JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המטרה של פרוטוקול זה נועד לאפשר זיהוי של in vivo הריגתו של תא המטרה במודל מאתר של אנטיגן ספציפי.

Abstract

מתודולוגיות הנוכחי לרצח אנטיגן ספציפי מוגבלים לשימוש במבחנה או שימוש במודלים מחלה זיהומית. עם זאת, יש לא פרוטוקול ספציפי נועד למדוד אנטיגן ספציפי הרג ללא זיהום. פרוטוקול זה תוכנן ומתאר שיטות להתגבר על מגבלות אלה ומאפשר זיהוי אנטיגן ספציפי הריגתו של תא המטרה על ידי CD8+ T תאים ויוו. זו מושגת על-ידי מיזוג מודל החיסון עם יעד התווית על-ידי CFSE מסורתי הורג וזמינותו. שילוב זה מאפשר החוקר להעריך את הפוטנציאל CTL אנטיגן ספציפי ישירות ובמהירות וזמינותו אינה תלויה הגידול או זיהום. בנוסף, המדידה מבוססת על cytometry זרימה, אז צריך להיות נגיש על רוב החוקרים. המגבלה העיקרית של המחקר היא לזהות את ציר הזמן ויוו שהולם ההשערה הנבדקת. וריאציות בעוצמתם אנטיגן מוטציות בתאי T שעלולה להיות דיפרנציאלית בפונקציה cytolytic צריך להעריך בזהירות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי עבור תא הקציר והערכה. הריכוז המתאים של פפטיד לקבלת חיסון מוטבה hgp10025-33 , ביצית257-264, אך בהמשך יהיה נחוץ אימות עבור אחרים פפטידים שעשויים להיות מתאים יותר ממחקר נתון. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה של הפונקציה ויוו , ניתן להתאים כל אנטיגן נתון.

Introduction

קיימים פרוטוקולים מרובים כדי להעריך את הפוטנציאל (CTL) cytolytic של CD8+ או CD4+ T-cell. ההערכה יכול להיעשות בקלות במבחנה תחת תנאים מבוקרים1,2,3. בנוסף, מודלים מחלה זיהומית, כגון LCMV, בחנו בסגנון קלאסי CTL פונקציה באמצעות באופן שונה CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר) שכותרתו התאים היעד בו CFSEשלום-תאים עם תוויות פעמו עם פפטיד, CFSEהלאו-שכותרתו היעד תאים נשארו unpulsed. התאים אז מוזרק ביחס של 1:1, שקובעת אובדן CFSEהיי-תווית פעמו מטרות באמצעות cytometry זרימה4. חיסון דגמים דחייה גם השתמשו אסטרטגיות דומות עבור הערכה של ויוו להרוג על ידי שני CD8+ ו CD4+ T תאים כמו גם תאי NK5,6. זה וזמינותו עוצמה, אך מחייב שימוש מדבקים זה פריים המערכת החיסונית לפני הזרקת היעד.

פרוטוקול זה, מצד שני, דורש אין זיהום מוקדמת של המחשב המארח, במקום מנצל אסטרטגיה חיסון לשפר את המערכת החיסונית לפני הזרקת היעד. לחיסון זה מורכבת ניסוח על בסיס מים של חיסון פפטיד המחייב מתן immunostimulatory קוקטייל בשם covax7, המורכב קולטן דמוי אגרה 7 (TLR7) אגוניסט (imiquimod קרם), של אנטי-CD40 היתה ללא-חת נוגדן, interleukin-2 (il-2) שמוביל שילוב סינרגיסטי של סוכנים immunostimulatory ההתמחרות פפטיד ספציפי לקרקע ואת התגובה החיסונית חזקה. ככזה, וזמינותו הזה מספק של הבדיקה מהירה של CTL פונקציה כמו החיסון ניתנת יחד עם התאים עבור הערכה של תפקוד רק שלושה ימים לפני הזרקה של תאי היעד. בנוסף, לקרקע covax הוא מספיק חזק, כי ניתן לראות את קיבולת הריגתו של תא T אנטיגן ספציפי להתקפת בין 4 ו- 24 שעות לאחר ההזרקה.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא לזהות את ציר הזמן ויוו עבור הגילוי של הריגת היעד המתאים אנטיגן והן את ההשערה הנבדקת. יש לבצע הערכה זהירה, כשלל וריאציות אנטיגן כוח, כמו גם שינויים גנטיים במקצועות תאי-T עלולה לגרום דיפרנציאלית בפונקציה CTL המחייב של זיהוי תזמון שונה היעד ההרג. בנוסף, בזמן הריכוז המתאים של פפטיד עבור חיסון מוטבה עבור מלנומה אנושית אנטיגן glycopeptide 100 (hgp10025-33) ו אובלבומין257-264 (ביצית257-264)8,9 , שימוש אחר מודל אנטיגן אשר עשוי להיות מתאים יותר ממחקר נתון ידרוש יותר אימות. בשל הבדלים קיבולת של אנטיגנים היעד לעורר CTL לתפקד אפקטור בשילוב עם covax כמו אדג'וונט הצפויה, אופטימיזציה של ריכוז המינון il-2 ותדירות המינון עשוי להיות חיוני להשגת המטרה הרצויה. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה של הפונקציה ויוו , ניתן להתאים כל אנטיגן נתון.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת טקסס MD Anderson Cancer Center.

1. הכנה של פפטיד של חיסון

  1. להמיס את פפטיד lyophilized עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) הריכוז המתאים, מערבולת ב-30 s.
    הערה: עבור25–hgp10033, הריכוז הסופי הוא 1 מ"ג/מ"ל, עבור ביצית257–264, הריכוז הסופי הוא 0.5 מ"ג/מ"ל. לשקם פפטיד לפני ההזרקה. אל תאחסן אחרי שיחזור.

2. בידוד של Splenocytes מכל עכבר מהונדס

הערה: תא בידוד מן הטחול חייב להתבצע בצורה סטרילית.

  1. המתת חסד OT-1 העכבר הטרנסגניים בשיטה שאושרו CO2 חנק, להסיר את הטחול.
    הערה: העכבר הטרנסגניים המתאים מנוצל בשלב זה ספציפי פפטיד של בחירה.
    1. הנח את העכבר בצד ימין שלה. תרסיס בצד השמאלי של העכבר עם 70% אתנול (EtOH). משוך את העור בעזרת מלקחיים, לחתוך את העור באמצעות מספריים כירורגיים; הטחול יהיה גלוי בתוך חלל הצפק. בעדינות לפתוח את החור בצפק לגשת הטחול. להסיר את הטחול באמצעות מלקחיים.
  2. Disaggregate הטחול על-ידי הצבתו במסנן מיקרומטר 70 בצלחת פטרי בינונית 2 מ ל- A (PBS עם 1% סרום שור עוברית (FBS)) ו לנפץ את הטחול עם סוף פומפה.
    1. לאסוף את splenocytes צלחת פטרי והמקום צינור חרוטי 50 מ. לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מ של מדיום פעמיים כדי לאסוף את כל התאים. הוסף בינוני למעלה מ 25 ל ' centrifuge את התאים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ב 475 x g.
  3. וארוקן את התאים, resuspend 1 מ"ל / לכל מאגר פירוק של תאי הדם האדומים (RBC) טחול. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק להוסיף 10 מ"ל של מדיום A, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר 475 x g... Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום A, הסרת לכלוך על-ידי סינון התליה תא דרך מסנן מיקרומטר 70 לתוך נקי 50 מל חרוט.
  4. לספור תאים באמצעות trypan blue ושל hemocytometer. Resuspend תאים ב- PBS ריכוז סופי של 106 -6 תאים/מ ל. עבור ביצית257–264 ספציפי להרוג, resuspend ב- 106 תאים למ"ל, עבור hgp10025–33 ספציפי להרוג, resuspend-6 תאים/מ.
    1. ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב ג x 475 וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב- 15 מ"ל PBS קר כדי לשטוף את התאים. חזור על השלב לשטוף פעם נוספת. ספין התאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב ג x 475 וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב- PBS קר על-פי אמצעי האחסון הסופי שנקבע בשלב 2.4.
    2. תא בודד ההשעיה להעביר צינור microcentrifuge 1.5 mL ולשמור על הקרח עד זריקה לתוך עכבר C57/BL6 הנמען.

3. הזרקה של Splenocytes מן העכברים הטרנסגניים

  1. את המקום העכבר הנמען C57/BL6 restrainer עם הצד הגבי. תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. לנהל µL 100 של תא בודד השעיה (סעיף 2) דרך הווריד לווריד הזנב באמצעות מחט 27 G עם הצד שיקוע פונה כלפי מעלה.

4. Covax ניהול

הערה: אם תאים מוזרקים בשעות אחר הצהריים, covax ובחולים למחרת בבוקר בתוך 18 h של הזרקת תאים.

  1. הנח את העכבר בתיבת הרדמה ברור עם 1-3% איזופלוריין. אחרי עכברים הם מורדם לחלוטין, להעביר הקונוסים האף מחובר את סעפת בבית הבליעה הרדמה העכברים. לשמור על עכברים מאופקת עם הצד הגבי למעלה.
    הערה: ההרדמה אושר על ידי צביטה הבוהן קצרה כדי לוודא שתגובת הנסיגה היא לא elicited. החוק הפדרלי מגבילה את השימוש איזופלוריין גודל וטרינר מורשה.
  2. תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. מזריקים µL 100 של פפטיד פתרון (מתוך סעיף 1) subcutaneously באמצעות מחט 27 G עם המזרק לחדור 4-5 מ מ לתוך האזור בסיס הזנב, הצד שיקוע המחט פונה כלפי מעלה.
    הערה: עכברים הם חוסנו באגף אחד עם הזרקה תת עורית בבסיס של הזנב10.
  3. להזריק 100 µL, אנטי-CD40 נוגדנים (מניות 0.5 מ"ג/מ"ל) לרוחב באתר הזרקת החיסון.
  4. בזהירות החל imiquimod קרם 50 mg/עכבר על האתרים חיסון. מרחו קרם imiquimod על פני השטח עד הקרם אינה גלויה, נספג באופן מלא.
  5. מזריקים µL 100 של 100,000 IU/mL rhIL-2 חלבון intraperitoneally (i.p.) על אזור הבטן התחתונה. להתבונן עכברים במשך 5 דקות אחרי שהם יתאושש לגמרי מן ההרדמה.
    הערה: ניסוי מושהה בנקודה זו במשך 3 ימים.

5. בידוד של המטרה Splenocytes של תיוג עם CFSE

הערה: תא בידוד מן הטחול חייב להתבצע בצורה סטרילית.

  1. המתת חסד העכברים C57BL/6 לפי שיטת חנק של2 CO שאושרו. הסר spleen(s) כמו שלב 2.1.1. Disaggregate הטחול ולשטוף splenocytes כמו צעדים 2.2.1 - 2.2.3. Lyse כדוריות דם אדומות כמו צעדים 2.3 - 2.3.2.
  2. להסיר תאים עבור ספירה באמצעות של hemocytometer, לחישוב ריכוז סופי של תאים ב- 106 תאים למ"ל בפתרון תיוג CFSE (המתוארים בשלב 7). ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות-475 x ג וביופסיה תגובת שיקוע.

6. פפטיד הפועמים של יעד Splenocytes

הערה: פפטיד הפועמים חייב להתבצע בצורה סטרילית.

  1. Resuspend תאים על 106 תאים למ"ל בתקשורת מלאה (RPMI 1640 מדיה עם 10% FBS, 1%-גלוטמין (L-זאת שוב), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת)). לחלק את התאים 2 צינורות (conicals 15 מ"ל). תווית כל שפופרת פעמו או unpulsed.
  2. הוסף פעמו פפטיד כדי ברכבת התחתית. תווית. עבור ביצית257–264 הפועמים, להוסיף 1 µg/mL, hgp10025–33 הפועמים, להוסיף 2 µg/mL.
    הערה: התאים unpulsed עוברים הדגירה זהה של התאים פעמו רק בלי תוספת פפטיד.
    1. דגירה תאים + פפטיד ב 37 ° C עבור 1 h.
  3. להוסיף 10 מ של התקשורת מלאה (RPMI 1640 מדיה עם 10% FBS, 1%-גלוטמין (L-זאת שוב), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת)) כדי כל שפופרת לשטוף שניהם פעמו ו unpulsed התאים היעד. ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות-475 x ג וביופסיה תגובת שיקוע.

7. הכנת CFSE עבור תיוג יעד Splenocytes

  1. להכין פתרון תיוג CFSE במהלך לתא הכביסה בשלב 6.3; התאים פעמו יסומנו כסעיפים CFSE. היי , את unpulsed כמו CFSEהלאו. להכין 1 מ"ל של פתרון תיוג CFSE 106 תאים.
    הערה: CFSE הוא רגיש אור, צריך להיות מוגן מפני אור בכל עת.
    1. להכין CFSEהיי -תיוג מדיה על-ידי הוספת 1 uL/mL CFSE (פתרון מניות 5 מ מ) עבור ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר/mL בתקשורת RPMI 1640 עם 2% FBS.
    2. להכין CFSEהלאו -תיוג מדיה על-ידי הוספת 1 uL/mL CFSE (פתרון מניות 0.5 מ מ) עבור ריכוז סופי של 0.5 המדיה RPMI מיקרומטר/mL 1640 עם 2% FBS.

8. תיוג של היעד Splenocytes עם CFSE

הערה: תיוג CFSE חייב להתבצע בצורה סטרילית.

  1. Resuspend תאי היעד פעמו ו- unpulsed (מתוך שלב 6.3) 106 תאים למ"ל תיוג CFSE מדיה. Resuspend התאים פעמו עם מוכן CFSEהיי-תיוג מדיה והתאים unpulsed עם מוכן CFSEהלאו-תיוג מדיה.
  2. מערבבים תאים ומדיה תיוג CFSE על-ידי היפוך עדין או לטמיון. אינן מתאימות על ידי vortexing דגירה תאים, תיוג CFSE מדיה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות רמיקס התאים בכל 5 דקות.
  3. להוסיף 10 מ של התקשורת מלאה תאי השעיה ו ספין כל תא בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב g 475 x.
  4. האחות תגובת שיקוע, resuspend תאים ב- PBS קר 10 מ"ל. לסובב תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 475 x g.
  5. חזור על שלב 8.4.
  6. לספור את התאים ואת תערובת פעמו פפטיד, CFSEהיי-עם unpulsed, CFSEהלאותוויות-שכותרתו תאים ביחס של 1:1 להזרקה לתוך עכברים הנמען. לשמור על aliquot של עונה 1 פרק 106 מעורב תאים לשימוש עבור הערכה cytometry זרימה בסיסית (סעיף 11).
    הערה: עוצמת הקול הסופי להזרקה היא µL 100 לכל העכבר. ספירת הסופי הוא 10e6 תאים. אובדן נפח המזרק ואת המחט צריך להילקח בחשבון והוא צריך להיות מוערך 500 µL.

9. הזרקה של תאי המטרה

הערה: לשמור על התווית על-ידי CFSE תאים מוגן מפני אור לפני ובמהלך ההזרקה ככל האפשר.

  1. את המקום הנמען עכברים C57BL/6 ב restrainer עם הצד הגבי. תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. לנהל µL 100 של תא בודד השעיה לווריד לווריד הזנב עם הצד שיקוע פונה כלפי מעלה.

10. בידוד מחדש של התאים היעד

הערה: העיתוי של שלב זה הוא קריטי, תלויים cytotoxicity CTL את הכוח של אנטיגן לגירוי. להערכת ברצח היעד פעמו257–264 ביצית, התאים צריכים להיות שנקטפו 4-6 שעות לאחר ההזרקה. מאז התווית על-ידי CFSE תאים הם טחולים רגיש, תהליך אור בחושך.

  1. המתת חסד העכברים C57BL/6 הנמען בהתאם לשיטה חנק שאושרו CO2 .
  2. הסר spleen(s) כמו שלב 2.1.1. Disaggregate הטחול ולשטוף splenocytes כמו צעדים 2.2.1 - 2.2.3. Lyse כדוריות דם אדומות כמו צעדים 2.3 - 2.3.2.
  3. Resuspend התאים בתא פלורסצנטיות מופעל 1 מ"ל, מיון (FACs) מאגר (1% BSA + PBS) להערכת מאת cytometry זרימה.

11. gating ההיגיון לקבוע CTL פעילות על-ידי Cytometry זרימה

  1. לבצע הערכה של CTL פעילות באמצעות פרוטוקול cytometry זרימה רגילה. רוכשים תאים באמצעות ערוץ FITC על cytometer זרימה עם 488 ננומטר לייזר עירור11.
    1. שער על לימפוציטים בשידור חי באמצעות הפרמטרים פיזור (האס) לעומת פיזור קדמי (FSC) בצד. לעבד בתוך השער לימפוציט בשידור חי עבור מכלל האוכלוסייה CFSE-חיוביות.
      הערה: התאים התווית על-ידי CFSE מוזרק יפצה תת קבוצה קטנה של לימפוציטים הכולל נוכח הטחול. התאים CSFE-חיובית צריך להופיע שתי אוכלוסיות נפרדות בסולם יומן.
    2. השתמש בתבנית היסטוגרמה כדי לקבוע את אחוז unpulsed (השמאלי שיא, CFSEהלאו) ואת פעמו (נכון שיא, CFSEשלום) אוכלוסיות. אובדן תאי CFSEשלום מציין פעילות CTL אנטיגן ספציפי.

תוצאות

לפני הזרקת תאי היעד התווית על-ידי CFSE, תערובת 1:1 תא מופעל cytometer זרימה כדי לקבוע את התדרים בסיסית של CFSEשלום והן CFSEהלאו התאים היעד. איור 1 א מציגה את האסטרטגיה חסימה כדי לזהות שינויים על האוכלוסיות CFSE, דרך שער הראשוני הוא עשה שימוש בפרמטרים...

Discussion

בעוד פרוטוקול זה היא פשוטה, ישנם כמה צעדים קריטיים זה חייב להתבצע בקפידה. לקרקע covax לאחר ההזרקה של אנטיגן ספציפי T-cell הנבדקת יש צורך לראות יש הריגתו של המטרות פעמו. אמנם זה אפשרי כי החיסון covax על בסיס מים יוצר תנאי דלקתית חריפה, עבור שלב דלקתי כרוני, החלפת ניסוח קצר על בסיס מים עם גישה המבוסס ע?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מחקר NIH (A1R03AI120027 (RN) ו 1R21AI20012 (RN)), מענק מחקר מוסדיים (RN), סטארט-אפ הענק (RN) ו MD אנדרסון CIC זרע הענק (RN).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice Charles River027C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice Jackson Labs003831
hgp10025–33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257–264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL
Imiquimod cream 5% Fougera51672-4145-6Aldara Cream
CD40-specific mAb BioXcellBE0016-2clone FGK4.5
rhIL-2 protein Hoffman LaRoche Inc136Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep KendallS-17474
PBSLife Technologies10010-023Phosphate Buffered Saline
FBSLife Technologies26140-079fetal bovine serum
RBC lysis buffer Life TechnologiesA10492-01red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
L-Glutamine Life Technologies25030081
Pen/StrepLife Technologies15140122penicillin/streptomycin
CFSELife TechnologiesC345545-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA)Sigma A4503
1.5 mL MCT graduated natural Fisher05-408-129microcentrifuge tube
70% ethanolFisherBP8201500EtOH
Trypan blue solution, 0.4%  Life Technologies15250-061
HemocytometerFisher267110
27 gauge needleBD305109
1 mL syringeBD309659

References

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129CytolyticCD8 TassayCFSE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved