הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור של אחד או יותר פלזמה ו/או חלבונים תאיים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע (GSD) בתאי יונקים. כאן, אנו נדון את היתרונות ואת השיקולים של שימוש בגישות כאלה עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים.

Abstract

ההתקדמות פלורסנט מיקרוסקופ ביולוגיה של התא הם אישית בקורלציה, עם משופרת היכולת לדמיין את הסלולר אירועים מובילים לעתים קרובות כדי קפיצות דרמטי בהבנתנו כיצד תאים פונקציה. פיתוח, הזמינות של מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה במידה ניכרת האריך את הגבולות של רזולוציה אופטית מ ~ 250-20 ננומטר. ביולוגים מוגבלים יותר לתיאור אינטראקציות מולקולרית במונחים של colocalization בתוך אזור עקיפה מוגבלת, אלא זה עכשיו אפשר לדמיין את האינטראקציות דינמי של מולקולות בודדות. כאן, אנחנו חלוקה לרמות עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים פרוטוקול על ידי מיקרוסקופ הקרקע-מצב דלדול לדימות תא קבוע. אנו מספקים דוגמאות מתוך שני חלבונים ממברנה שונים, אבן יסוד של translocon רשתית תוך-פלזמית sec61β, מותאם לשפות אחרות קרום פלזמה ממותגת מתח Ca L-סוג^{2 +} ערוץ (Ca_V1.2). דנו הם פרמטרים ספציפיים מיקרוסקופ, שיטות קיבוע, מיתוג צילום מאגר ניסוח, ואת החסרונות אתגרים של עיבוד תמונה.

Introduction

תגובות איתות סלולרי לתרגם שינוי סביבות פנימיים וחיצוניים ליזום תגובה תאית. הם לווסת את כל ההיבטים של פיזיולוגיה אנושית, הגשה הקרן הורמון שחרור נוירוטרנסמיטר, פעימות הלב, חזון, הפריה, ואת התפקוד הקוגניטיבי. שיבוש cascades איתות אלה יכולות להיות השלכות חמורות בצורה של תנאים הקשורים pathophysiological כולל סרטן, פרקינסון, אלצהיימר. במשך עשורים, ביולוגי ורפואי החוקרים השתמשו בהצלחה חלבונים פלורסנט הגששים, ביולוגיים בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ כמו הכלים הראשי כדי להבין את ארגון יכולות מדויקות מאלה הסלולר אותות.

נקודות החוזק של טכניקות אופטית כגון epifluorescence, וידאו, או מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה הם שלהם רגישות, מהירות ותאימות עם תא חי הדמיה, אמנם המגבלה העיקרית שלהם רזולוציה מוגבלת עקיפה, משמעות מבנים או חלבון מתחמי קטן מ- 200-250 ננומטר לא יכול להיפתר. עם התפתחות דטרמיניסטית סופר-רזולוציה עיוני ומעשי (תאורה מיקרוסקופ (SIM²) או רזולוציה סופר סטוכסטי מובניםלמשלמיקרוסקופ דלדול פליטה מאולצת (STED¹), (למשל , photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל³), או מצב הקרקע דלדול (GSD^4,5)), רזולוציית לרוחב ו צירית במיקרוסקופ פלורסצנטיות הוארך מעבר למכשול עקיפה, על מנת של עשרות ננומטר. לכן, חוקרים עכשיו יש את היכולת לדמיין ולהבין איך חלבון הדינמיקה והארגון מתרגמת לתפקד ברמה ליד-המולקולרית ללא תחרות.

בקרקע דלדול מיקרוסקופ ואחריו החזרה בודדים מולקולה (GSDIM), או פשוט GSD כפי שהיא מכונה, עוקף את מגבלת עקיפה על-ידי הפחתת מספר בו זמנית פליטת^4,fluorophores⁵. אור לייזר באנרגיה גבוהה משמש כדי לרגש המדגם מתויג fluorophore, להפגיז אלקטרונים עם פוטונים, להגדיל את ההסתברות הם עוברים 'ספין-סלטה', הזן את שלישיה או "כהה-המדינה" מ- עירור⁴. זה יעיל מכלה את מצב הקרקע, ומכאן השם 'קרקע המדינה דלדול'. המדינה שלישיה, fluorophores פולט פוטונים, הדוגמה מופיעה דימר. עם זאת, אלה fluorophores stochastically להחזיר למצב קרקע, יכול לעבור מספר הפוטונים פולטות מעברים למצב נרגש-קרקע לפני החזרה למצב שלישיה. עם פחות fluorophores פולטות בכל זמן נתון, הנפלטים פוטון התפרצויות בודדות fluorophores להיות במרחב של חנותם ברורים ממחוז fluorophores. פרץ זה של פוטונים יכול להיות בכושר עם פונקציה לפי עקומת גאוס, centroid מחושב אשר מתאים למיקום של fluorophore עם דיוק לוקליזציה התלויים מספרי הצמצם (NA) של העדשה, אורך הגל של האור משמש עירור, ויותר חשוב, המספר של פוטונים הנפלט fluorophore. מגבלה אחת של GSD היא כי, מאז רק ערכת משנה של fluorophores פולט באופן פעיל בכל עת, אלפי תמונות יש לאסוף במשך מספר דקות כדי לבנות את מפת לוקליזציה מלאה. בזמן רכישת זמן בשילוב עם הדרישה כוח לייזר גבוהה, המשמעות GSD היא יותר מתאימה לתקן במקום דגימות בשידור חי.

מאמר זה, מתאר את הכנת דוגמאות קבועות עבור הדמיה סופר-ברזולוציה מיקרוסקופיה של הממברנה, תוך-פלזמית (ER)-תושב חלבונים (לקבלת רשימה של מתכלים הדרושים ולראות ריאגנטים טבלה של חומרים). דוגמאות איך פרוטוקול זה ניתן בקלות הותאם לכמת את גודל ואת מידת קיבוץ באשכולות של L-סוג ממותגת מתח Ca^{2 +} ערוצים (Ca_v1.2) sarcolemma של תאי שריר הלב, או להשתמש כדי להמחיש את ההפצה הסלולר של חדר המיון, הם הפגינו. הבנת את התפלגות וארגון מרכיבים אלה הסלולר היא חשובה ביותר בהבנת הקבלה, תרגום, ובסופו של דבר את הפונקציה של Ca רבים^{2 +}-מפלי איתות התלויים. לדוגמה, Ca_v1.2 ערוצי חשובים באופן מהותי עבור צימוד, בעוד קולטן בתיווך Ca^{2 +} השחרור מחדר המיון הוא אולי המפל איתות ביותר בכל מקום בתאים בתרבית של עירור-התכווצות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. שטיפת coverslips זכוכית דקה

1. יום לפני עיבוד הדגימה, לנקות #1.5 coverslips זכוכית דקה על ידי sonicating בפתרון 1 מ' של קו מאובטח. פעולה זו מסירה את כל מזהמים פלורסנט שעשויים להיות נוכח על coverslips.
   1. שטפים היטב את קו מ coverslips במים מיוננים.
   2. לאחר נוקה ב KOH, אחסן את coverslips אתנול 70% עד מוכן לשימוש.

2. ציפוי coverslips זכוכית דקה

הערה: השלבים בסעיף זה צריך להתבצע בשכונה התרבות התא למניעת זיהום.

1. להשתמש מלקחיים כדי להסיר coverslip בודדים של הפתרון אתנול 70%, להבה במהירות כדי להסיר את עודף. מקם את coverslips לתוך צלחת 6-. טוב. אם בוער בשכונה תרבות היא לא אופציה, שקול autoclaving coverslips לאחר שטיפה עם מים מיוננים ו/או עיקור מתחת UV אור בשכונה תרבות במשך לפחות 30 דקות
2. לעזרת הידבקות של תאים, מעיל coverslips עם סטרילי 0.01% פולי-L-ליזין לשעה בטמפרטורת החדר.
3. וארוקן את פולי-L-ליזין ולשטוף את coverslips עם סליין סטרילי פוספט buffered (PBS). אוויר יבש ומניחים במקרר למשך הלילה.
4. בבוקר שלמחרת, להסיר את coverslips מהמקרר ולהוסיף 300 µL של laminin, על ריכוז של 50 µg/mL, במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. להבטיח כי laminin בזהירות מניחים ישירות על גבי coverslip.
   הערה: שלב זה laminin אין צורך כי-7 תאים או תאים HEK293 אך נדרשת עבור נייטרלים חדרית מבודד. שאר התאים הראשי כגון תאי השריר החלק בכלי הדם או נוירונים עשויים לדבוק כדאי קולגן או fibronectin מצופה coverslips.

3. הכנה של תאים

1. תאים בתרבית
   1. 7-כי לגדל תאים (או שורת התאים מועדף) על צלחת תרבות 10 ס מ ב- 10 מ"ל Dulbecco ' s בינוני נשרים שונה (DMEM) תרבות בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פתרון פניצילין/סטרפטומיצין (PS). לגדל תאי חממה התרבות התא-CO של 37 ° C ו- 5%-₂-
   2. כאשר התאים מגיעים 90% confluency, לקצור אותם מתוך קערה 10 ס מ על-ידי כ רפה בעברית התקשורת DMEM והוספת 5 מ של 0.05% טריפסין-EGTA פתרון ברגע והתאים מתחילים לאסוף ולנתק, לנטרל מיידית של טריפסין עם DMEM שהושלם.
      1. שימוש 5 מ"ל פיפטה סרולוגית כדי להסיר התאים מתוך קערה. Pipette את המדיום נגד הבסיס של המנה מספר פעמים כדי להסיר תאים שנותרו מחסידי למשל ולהפצה התאים ברחבי המדיום תרבות.
   3. צלחת תאים על 35 מ מ מנות התרבות כדי להשיג 70% confluency על תרביות תאים. להפוך את אמצעי האחסון של מדיום בצלחת עד 2 מ"ל עם פתרון DMEM/FBS/PS טריים.
   בונה
   4. transfect כי-7 תאים עם פלסמיד הרצוי DNA (למשל, פלסמיד sec61β-mCherry), באמצעות ריאגנט של תרביות תאים מתאים ולפי היצרן ' הוראות s.
      הערה: ייתכן שיחלפו 24-48 שעות עבור החלבון לבטא, בהתאם את פלסמיד ו/או תרביות תאים הכימית משמש.
2. נייטרלים חדרית העכבר למבוגרים
   1. לבודד נייטרלים חדרית העכבר למבוגרים באמצעות ומבוססת Langendorff זלוף בשיטה ⁶. מחדש להשעות את גלולה וכתוצאה מכך נייטרלים בבינוני 199 (M199) בתוספת 2.5% FBS ו 1% PS.

4. ציפוי תאים

1. Transfected COS-7 תאים
   1. האחות 2 מ"ל DMEM/FBS/PS פתרון מקערה 35 מ מ ולהוסיף 1 מ"ל Ca ^{2 +}-PBS חינם. לחזור המנה החממה עבור 2 דק קציר תאים מתוך קערה על ידי כ רפה בעברית הראשון Ca ^{2 +}-חינם PBS, ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EGTA פתרון.
      1. פעם התאים להתחיל לאסוף, לנתק מיד לנטרל את טריפסין 1 מ של DMEM שהושלם. פיפטה בעדינות לאורך מספר פעמים על מנת להבטיח התאים transfected מופצים באופן אחיד ברחבי המתלה טריפסין-EGTA-DMEM 2 מ"ל.
   2. צלחת transfected COS-7 תאים על coverslips מצופה פולי-L-ליזין-צפיפות המתאים כך תאים בודדים, ניתן לאבחן, ולמלא את אמצעי האחסון המנה עד 2 מ עם DMEM/FBS/PS (למשל להוסיף 90 התליה תא µL coverslip לאחר מכן להוסיף 1,910 µL בתוספת DMEM, מערבולת מאכל להפיץ תאים באופן שווה).
      הערה: תאים לא צריך להיספר אבל עוצמת הקול של תאים יתווספו כל מנה ישתנו בהתאם confluency של התאים.
   3. החזרה מצופה לתאים תא תרבות החממה למשך הלילה כדי לאפשר את התאים לדבוק ולשחזר.
2. נייטרלים חדרית העכבר למבוגרים
   1. תשאף נייטרלים laminin וצלחת ישירות על גבי coverslips מצופה ב צפיפות המתאימה כך תאים בודדים, ניתן לאבחן. זה יהיה תלוי צפיפות התאים קיימא המתקבל הבידוד.
   2. לאזן התליה תא בכיפה על coverslip ועל מקומו חממה התרבות התא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO ₂ ~ 45 דקות לאפשר אדהזיה.

5. קיבוע של תאים

1. להסיר תאים של החממה, בזהירות תשאף המדיום.
   1. לשטוף את תאים חסיד פעם אחת עם PBS.
   2. תיקון תאים עם מקבע אופטימיזציה יישומים בודדים, נוגדנים.
      הערה: קריטריון חשוב לזכור בעת בחירת מקבע הוא שימור המבנה התאי של המדגם, תוך הקפדה גם על כי אין שינוי הסתגלותי ב אנטיגן של עניין. למטרות של הסובבים פרוטוקול 3% paraformaldehyde/0.1% גלוטראלדהיד (PFA/GA), קיבעון עם 100% מתנול הנדונה.
2. מחברים/GA קיבוע של transfected COS-7 תאים לבטא Sec61β-mCherry
   1. לערבב 1.9 מ ל-16% מחברים, GA 50% µL 20 ולהוסיף PBS לעשות נפח סופי של 10 מ"ל.
   2. להוסיף 1 mL להתמחויות מחברים/GA לפתרון כל מנה של תאים, תיקון 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. וארוקן את התאים מחברים/GA ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
   4. לרחוץ את התאים מודבקת עם PBS, 5 פעמים עבור 5 דקות כל אחד. לבצע את כל הצעדים כביסה מסובב להגדיר במהירות בינונית (למשל, 50 מחזורים בדקה).
   5. הבא, להפחית את הקבוצות אלדהיד חופשית עם 1 מ"ל להתמחויות 0.1% מסה/עוצמה נתרן borohydride במים מיוננים.
   6. שטיפה תאים פעמיים ואז לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב- PBS כדי להסיר כל עקבות של נתרן borohydride, האלכוהול הוא מייצר כאשר הוא מגיב עם aldehydes חינם-
3. מתנול קיבוע של העכבר למבוגרים נייטרלים חדרית
   1. בזהירות להוסיף 1 מ"ל של קרח 100% מתנול תאים. להטות את הצלחת 6-ובכן, pipette של מתנול על הקיר בצד ולא ישירות על גבי את coverslip. לאחר מכן להטות את הצלחת 6-. טוב לחזור אופקי כדי לאפשר את מתנול לרחוץ באופן שווה על פני התאים. תקן עבור 5 דקות ב-20 ° C
   2. וארוקן את התאים מקבע ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
   3. לרחוץ את התאים מודבקת עם PBS, 5 פעמים עבור 5 דקות כל ב rotator.

6. חוסם ספציפי שאינו מחייב

1. בלוק לשעה בטמפרטורת החדר בפתרון חסימה (ראה את הטבלה של חומרים).
   הערה: פתרונות שונים עשויים לשמש לחסום מחייב שאינם ספציפיים נוגדן כולל 3% אלבומין שור (BSA) או סרום-החיסון מ מאותו המין כמו הנוגדן העיקרית.

7. זיהוי

1. הדגירה העיקרי נוגדן
   1. וביופסיה הפתרון חסימה. אנחנו לא שוטפים או שטיפה.
   2. להכין את הפתרון נוגדן ראשוני כדלקמן (ראה שלב 7.1.5): לדלל נוגדן ראשוני כדי ריכוז של µg/מ"ל (או יצרן ' s הציע ריכוז) בפתרון הדגירה נוגדנים (ראה את הטבלה של החומרים ). לאזן את אמצעי אחסון זה קטן על coverslip ולהגדיר בזהירות ריבוע של פרפין פלסטיק הסרט למעלה. זה עוזר להפיץ נפח קטן של נוגדן מעל coverslip, מפני אידוי.
   3. למקם את הצלחת 6-ובכן בתוך תא לחות, דגירה למשך הלילה במקרר.
   4. בבוקר, להסיר התאים תא לחות, בזהירות להסיר את הסרט פרפין מרובע מפני השטח של coverslip, תשאף הפתרון העיקרי נוגדן.
   5. שטיפה 3 פעמים עם PBS, ואז לשטוף 5 פעמים במשך 5 דקות עם שטיפה בלוק פתרון (ראה טבלה של חומרים)-מסובב.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש הנוגדנים הבאים, אנטי-RFP העכבר נוגדנים חד שבטיים לתמונות, מוצגים באיור 2 ארנב FP1 polyclonal ⁷ אנטי-Ca _V 1.2 נוגדנים (מתנה פרופ. יוהנס גיהנום, UC דיוויס) עבור התמונות המוצגות באיור 3. לגבי החדר לחות, קופסת אוכל פלסטיק עם מכסה ההדוקות, שלאורכו מגבות נייר רטוב עבודות. PBS עשוי לשמש לניקוי צעדים, אולם פרוטוקול זה משפר את תיוג ירידה לפרטים ומפחיתה את הרקע באמצעות חסימת בתמיסה מדוללת לכביסת צעדים.
2. נוגדנים משניים דגירה
   1. וארוקן את הפתרון כביסה ולהוסיף 200 µL מצומדת נוגדנים משניים הפתרון מדולל 1:1,000 בתמיסה הדגירה נוגדן. מניחים ריבוע של פרפין הסרט מעל coverslip (ראה שלב 7.1.2).
   2. Incubate לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
   3. נוגדנים משניים לשאוב ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
   4. לרחוץ תאים עם פתרון חסימה מדולל 5 פעמים למשך 5 דקות על הנדנדה.
   5. שטיפת 3 פעמים במשך חמש דקות עם PBS.
      הערה: פרוטוקול זה המתאר את השימוש אנטי-העכבר 647 אלקסה משני נוגדן מצומדת ו אנטי-ארנב 647 אלקסה מצומדת נוגדן משני עבור איור 2 ו- איור 3, בהתאמה. חלבון יחיד תיוג, 647 אלקסה הוא fluorophore מועדף בשל שלה ספירה גבוהה פוטון (משפר את דיוק לוקליזציה), מחזור נמוך (משפר רזולוציה טמפורלית) ⁸. אפשרויות רבות אחרות fluorophore מצומדת נוגדנים משניים, כגון אטו או Cy-צבע, הינם זמינים. עיין דמפסי. et al. ⁸ ו. Chozinski et al. ⁹ עבור הערכות מקיף של ההתאמה של מספר fluorophores/צבעני הדמיה ברזולוציה סופר-

8. קיבוע שאחרי (שלב אופציונלי)

1. לדלל 50 µL 50% GA ב 10 מ"ל PBS להשגת פתרון GA 0.25%. פוסט לתקן תאים עבור 10 דקות בפתרון זה בטמפרטורת החדר.
2. לשטוף עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות על מסובב.

9. אחסון של דגימות

1. לאחסן דגימות במקרר (4 ° C) אריזה מרופדת בנייר כסף אלומיניום כדי להגן מפני אור עד הדמיה-
2. לאחסון לטווח ארוך של דגימות (עד מספר חודשים), לאחסן ב- PBS המכיל אזיד הנתרן 3 מ מ למניעת התפתחות חיידקים.

10. GSD סופר-רזולוציה הדמיה מאגר Photoswitching הכנת

1. להכין חמצן ניקוי ' GLOX ' פתרון כדלקמן:
   1. בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL, להוסיף קטלאז µL 12.5 (מניות 34 מ"ג/מ"ל), 3.5 מ ג גלוקוז אוקסידאז, 0.5 µl 1 מ' טריס (ה-pH = 8) כדי 49.5 µL PBS.
   2. מערבולת בקצרה כדי להמיס רכיבים בתוך תמיסת ואז צנטריפוגה ב g x 20,800 עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס
      הערה: ניקוי חמצן פתרונות כגון GLOX, התגלו להתנגד photobleaching. GLOX יש לשמור במקרר עד שבוע. חזור על השלב צנטריפוגה בכל פעם בו.
2. להכין photoswitching בתדר פתרון תיול כדלקמן:
   1. להכין פתרון β-mercaptoethylamine (מאה) 100 מ מ ב- PBS ולשנות את ה-pH pH 8 או לחילופין שימוש β-mercaptoethanol (βME). לאחסן פתרון MEA aliquoted במקפיא (-20 ° C) במשך שבוע עד.
3. מיד לפני הדמיה, הכנת המאגר מיתוג הסופי על קרח על-ידי הוספת תיול את ניקוי חמצן מרכיבים ביחד. עבור 500 µL GLOX-MEA, להוסיף 5 µL GLOX 50 µL MEA (ה-pH = 8) 445 חיץ מלוחים µL (2.5 מ ל 1 מ' טריס pH = 8, mg 29.22 NaCl (ריכוז סופי 10 מ מ), גלוקוז 5 g ו- 47.5 מ ל מים). לחלופין, להוסיף לפתרון GLOX-βME 5 µL GLOX, 5 µL βME, מאגר מלוחים 490 µL.
   1. לשמור את הפתרונות על קרח, להשתמש לפי הצורך כדי לטעון דגימות בשקופיות זכוכית דיכאון.
      הערה: תיול המכיל פתרונות כגון βME או MEA לגרום photoswitching של צבעי מבוססי cyanine כגון אלקסה 647 ¹⁰ או מבוססי xanthene צבעים כגון אלקסה 568. ΒME מפיקה תוצאות טובות יותר עם אלקסה 647 בעוד מאה היא המועדפת עבור אלקסה 568 או כאשר 2 חלבונים הם לדימות בגישה תיוג זוגי ניצול אלקסה 568 והן 647. המאגר יחריף על פני תקופה של שעות עקב acidification. זה יוביל לירידה הרוזן פוטון הממוצע של המדגם. כדי למנוע זאת, רצוי להכין מאגר photoswitching טריים לאחר 2-3 h או אם ירידה בספירת פוטון הממוצע או סיומת הבולטים של משך הזמן photoswitching המושרה נצפית. מאמר תיאר חדש הדמיה מאגר שור-EA אשר עדיין לא בדקנו אך הדיווחים pH יציב המוצגים רמות במשך מספר ימים ומבצע טוב יותר GLOX עבור יישומי הדמיה ¹¹ צבע רב.

11. הרכבה דוגמאות

1. הר coverslips עם תאים עם תוויות (ראו סעיפים 1-9) על דיכאון שקופיות, באמצעות 100 µL מאגר הדמיה-
2. לאטום את הקצוות של coverslip עם דבק סיליקון למניעת חמצון מהיר של המאגר הדמיה. חכו מספר דקות עד דבק סיליקון מלא ריפאה אחרת coverslip את אלוהים כאשר הדמיה-
   הערה: דבק סיליקון לא תחזק אם הוא בא במגע עם βME. יש להקפיד לייבש את הקצוות של coverslip כדי למנוע את דבק סיליקון פנייה אל המאגר הדמיה-

12. תמונה רכישת

1. ראה טבלה 1 לקבלת רשימה של הדמיה הפרמטרים המשמשים איור 2 איור 3-
   1. כדי להתחיל, בחר את הלייזר המתאים כדי להאיר את הדגימה בהתאם fluorophore נבחר. מערכת SR-GSD בשימוש פרוטוקול זה מצויד עם לייזרים ובעוצמת (488 ננומטר, 1.4 KW/cm ²; 532 ננומטר, KW/ס מ 2.1 ²; 561 ננומטר, 2.1 KW/cm ² 642 ננומטר, KW/ס מ 2.1 ²). איור 2 משמש הלייזר nm 642.
2. שימוש של העדשה המטרה שמן-טבילה עם הערך לא ישים גבוהה מערכת SR-GSD המשמש כאן הינו מצויד עם אפו PL HC 160 X / 1.43 נה המטרה.
3. בחרה הקוביה המתאימה הדמיה ודיקרואיק זוהר. מערכת SR-GSD פרוטוקול זה מצויד עם HP 488-T, 532 HP-T, HP 568-T, HP 642-T עם פליטה הלהקה לעבור מסננים של 505-605 ננומטר, 550-650 nm ו- 660-760 nm.
4. בחר את מצב 2D רכישה. הגדר את המצלמה העברת מסגרת זמן מצב וחשיפה 10 ms (100 Hz). הגדר את רווח EM 300. בחר את הסף זיהוי.
   הערה: סף נמוך להפיק תמונות רקע. סף גבוה יכול לסנן את האות של עניין. לקבוע סף בהתבסס על פקדים שליליות כגון הדמיה coverslips של תאים שאינם transfected או תאים מודגרות עם נוגדנים משניים בלבד.
5. להפעיל אוטומטית אירוע שליטה ואירועים קבועים לכל תמונות ל- 8-
6. הזן את גודל פיקסל בכרטיסיה GSD-רכישה (להתחיל עם 10 ננומטר או גודל פיקסל של 20 ננומטר). להבטיח כי " היסטוגרמה מצב " נבחרת הכרטיסיה כלים GSD תחת אפשרויות החישוב של התמונה ברזולוציה גבוהה לפני ייבוא תמונות.
7. תמונה חלבונים-קרום פלזמה, לבחור את מצב TIRF ולשנות את זווית שכיחות כדי לקבוע את עומק החדירה.
8. לשלוח אלקטרונים המדינה כהים (הנקרא שאיבה), להגדיר את עוצמת הלייזר ל- 100%.
9. בחר גילוי מולקולה בודדת תוך שאיבה והגדר לרכוש באופן אוטומטי כאשר המתאם מסגרת הוא 0.20.
10. עבור הרכישה, להגדיר לייזר בעוצמה על 50%.
11. מוגדר מספר המסגרות רכישה של 60,000 דולר.
    הערה: החוקר עשוי לגלות כי מדגם דורש פחות או יותר מאשר זה. לשנות את ספירת מסגרת המבוססת על תצפיות של photobleaching fluorophore ורכישת עצור כאשר אין אירועים נוספים לזיהוי.
12. רכישה התחל.
    הערה: בתחילת רכישה, כל מולקולות צבען נמצאות במצב פלורסנט ולאחר מכן לעבור למצב כהה. כאשר המתאם מסגרת מגיע 0.20, תמונות יתחיל לרכוש. כאשר אירועים פחות מ-8 מזוהים לכל מסגרת, תעבור הלייזר 405, עידוד fluorophores למעבר ממצב כהה של המדינה הקרקע. בעת רכישת תמונות עבור dataset של n = x תאים n = y בעלי-חיים, פרמטרים כגון TIRF עומק החדירה, זיהוי סף ומספר מסגרות רכשה צריך להישמר קבוע.

13. ניתוח תמונה

1. כדי לכמת את גודל האשכול חלבון, השתמש ' לנתח חלקיקים ' תכונה של ImageJ.
   הערה: ניתוח נוסף ניתן לבצע באמצעות ניתוח מבוסס מיקרוסקופיה לוקאליזציה היחסי סטוכסטי שחזור אופטי (סערה-RLA) או דומים ¹³.
   1. לבצע ניתוח האשכולות ( איור 3) באמצעות ImageJ כדלקמן:
   2. לפתוח את קובץ התמונה כדי להיות מנותח. . זה אמור להיות 10 ננומטר היסטוגרמה מולקולה בודדת לוקליזציה מפת כפי שנוצר בתוכנת הדמיה שתוארו לעיל (סעיף 12).
   3. להתאים את הבהירות והניגודיות כדי להמחיש את התמונה: לחץ על תפריט תמונה, בחר התאם, ואז הבהירות והניגודיות. לחץ על האפשרות auto.
   4. לשנות את סוג התמונה ל- 8-bit: בחרו בתפריט ' תמונה ', ולאחר מכן בחר סוג, ובחרו 8-bit.
   5. קבע את קנה המידה של התמונה: פתח את תפריט נתח, לחץ על קנה מידה קבע והזן את הפרמטרים הבאים: מרחק = 1, ידוע מרחק = 10, 1 פיקסל = 10 ננומטר.
   6. כדי לבחור את המידות כדי להתקבל, פתח את תפריט נתח בחר הגדרת המידות, סמן את התיבה לצד האפשרות באזור.
   7. להתאים את הסף של התמונה. פתח תפריט ' תמונה ', בחר התאם ולאחר מכן בחר הסף, בחר מעל/מתחת. להעביר את הערך המקסימלי עד 255, ולעבור הערך המינימלי 1, לחץ על החל.
   8. כדי לנתח את החלקיקים, פתח את תפריט נתח, בחר נתח חלקיקים. הצב סימן ביקורת כדי לבחור יחידות פיקסל, הצגת תוצאות ולסכם. קבע את הגודל 4-אינסוף (מכיוון שרזולוציית ~ 20 ננומטר), בחר באפשרות מתאר חשופות, לחץ על אישור. ייווצר קובץ סיכום אשר יכיל את הפרטים ניתוח כגון את גודל האשכול הממוצע ואת המספר של אשכולות בתמונה.
      הערה: יש לנקוט זהירות בעת ביצוע מסקנות לגבי מספר חלבונים בתוך אשכול מסוים, כמו מספר נקודות המותאמות לשפות אחרות הוא לא לינארית מתואם עם המספר של חלבונים. GSD רגישה צבע זה הם מצומדת כדי נוגדנים, וכתוצאה מכך הצמדה-שגיאת זה מזיחה את התווית פלורסנט מ epitope על ידי > 10 ננומטר בכל כיוון. בנוסף, אם נוגדנים polyclonal משמשים, נוגדן אחד או יותר יכולים לאגד אנטיגן יחיד ולא לבלבל את הנושא המשני מסחריים, עוד יותר את הנוגדנים הם מצומדת, בממוצע, 3-6 מולקולות של צבע ולכן fluorophore אחד לא תמיד שווה חלבון אחד. תאחיזה-שגיאה יכול להיות מופחת על ידי conjugating צבע ישירות אל נוגדן ראשוני (ביטול המשני) או באמצעות מבוססי nanobody תיוג ערכת ¹⁴.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כפי שמתועד במבוא, ישנם רבים מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה אחרת שיטות הדמיה. פרוטוקול זה, מתמקד GSD הדמיה ברזולוציה-העל. נציג תמונות ומפות לוקליזציה מוצגים באיור 2 , איור 3.

איור 2 מציג תא COS-7 transfected ע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפיצוץ האחרונות של טכנולוגיות המאפשרות הדמיה מעבר למגבלת עקיפה הציעו חלונות חדשים לתוך המורכבות של בתרבית של תאים איתות במרחב ובזמן. טכנולוגיות אלה כוללים סערה, STED, דקל, GSD, SIM, גרסאות שונות (למשל, dSTORM, FPALM). החכמה של המדענים מאחורי טכניקות אלה אפשרה לנו לעקוף את המגבלות שהוטלו על ידי חוק?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOH	Thermo Scientific	P250-500	To clean coverglass
#1.5 coverglass 18 x 18 mm	Marienfeld Superior	0107032)	To grow/process/image cells
10x PBS	Thermo Scientific	BP3994	Dilute to 1x with de-ionized water
Poly-L-Lysine	Sigma	P4832	Aids with cell adhesion to cover glass
laminin	Sigma	114956-81-9	Aids with cell adhesion to cover glass
Medium 199	Thermo Scientific	11150-059	Ventricular myocyte culture media
DMEM 11995	Gibco	11995	Cell culture media
Fetal bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific	10437028	Media supplement
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333	Media supplement
0.05% trypsin-EDTA	Corning	25-052-CL	Cell culture solution
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transient transfection reagent
Ca2+-free PBS	Gibco	1419-144	Cell culture
100 % Methanol	Thermo Fisher Scientific	A414-4	Cell Fixation
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell Fixation
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	SLBR6504V	Cell Fixation
SEAblock	Thermo Scientific	37527	BSA or other blocking solution alternatives exist
Triton-X 100	Sigma	T8787	Detergent to permeabilize cells
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1)	Gift	N/A	Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Mouse monoclonal anti-RFP	Rockland Inc.	200-301-379	Primary antibody
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A31573	Secondary antibody
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A11031	Secondary antibody
Sodium azide	Sigma	S2002	Prevents microbial growth for long term storage of samples
Catalase	Sigma	C40	Photoswitching buffer ingredient
Glucose oxidase	Sigma	G2133	Photoswitching buffer ingredient
Tris	Sigma	T6066	Photoswitching buffer ingredient
beta-Mercaptoethylamin hydrochloride	Fisher	BP2664100	Photoswitching buffer ingredient
β-mercaptoethanol	Sigma	63689	Photoswitching buffer ingredient
NaCl	Fisher	S271-3	Photoswitching buffer ingredient
Dextrose	Fisher	D14-212	Photoswitching buffer ingredient
Glass Depression slides	Neolab	1 – 6293	To mount samples
Twinsil	Picodent	13001000	To seal coverglass
sec61β-mCherry plasmid	Addgene	49155
Leica SR GSD 3D microscope	Leica
ImageJ
Washing block solution			20 % SEAblock in PBS
Primary antibody incubation solution			0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS
Secondary antibody incubation solution			1:1000 in PBS