריטון X-100, יש צורך צביעת תוצאות אופטימליות. לטעון שכל הרכבה בינוני עם סוכן אנטי-עמעום על coverslips זכוכית דקה.

6. הרכבה של המוח עבור הדמיה

1. חיתוך הדמיה מרווח לגודל המתאים באמצעות מספריים. עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כריך את מרווח הדגימה והדמיה בין שני coverslips זכוכית דקה.
   הערה: מפרידי כלי הדמיה הם דקים (0.12 מ"מ עובי) מפרידי דבק זה קלף והדבק על השקופיות coverslips או מיקרוסקופ זכוכית, המאפשר את ההרכבה של דגימות ללא דחיסה.
2. באמצעות מלקחיים, להסיר דבק אניה ממשטח אחד ולהחיל את מרווח, דבק בצד למטה, על פני השטח של coverslip זכוכית (22 מ"מ x 60 מ"מ). חלות µL 10 של הרכבה בינונית coverslip זכוכית חדשה.
3. עם P10 פיפטה, להעביר את המוח מהצינור 200 µL coverslip, ליד הירידה של הרכבה בינונית. יחד עם הרקמות, להעביר כמה PBS על מנת לשמור על המוח בפתרון.
4. עם P10 פיפטה, להעביר את המוח מהערוץ ירידת הרכבה בינונית מנסה להגביל את כמות PBS. העבר את דגימות במדיום גובר על coverslip עם מרווח הדמיה. להשתמש במדיה הרכבה מספיק כדי לכסות את הדגימה.
5. להסיר דבק אניה אחרים מן הצד העליון של מרווח ולהוסיף coverslip זכוכית על דגימות. עם קצה מלקחיים, חלים לחץ עדין על האזור דבק כדי לאטום. תמונה הרקמות נטענים באופן מיידי או לאחסן את השקופיות ב-20 ° C לניתוח בשלב מאוחר יותר.

7. תמונה רכישת

1. רכוש ערימות של תמונות פלורסצנטיות קונאפוקלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם 40 X (NA = 1.2, טבילה במי) אובייקטיבית או 63 X (NA = 1.4, שמן טבילה) המטרה (מידות פיקסלים = 1,024 x 1,024 במישור xy; המרחק בין שני מקטעים קונאפוקלית = 0.5 מיקרומטר). להתאים גלאי ורווח היסט בכל אחד מהערוצים בצורה כזאת, כי אין פיקסלים רווי ומאפסים פיקסל הם נוכח התמונות; זה מונע אובדן מידע ומבטיחה שימוש מלוא הטווח הדינמי של הגלאי.
   הערה: מאחר הדמיה תלת-ממד זמן רב, המידות יכול להיות אוטומטי על-ידי סריקה מרובים דגימות במקביל במקומות שונים. כדי למנוע אידוי עם המטרה טבילה במים, להשתמש בשמן מיוחד טבילה בינוני עם השבירה n = 1.33.
2. לעבד את הערימות קונאפוקלית עבור מאליהם ההקרנות, שינויי גוון ערוץ, וכוונון הבהירות, לעומת זאת באמצעות תוכנות ניתוח תמונה רגילה (ראה טבלה של חומרים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות ניתן להשיג באמצעות הטכניקה MCFO במוח דרוזופילה למבוגרים. איור 3 מראה סכימטי של השיטה. שלושה אחרת מתויג ממברנה עיתונאים (myr-smGFP-אה, myr-smGFP-דגל ו myr-smGFP-V5) תחת שליטה UAS נשמרים שקט מאת בסיים תעתיק ולצדו והשפלתם שני אתרים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה נוחה ויעילה ללמוד המורפולוגיה של סוגי תאים שונים בתוך רקמה עניין ברזולוציה גבוהה. עם הטכניקה MCFO, כתבים מרובים עם תגי epitope שונים משמשים בשילוב של תיוג סטוכסטי ססגוניות (איור 2). בדומה בשיטות אחרות כגון Brainbow/Flybow^15,16,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water bath	Grant	GD100
PCR tubes	Sarstedt	72.737.002
Forceps	Dumont	11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate	Corning	7223-34	Glass dissection plates
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normal goat serum	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal donkey serum	Jackson Laboratories	017-000-121
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm	Roth	H874
Stereo Microscope, Leica MZ6	Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol	Zeiss	W 2010	Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J)			Image analysis software
Multi Time Macro	Zeiss		Software for automated scanning