כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

Summary

אנו מתארים פרוטוקול למדוד גלגול מאת ומונוציטים מעבר monolayers אנדותל אנושית ועם בגרות עוקבות שלהם לתאי קצף. זה מספק שיטה תכליתי כדי להעריך את מאפייני atherogenic ומונוציטים מבודד מאנשים עם מחלות שונות תנאים וכדי להעריך גורמים בדם אשר עשוי לשפר את הנטייה הזאת.

Abstract

לב כלילית (CAD) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. טרשת עורקים, מוביל לגרום של CAD, הוא שיזם גלגול של מולדת ומונוציטים המערכת החיסונית לאתרים דלקתיות של הפקיד השומנים הנקרא פסי שומן, אשר נמצאים בתוך דפנות העורקים של מדיום כדי עורקים גדולים. תכונת פתוגניים המפתח של נגעים בשלב כזה מוקדם של טרשת עורקים היא ההבשלה של monocytes אשר נודדים אל העורקים כדי ליצור תאי קצף או עמוסי השומנים מקרופאגים. ראיות רבות תומך את ההשערה כי הסיכון של טרשת עורקים מוגברת על ידי התנאים דלקתית כרונית המלווה מחלות כגון דלקת מפרקים שגרונית, HIV, כמו גם הזדקנות כללית, וכי הסיכון הזה הוא ניבא על ידי מונוציט הפעלה. בעוד העכבר מודלים מספקים פלטפורמה טובה לחקור את התפקיד של monocytes atherogenesis ויוו, הן דורשות שינוי גנטי של כולסטרול טבעי מטבוליזם ושינוי דרסטי של העכבר הרגיל דיאטות, מוגבלת התאמה חקר השפעות atherogenic של מחלות comorbid אנושי. זה הניע אותנו לפתח מודל אנושי במבחנה כדי למדוד את הפוטנציאל atherogenic של monocytes מבודד מאנשים עם מצבי מחלה מוגדרת. כיום, אנושיים במבחנה מודלים המגבילים בכך שהם מוערכים מונוציט גלגול קצף תא היווצרות בבידוד. כאן נתאר פרוטוקול שבו ומונוציטים מבודד דם החולה transmigrate על פני תאי אנדותל אדם לתוך מטריצה קולגן מסוג 1, ואת הנטייה שלהם להבשיל לתאי קצף ב נוכחות או היעדרות של השומנים אקסוגני נמדד. הפרוטוקול אומתה על השימוש האנושי ומונוציטים מטוהרים אנשים עם הידבקות ב- HIV ויחידים HIV uninfected קשישים. מודל זה הוא תכליתי ומאפשר מונוציט גלגול קצף תא היווצרות להעריך באמצעות מיקרוסקופ או או cytometry זרימה, כמו גם מאפשר את ההערכה של גורמים atherogenic, המצויים בסרום או פלסמה.

Introduction

מונוציט גלגול היא צעד מכריע בהתפתחות טרשת עורקים פלאק שעלולות להוביל פקקת, שבץ מוחי, אוטם שריר הלב. שלטי טרשת עורקים להתפתח פסי שומן, בדרך כלל נוכח באתרים של זרימת הדם מתנדנדות נמוך בינוני עורקים גדולים, שבו הופקדו השומנים תורמת הפעלה אנדותל, מקומי דלקת¹. ומונוציטים מגויסים כדי תאי אנדותל פסי שומן באמצעות מונוציט chemotactic חלבונים (כגון CCL2), transmigrate לתוך אינטימה². בעקבות גלגול, ומונוציטים עלולה להיווצר מקרופאגים atherogenic, עמוסי השומנים הנקרא תאי קצף בשל ספיגת השומנים, בסינתזה השומנים, למטה-ויסות כולסטרול בזרימת או שילוב של הגורמים לעיל. ומונוציטים עשויים לצבור שומנים במחזור ויש גם הפנוטיפ 'רכה', יכול להיות נטייה תאי קצף תא היווצרות^3,4. תאי קצף התכונות המגדירות של פסי שומן ושלטים טרשת עורקים בשלב מוקדם, שלהם גיבוש מושפעת השומנים וגם מתווכים דלקתיים⁵. לחלופין, ומונוציטים יש את היכולת להפוך transmigrate של העורק לתוך מחזור הדם⁶, ובכך להסיר את השומנים מן אינטימה להתנהג כדי לשמור על הבריאות של העורק.

קביעת של הנטייה של monocytes כדי transmigrate על פני אנדותל העורקים ואת תאי קצף טופס של אינטימה, או להיפוך transmigrate ולסחוב השומנים מחוץ הפלקיו, היא דרישה מפתח להבנת התפקיד של הפעלת מונוציט בהגדלת הסיכון טרשת עורקים. דגמי העכבר CADs כגון טרשת עורקים חשובים שחקרתי בזמן אמת אין ויוו מידע על התפתחות רובד שומני פס/טרשת עורקים. עם זאת, מודלים אלה מחייבים שינוי גנטי של רמת הכולסטרול טבעית עיבוד היכולות של חיות אלו בדרך כלל בשילוב עם שינויים דרסטיים דיאטה (כגון דגם דיאטה ספקיות-/-מערבי-type)^7,8, ובכך, גרימת הצטברות-פיזיולוגיים של מחזורי השומנים רמות שהתפתחות לוח הכונן. מודלים אלה תהיה מוגבלת רלוונטיות התנאים דלקתית כרונית אנושיים כגון הידבקות ב- HIV אשר אינם משויכים מוגבר במחזור כולסטרול או רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). יתר על כן, הבדלים בביולוגיה מונוציט בין בני אדם ועכברים לבצע בדיקה של אימונולוגי שאלות הנוגעות הרלוונטיות של subpopulations של ומונוציטים (כגון ומונוציטים ביניים (CD14⁺⁺CD16⁺))⁹ קשה. זה חשוב כאשר לומדים את מנגנוני נהיגה למחלות לב וכלי דם כמו ספירת ביניים מונוציט באופן עצמאי לחזות אירועי לב וכלי דם^10,11. בזמן מבחני קיימים למדוד באופן רציף או מונוציט גלגול או קצף כדוריות בבידוד, אין assay במבחנה אומתה לכימות תנועת שני היבטים של atherogenesis מוקדם באמצעות אותם התאים של גדודים קליניים. Transwell מודלים לנצל ששונה בוידן דו תאיים מערכת לפיה תאים מוטענים לתוך התא העליון, transmigrate דרך מחסום פלסטיק נקבובי או טפט תא לתא התחתון המכיל בדרך כלל מדיה עם chemoattractant^{12 , 13}. תוך שימוש נרחב לניתוח ליקוציט גלגול, מודלים אלה בדרך כלל לא לשלב שכבה המייצג של אינטימה, וכתוצאה מכך שמדמו תאים נודדים לתוך פתרון, ולא מאפשרים לשקילת קצף תא היווצרות או גלגול לאחור של אותם התאים. לעומת זאת, מודלים של היווצרות תאי קצף לא בחשבון שינויים transmigratory-induced ומונוציטים או אפקטים של הפעלת אנדותל אשר ידוע לתרום קצף היווצרות התא¹⁴. יתר על כן, מערכות אלו זירוז קצף כדוריות של מקרופאגים דבקה צלחות התרבות התא על ידי הוספת קולח ריכוזי אקסוגני מחמצנים ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (oxLDL)^15,16משרן מפתח להק תא קצף. LDL בשימוש במודלים אלה היא לעתים קרובות תחמוצת על-ידי תהליכים שאינם פיזיולוגית-רלוונטיות כגון טיפול₄ CuSO¹⁷, לכן, לחקור את חשיבות פיזיולוגית של מחקרים באמצעות מודלים אלה.

כאן נתאר וזמינותו של זה מכמת מונוציט גלגול, היווצרות תאי קצף לאותם התאים אשר אינה דורשת התוספת של oxLDL אקסוגני, לכן כדאי דגמי את התפקיד של monocytes במבנה התא קצף. מודל זה פותחה במקור על ידי פרופסור ויליאם מולר (אוניברסיטת נורת'ווסטרן, שיקגו)¹⁸, יש נוספת מעודן במעבדה שלנו להעריך שמחוץ atherogenicity של monocytes מבודד תחת שאינו מפעיל מאנשים עם מצבים דלקתיים כבסיס המלווה מחלות כמו איידס זיהום¹⁹ , כמו גם הזדקנות²⁰, כי התנאים קשורה לסיכון מוגבר של טרשת עורקים. מודל זה מספק גם פלטפורמה עבור מענה לשאלות ביולוגי בסיסי לגבי נטיה של קבוצות משנה מונוציט שונים לטופס קצף תאים²⁰, ההשפעה של הפעלת אנדותל על ידי ציטוקינים כגון TNF-קצף כדוריות¹⁴ , ואת המאפיינים הנדידה של monocytes כגון עומק ומהירות מהאוכלוסיות ג'לים¹⁹. יתר על כן, גלגול מונוציט תא היווצרות קצף ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ רגיל, לחיות תא הדמיה, flow cytometry והדמיה cytometry זרימה, לכן, לספק שיטה רב תכליתי כדי להעריך את התפקיד של monocytes ב- atherogenesis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: כל הניסויים באמצעות דגימות ביולוגיות האדם בוצעו באישור אתיקה אלפרד חולים אנושיים ועדת האתיקה, מלבורן. כל הניסויים בוצעו ב- Class II אבטחה ארונות, אלא אם כן צוין. " Prewarmed " מתייחס ריאגנטים התחמם עד 37 מעלות צלזיוס waterbath.

1. הכנה של סוג I סיבי קולגן ג'לים: יום 1

1. הכנת polymerized קולגן ג'לים על-ידי הוספת ולערבב 35.7 מ"מ NaOH ברצף, 0.71 x M199, חומצה אצטית 4.58 מ מ ו- 1.71 מ"ג/מ"ל מקליד אני סיבי קולגן פוליסטירן מ ל צינור לפי טבלה 1-
   הערה: ודא כי הקולגן הוא מעורבב היטב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים על מנת לעצור את הייצור של קולגן ' כיסים ' בתערובת ג'ל. להכין 4-6 ג'לים לכל תנאי בדיקה מיקרוסקופית או ג'ל 15 לכל תנאי הבדיקה עבור cytometry זרימה.
2. טוב פעם מעורבים, aliquot µL 50 של קולגן ג'ל תערובת לתוך כל טוב של צלחת סטרילי שהונעו 96-ובכן תרביות רקמה. אל תשתמש בשורות ובעמודות מבחוץ, אבל למלא אותם עם 200 µL 1 x Dubecco ' s פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) כדי להגן על ג'לים מהתייבשות. דגירה צלחות-37 °C/5% CO ₂ על 2 h לאפשר הקולגן פולימריזציה.
   הערה: הנח את הצלחות ישירות על מדפי מתכת נקייה בחממה כדי להבטיח אפילו חום הפצה.
3. בעקבות דגירה, כיסוי של ג'לים עם 150 µL 1 x שהושלם M199 (ראה טבלה של חומרים) דגירה במשך 5 ימים עד שימוש.

2. הרחבת מאוחסנות HUVEC: 1 יום

1. תווית והמעיל 10 ס מ קוטר צלחת פטרי עם 1 מ"ל של 50 µg/mL fibronectin מדולל ב- 1 x PBS, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות
Aliquots
2. הפשרה של cryopreserved חבל הטבור אנושי ראשוני הווריד תאי אנדותל (HUVEC, 1.0 x 10 ⁶ תאים) 10 מ"ל M20.
   הערה: HUVEC צריך להיות מוכן כפי שתואר קודם לכן ²¹ ומשמש במספר נמוך המעבר (< מעבר 4). HUVEC עשוי להיות מוחלף עם תאי אנדותל עורקים האנושי כאן.
3. Resuspend HUVEC ב- 10 מ"ל M20 ולהוסיף מאכל מצופה fibronectin, כ רפה בעברית fibronectin עודף לפני תוספת של תאים, תרבות של הנהרות (כ 5 ימים), החלפת בתקשורת על יום 3-

3. Culturing HUVEC טפט על קולגן ג'לים: יום 5

1. ביום 5, ניתוק HUVEC על ידי כ רפה בעברית תרבות supernatant מ הפטרי ועקצה סרום המכיל מדיה עם 10 מ"ל של ללא סרום M199.
2. מוסיפים טריפסין 0.05% מ ל/0.53 EDTA M199 כדי HUVEC, תקופת דגירה של 1-2 דקות בטמפרטורת החדר, מנענע בעדינות עד לנתק התאים.
3. ברגע מנותק, לשטוף צלחת פטרי עם 5 מ"ל M20 ובמהירות העברת שהמדיה המכילה תאים לרכבת התחתית 10 מ ל-
4. דגימות צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, תשאף תגובת שיקוע, resuspend תאים µL 200 של M20 ו לספור תאים באמצעות hemocytometer.
5. Resuspend לתאים 2.0 x 10 ⁵ תאים/מ ל M20, וארוקן את M199 על ג'לים מהצלחת 96-ובכן (שלב 1.3), להוסיף 100 µL של resuspended HUVEC (2.0 x 10 ⁴ תאים) כל ג'ל קולגן המוכן מעל (שלב 1.2). תרבות צלחות 3 ימים נוספים-37 °C/5% CO ₂.
   הערה: על טפט HUVEC השלמות עשוי לאשר לאחר 3 ימים כסף חנקתי מכתים ²² או אימונוהיסטוכימיה עבור צומת חזק חלבונים ²³ בשלב זה. ג'לים נוספים חייבים להיות מוכנים למטרה זו.

4. הפעלה של טפט HUVEC, בידוד/הפעלה של Monocytes עבור גלגול: ביום 8

1. על יום 8, להפעיל כל טפט HUVEC לפני התוספת של monocytes על-ידי כ רפה בעברית M20 של מדיה בשכבת-על ג'לים והוספת µL 100 של 10 ng/mL TNFα האנושי ב- M20 לכל ג'ל. דגירה-37 °C/5% CO ₂ עבור 4 h.
   הערה: תנאים שלא הופעל HUVEC עשויות להיכלל גם אם נדרש כפקדים.
2. במהלך 4 h HUVEC ההפעלה צעד, ולבודד ומונוציטים מ- PBMCs באמצעות מגנטי חרוז טכניקות כדי לבחור באופן שלילי עבור תאים לפי היצרן ' s הוראות. מינימום של 6.5 x 10 ⁶ PBMCs אמור לשמש בשלב זה כדי לשחזר בצורה אמינה 3.0 x 10 ומונוציטים ⁵ הדרושים עבור תנאי אחד, כפי ומונוציטים בחשבון בדרך כלל כ- 10-15% PBMCs.
   הערה: כדי להעריך את ההשפעה של הפעלת מונוציט לפני היווצרות גלגול מונוציט תא קצף, ומונוציטים יכול להיות מופעל בשלב זה. ומונוציטים יכול להיות מבודד PBMCs המופשרים במידת הצורך (כלומר, מאוחסנות הדגימות החולה). מונוציט קבוצות משנה בודד על-ידי מיון FACS ניתן להכין עבור תוספת ג'ל (איור 1).

5. גלגול של ראשי ומונוציטים אנושי: ביום 8

1. כדי למדוד מונוציט גלגול, להסיר המכילות TNFα מדיה ותרחץ ג'לים פעמיים עם 100 µL M199 על-ידי הוספה והסרה של מדיה. אחרי הכביסה, להוסיף 2.0 x 10 ⁵ טרי מבודד או הקרת, שטף cryopreserved PBMCs או 5.0 x 10 ומונוציטים ⁴ טריים מבודד או מטוהרים מונוציט קבוצות משנה כדי HUVEC monolayers ב 100 µL M20. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO ₂ כדי לאפשר גלגול קדימה של monocytes לתוך הג'ל. מומלץ לאפשר בארות 6 עבור כל תנאי הניסוי בדק.
   הערה: כדי להעריך את השפעת סרום עצמיים על היווצרות התא גלגול וקצף, דגירה תאים עם M20 המכיל את הריכוז הרצויה של התורם לא פעיל חום סרום ולהשוות תנאים עם פקד במאגר בנסיוב אדם. לויקוציטים חוץ ומונוציטים ניתן להוסיף בשלב זה. אם חוקר את השפעת מינים ספציפיים ליפידים/שומנים בדם (למשל, HDL, oxHDL), בצע את השלבים הבאים כל עם מדיה ללא סרום המכיל שומנים µg/mL 20-50-
2. לאחר 1 h של גלגול לפנים, לאסוף את התאים הלא-שמדמו ע י שטיפת ג'לים פעמיים עם µL 100 מ מ 1 prewarmed EGTA ב- 1 x PBS, ופעם אחת עם 100 µL M199 (אותו דבר צנטריפוגה תנאים), צירוף של supernatants מכל קידוח של אותו ניסיוני תנאי (בדרך כלל 6 בארות) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL על קרח. Centrifuge התאים הלא-שמדמו-4 ° C, g x 300 עבור 5 דקות ו- resuspend ב- 30 PBS 1 x µL.
3. לספור את התאים שליקט את תגובת שיקוע כדי לקבוע את מספר התאים הקדמיים שמדמו.
4. אחוז תאים שמדמו קדמי נקבע כדלקמן:
   
5. לכסות נסחפה ג'ל המכיל תאים שמדמו עם 100 µL M20 דגירה עבור ה 48 נוספים
6. לאחר 48 שעות, לאסוף את תגובת שיקוע של תאים שאינם שמדמו לשטוף פעמיים עם 100 µL prewarmed 1 מ"מ EGTA/PBS, איסוף וריכוז את תגובת שיקוע של כל תנאי כמו שלב 5.2.
   הערה: פנוטיפ של תאים שמדמו הפוכה עשוי להיבדק על f תאים אלהcytometry זרימה רגילה מכתים פרוטוקולים.
7. צנטריפוגה תאים ב 4 ° C, g x 300 עבור 5 דקות, resuspend תאים ב- PBS 1 x µL 30. לספור תאים ולקבוע את הכדאיות באמצעות צביעת trypan blue.
8. לקבוע את אחוזי תאים שמדמו הפוכה באמצעות המשוואה הבאה:
   
   הערה: הנהלת חשבונות עבור המספר הכולל של תאים שמדמו קדימה נותן אינדיקציה מדויקת יותר של גלגול לאחור כפי שהוא גלגול קדימה לא סביר יהיה 100%-
9. עבור ניתוח על ידי מיקרוסקופ, לתקן את ג'ל על-ידי הוספת µL 100 2% פורמלדהיד (ריכוז סופי) כל טוב, לכסות את הצלחות אלומיניום לסכל ולאחסן ב 4 ° C עד הניתוח. עבור cytometry זרימה, אל תתקן את התאים בשלב זה. לראות את הפרוטוקולים מתחת מיקרוסקופ (סעיף 6) או ניתוח תזרים cytometry (סעיף 7).
   התראה: פורמלדהיד הוא רעיל, מאכל; השתמש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי). כדאי לשים לב בעת הוספת פורמלדהיד, עם זאת, שלב זה אינו צריך להתבצע בשכונה fume בשל הריכוז נמוך בשימוש.

6. כימות של קצף תאים מקרופאגים על ידי מיקרוסקופ (שמן-אדום O כתם)

1. להסיר את הפורמלדהיד ולשטוף את ג'ל עם 100 µL של 50% (v/v) מתנול עבור 5 דקות, 100 ואז 78% (v/v) µL מתנול עבור 15 דקות
   הערה: השלבים מכתימים ניתן לבצע על הספסל מעבדה ולא ארון Class II הביולוגי.
2. הכתם השומנים טיפות על-ידי הוספת 100 µL של טריות 0.2% (w/v) שמן-אדום O (לפרטים, ראה טבלה של חומרים) לשעה בטמפרטורת החדר.
3. הסרת כתם עודף בשטיפה של ג'לים 4 פעמים עם 100 µL של 78% (v/v) מתנול, כ רפה בעברית ומחיקת את תגובת שיקוע לאחר כל לשטיפה
4. Counterstain במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם 100 µL של Giemsa, 1:10 מדולל במים מזוקקים.
5. וארוקן את צביעת גימזה ולשטוף ג'לים פעם אחת עם מים-
6. כדי לנתק את ג'לים מהצלחת, שפת הבארות באמצעות מחט 21 G, עם שפוע גוחנת, סביב הקצוות של הג'ל.
7. כדי לטעון את ג'לים בשקופית מיקרוסקופ, אגרוף שני חורים (6.35 מ מ קוטר) רצועה 2.54 ס מ x 1.5 ס מ של סרט הדבקה דו-צדדי. לתקן את הקלטת לצד מיקרוסקופ רגיל ולהסיר ציפוי המגן מלמעלה.
   1. הוסף טיפה של מים החורים את הקלטת באמצעות פיפטה של העברה. באמצעות פינצטה, להעביר בעדינות ג'לים החורים הקלטת ואת כיסוי עם coverslip 1.5 זכוכית גודל. לחץ בעדינות על coverslip לדבוק זה הקלטת.
8. לבחון עם התערבות דיפרנציאלית ניגודיות מיקרוסקופיית בהיר-שדה באמצעות המטרה X 40 על מיקרוסקופ הפוך.
   1. הביאו טפט HUVEC להתמקד בגיל 40 X ההגדלה ואת הגלילה ' לתוך ' הג'ל, ספירת תאים מקרופאגים/קצף ברחבי העומק כולו של הג'ל. חזור על שלושה ייחודי שדות מבט ממוקם במרחקים דומה מהקצה של הג'ל על מנת לצמצם תופעות אפשריות קצה. פעולה זו תבטיח את עומק ג'ל אינו עקבי בין ספירת אזורים.
      הערה: ציון תאים הג'ל כצבעי תאי קצף (כהגדרתו תאים המכילים > 1/3 ציטופלזמה שלהם כמו שמן-אדום O צבעונית השומנים טיפות) או מקרופאגים בתוך שעתיים של הרכבה בשקופיות ( איור 2). קצף כדוריות מבוטא כאחוז מתוך תאי קצף ביחס למספר תאים שהועברו ומבוטא לפי הסעיפים החציוני ב- 3 שדות ראייה בדק עבור ג'לים 6 לכל תנאי, ולכן החציוני של מדידות 18 לכל תנאי. דוגמה של ספירת raw של ניסוי טיפוסי מוצג בטבלה מס ' 2-
      הערה: סיווג תא כמו macrophage לעומת תאי קצף על ידי מיקרוסקופ הוא סובייקטיבי, וכתוצאה מכך יכול להיות תלויי-חוקר. במחקרים קליניים, שבו מתבצעים ניסויים על פני תקופה ארוכה של זמן, חשוב עבור כל ספירה להתבצע עד חוקר יחיד. דוגמאות של קצף תאים מקרופאגים, ג'לים מסופקים באיור 2.

7. ניתוח של תאים שמדמו מאת Flow Cytometry

1. phenotypically לאפיין תאי קצף ו מקרופאגים בעקבות הגירה transendothelial, לעכל את ג'ל על-ידי הוספת µL 100 של 37 ° C prewarmed 1 מ"ג/מ"ל collagenase D מעורבבת עם M199 כדי כל טוב, תקופת דגירה של 20 דקות-37 °C/5% CO ₂.
   הערה: הנח את הצלחות 96-ובכן ישירות על מדפי מתכת נקייה בחממה כדי להבטיח אפילו חום הפצה.
2. בעקבות דגירה, macerate של ג'לים באמצעות טיפ פיפטה 200 µL, דגירה כעשרים דקות נוספות-37 °C/5% CO ₂.
3. פעם מלא מתעכל, מסנן ובריכה ג'לים שכפל מתעכל דרך 35 מיקרומטר ניילון mesh רצ'ט צינורות FACS המוטלות על קרח, לשטוף פעם עם FACS לשטוף (ראה טבלה של חומרים) ב 4 ° C, x 300 ג' Resuspend תאי µL 100 של FACS ווש
4. תקופת דגירה התאים שנוצר עם fluorophore מצומדת נוגדנים ספציפיים של CD45, סמן תא חי/מת וסמנים משטח/תאיים פנוטיפי או פונקציונליים עניין באמצעות פרוטוקולי cytometry זרימה רגילה.
   הערה: להכין שליטה צינורות לפיצוי באמצעות fluorophores המתאים Ig פיצוי חרוזים. תאים שחולצו עשוי גם להיות שנאספו על גבי זכוכית שקופיות מיקרוסקופ immunofluorescence על ידי cytospinning. לחלופין, בהצלחה שאספנו תאים באמצעות פרוטוקול זה להערכה באמצעות הדמיה cytometry זרימה.
5. לרכוש תאים באמצעות cytometer של זרימה, ולבצע פיצויים כנדרש.
   הערה: כמו קצף תאים/macrophages עלול לא בצורת אוכלוסיות נפרדות באמצעות מאפייני פיזור אור, עשויים להיות שונים במידה ניכרת בגודלם, להגדיר פיזור הבא הליברלית (FSC) ושערים פיזור (האס) בצד כדי ללכוד את כל התאים שהועברו כפי שמוצג < מחלקה חזקה = "xfig" > 3A איור.
6. בעקבות הרכישה, לבצע את ניתוח נתונים באמצעות תוכנה cytometry זרימה. כדי לזהות תאים שהועברו, בחר תחילה את התאים כמו שלילית דה מרקר חי/מת, כפי שמוצג באיור 3B. לאחר מכן, לבצע אפליה של תא בודד על-ידי יצירת שער חזק מסביב לתאים שמוצג על מגרש לעומת גובה האס האס-אזור.
7. בחר CD45 ⁺ תאים, שער האוכלוסייה הגדולים של תאים שהועברו נוכח מגרש FSC/האס כמו אלה הם תאים מקרופאגים/קצף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לכימות מונוציט גלגול

ומונוציטים נוספים למודל כמתואר באיור1, ג'לים שישה מוכנים עבור כל תנאי. ומונוציטים עבור ג'לים 6 לכל תורם (קרי, 5.0 x 10 ומונוציטים⁴ לכל ג'ל ג'ל 6 = 3.0 x 10 ומונוציטים⁵ לכל התורם) הם resuspended ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מציע שיטה רב-תכליתי פיזיולוגית רלוונטי להערכת את atherogenicity של ומונוציטים מן האנושי גדודים קליניים, על ידי שילוב של גלגול מונוציט והן קצף כדוריות. מודל זה מציע יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות להק תא קצף הוא לוקח בחשבון את השפעת מונוציט גלגול על היווצרות תאי קצף ומאפשר א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel preparation reagents
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH diluted in H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I	R&D Systems	3442-050-01	Type I Fibrous Collagen
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
M199	Life Technologies	11150-059	M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin
M20			Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC			Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells			Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA	Gibco	25300-054	0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine	Gibco	25030-081	L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122	Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum	Gibco	16010-142	New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20
0.1% TNF	Gibco	PHC3015	Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein	Merck Millipore	LP2-2MG	Low-density lipoprotein (LDL)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde	Polysciences	4018	1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides	Mikro-Glass	S41104AMK	Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips	Menzel-Gläser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape	3M Scotch	4011	Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch			Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes	BD Biosciences	352235	35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain	Life Technologies	L34959	Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash			Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
96 well plate	Nunclon	167008	Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish	TPP	93100	Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf tubes
Transfer pipette	Samco Scientific	222-20S	Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)