הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

Summary

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

Abstract

היכולות הפלישה והעברה של תאים סרטניים הם התורמים העיקריים התקדמות סרטן, מופע חוזר. מחקרים רבים בחנו את יכולות העברה ופלישה להבין איך להפיץ תאים סרטניים, במטרה לפתח אסטרטגיות טיפול חדשות. ניתוח של הבסיס תאית ומולקולרית של היכולות הללו הוביל אפיון תא ניידות ואת המאפיינים physicochemical של שלד התא, microenvironment הסלולר. במשך שנים רבות, וזמינותו קאמרית בוידן ואת וזמינותו פצע שריטה כבר הטכניקות רגיל ללמוד תא הפלישה והעברה. עם זאת, אלה שתי טכניקות יש מגבלות. וזמינותו קאמרית בוידן קשה וצורכת זמן, ויש וזמינותו פצע שריטה הפארמצבטית נמוכה. התפתחות הטכנולוגיות המודרניות, במיוחד במיקרוסקופ, הגבירה את הפארמצבטית של פצע שריטה וזמינותו. באמצעות מערכות ניתוח רב-עוצמה, מיקרוסקופ וידאו "בחממה" יכול לשמש כדי לספק וניתוח אוטומטי בזמן אמת של נדידת תאים, הפלישה. מטרת מאמר זה היא לדווח ולהשוות את מבחני שני חקר התא הפלישה והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן וטיוטה אופטימיזציה במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ פצע וזמינותו.

Introduction

תא הפלישה והעברה מעורבים להפצת תאים סרטניים, אשר מהווה את הגורם העיקרי של התנגדות טיפול¹ והוא יכול להוביל locoregional או הישנות גרורתי לאחר סרטן טיפול². המעבר אפיתל-mesenchymal (החובשים) הוא התהליך הראשוני של הפלישה-נדידת תאים שבה סרטן תאים להחליף בין אפיתל הפנוטיפ mesenchymal. E-קדהרין הוא סמן חוץ-תאי של פנוטיפ אפיתל³, ביטוי מוגבר של N-קדהרין, vimentin היא תכונה של פנוטיפ mesenchymal⁴. ההעברה תלויה גם הקיבולת מהותי של תאים סרטניים לפלוש מטריצות (ECM) דרך הפעולה של מטריקס metalloproteases⁵.

מנגנון ההעברה – הפלישה זה תואר לסרטן במקומות רבים, בפרט סרטן הראש והצוואר⁶. חוקרים רבים התמקדו תהליכי ההעברה ופלישה כדי להבין טוב יותר כיצד תאים סרטניים להפיץ בתקווה כי הידע הזה יוביל אסטרטגיות טיפול חדשות. זה הכרחי כי מחקרים אלה מבוצעות באמצעות מבחני לשחזור ואמין.

ניתוח במבחנה של תנועתיות התא יכול להיות מאתגר. שפותחה לפני שנים רבות, וזמינותו קאמרית בוידן נחשב להיות הסטנדרט עבור ניתוח הפלישה – הגירה⁷. עם זאת, זהו זמן רב והוא לעיתים קרובות לא מדויק. בדיקה נוספת היא ריפוי פצע assay⁸, אשר כרוך ביצוע שריטה על תרבות חד שכבתי תא לכידת תמונות של תא הפלישה והעברה במרווחי זמן קבועים. טכניקה זו ביקורת נרחב בגלל הווריאציות גדול בין התוצאות של שתי בדיקות רצופות. עם זאת, היישום של טכנולוגיות מודרניות, במיוחד במיקרוסקופ, השתפרה את הפארמצבטית של פצע שריטה וזמינותו. מיקרוסקופ וידאו יכול להיות בקלות הציג חממות, ניתן להפיק תמונות בזמן אמת של נדידת תאים. התקנים אלה להקליט נתונים מיקרוסקופיים, מספקים ניתוח אוטומטי של הפצע תא זרימה לאורך זמן. מטרת המאמר היא לתאר וזמינותו קאמרית בוידן ואת וזמינותו פצע שריטה ממוטבת, כדי לדון את היתרונות והחסרונות של כל גישה.

Protocol

הערה: מבחני לשכת ולגרד בוידן ללא הכללת ECM מכונים וזמינותו ההעברה, מבחני אותו באמצעות ECM נחשבת וזמינותו הפלישה.

1. בוידן קאמרית Assay

הערה: פרוטוקול זה הוא מותאם הקו תא SQ20B, אשר נגזר חוזרים ונשנים הראש, הצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC) סרטן בגרון היה המתקבלים ג'ון הקטן (בוסטון, שמימנה).

יום 1

1. תא זריעה
   1. זרע 2 10⁶ SQ20B תאי ב 12 מ של תרבות בינוני (ס מ) בקבוקון² 175 ס' ' מ 72 h לפני היום הראשון ולאפשר לתאים לגדול 80% תא הנהרות.
      1. כדי להתכונן ס מ SQ20B תאים, תוספת בינוני נשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% עגל עוברית סרום (FCS), הידרוקורטיזון 0.04 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 0.1 g/L סטרפטומיצין.
   2. תחת תא למינארי, trypsinize את התאים. להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם סליין סטרילי באגירה פוספט (PBS) ולהוסיף 2.5 מ של טריפסין ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (0.5 g/L). דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולעצור את התגובה על-ידי הוספת מ"ל של ס מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. לספור את מספר תאים באמצעות מונה התא.
   3. זרע תאי בקבוקון² 25 ס מ- צפיפות התאים של 6 10⁵ תאים עבור כל תנאי להערכה. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב- mL 3 ס מ.

יום 2

2. תא הרעבה והכנה של צ'יימברס מצופה
   1. להרעיב את התאים על-ידי החלפת את בינוני את הבקבוק. כל 3 מ"ל של בינוני נמוך-עוברית סרום שור (FBS) באמצעות 0.1% אלבומין שור (BSA) במקום FBS. להרעיב את התאים עבור 24 שעות ביממה בחממה.
      1. כדי להכין הרעבה ס"מ (s-ס"מ), תוספת DMEM עם 0.1% BSA, הידרוקורטיזון 0.04 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 0.1 g/L סטרפטומיצין.
   2. עבור ההעברה וזמינותו, עבור לשלב 1.3.
   3. על הפלישה וזמינותו, 12 שעות לפני יום 3, להכין הצ'יימברס בוידן מצופה על-ידי הוספת μL 500 ס מ- s לכל תא מצופה. השתמש בכדורי צ'יימברס בוידן מצופה ולשמור אותם ב 4 ° C לפני השימוש. למקם כל חדר בוידן בצלחת לוויה ולהגדיר אותו בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

יום 3

3. תא זריעה בבית הבליעה בוידן
   1. השתמש את הצלחת נלווה כדי להכין את chemoattractant. למלא כל אחד טוב של צלחת 24-ובכן לוויה עם 750 μL בינוני מלא עם 10% FBS, הידרוקורטיזון 0.04 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 ו- 0.1 g/L סטרפטומיצין.
      1. להתאים את chemoattractant עבור כל שורה התא ואת כל תנאי הטיפול. כדי להכין את chemoattractant ס"מ (ca-ס"מ), תוספת DMEM עם 10% FCS, הידרוקורטיזון 0.4 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 0.1 g/L סטרפטומיצין.
   2. העברה לתא העליון המשקולת לוויה שמולאו מראש, מקפיד להימנע בועות.
   3. על הפלישה וזמינותו, בזהירות הסר μL 450 ס מ בכל תא בוידן.
   4. תחת תא למינארי, trypsinize את התאים. להסיר המדיום, לשטוף את התאים עם PBS סטרילי, להוסיף 0.5 מ של טריפסין EDTA (0.5 g/L) ולאחר מכן דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C. לעצור את התגובה על ידי הוספת ס מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. לספור את מספר תאים באמצעות מונה התא.
   5. הזרע 3 10⁴ SQ20B תאים μL 500 של 0.1% BSA בינוני, נותן לדילול הסופי של 6 10⁴ תאים/מ ל....
      הערה: ריכוז התא צריך להתאים עבור כל קו תא.
   6. מקם את הצלחת לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.

יום 4

4. קיבוע תא ולא מכתים
   1. לתקן את התאים לפני הזמן ההכפלה ספציפי לשורה הזו התא. לתקן תאים SQ20B לפני 24 שעות.
   2. הסר כל מהצלחת לוויה, הסר בזהירות את התאים מהתא העליון באמצעות מקלון צמר גפן. זה חשוב במיוחד להסיר את כל התאים ממוקם בחדר העליון.
   3. תיקון, הכתם הכנס בנפרד כדי להשיג מאי-גרונוולד Giemsa הגיוון⁹ באמצעות ערכת מכתימים מסופקים. לחלופין, השתמש 4% paraformaldehyde בצלחת לוויה נוספת עבור אובססיה 30 דקות.
   4. שמור את הכיסויים צלחת ריקה לוויה 24-ובכן תחת ברדס מעבדה להתייבש כל תא.

יום 5

5. ניתוח מיקרוסקופי
   1. הכנס את הצלחת לוויה עם התוספות על גבי מיקרוסקופ ניגודיות שלב 20 ולספור כל תא שהועברו על החלק התחתון של הקרום. למטב את מיקום המוקד הנכון על-ידי הזזת המטרה מלמטה למעלה, ולהפסיק את המיקום על החלק התחתון של הקרום.
   2. לחשב את היחס בין המספרים של תאים שהועברו ותאים הזריעה. חזור על כל ספירה עבור כל תנאי הטיפול דולר.

2. לגרד פצע Assay: נדידת תאים

הערה: ההוראות חייב להיות מותאם לכל סוג של תא.

יום 1

1. תא זריעה
   1. זרע 2 x 10⁶ SQ20B תאים ב- mL 12 ס מ בבקבוקון² 175 ס' ' מ 72 h לפני היום הראשון ולאפשר לתאים לגדול 80% תא הנהרות.
   2. תחת תא למינארי, trypsinize את התאים. להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS סטרילי, להוסיף 2.5 מ של טריפסין EDTA (0.5 g/L), דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C. לעצור את התגובה על-ידי הוספת מ"ל של ס מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. לספור את מספר תאים באמצעות מונה התא.
   3. ליצור מדגם prediluted-צפיפות התאים של 4 x 10⁵/mL, נותן צפיפות הסופי של 4 10 תאים⁴ לכל μL 100 לכל היטב. ריכוז זה חייב להיות מותאם עבור כל קו תא, צריך להיות בטווח של 1 x 10⁴ 6 10⁴ תאים.
   4. תאי הזרע לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן, על ידי הפקדת μL 100 של הפתרון המוכן בשלב 2.1.2.
   5. להשאיר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפזר את התאים באופן שווה על החלק התחתון של הבארות.
   6. למקם את הצלחת לתוך החממה ולאפשר את התאים לדבוק הצלחת. בשביל h 12 עד 16 (מכסימום) ב 37 º C.

יום 2

2. לגרד פצע assay
   1. להסיר את הלוחות המוכנים בשלב 2.1 מן החממה.
   2. מתחת למכסה המנוע, להפוך פצע באמצעות המכשיר wounding מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
   3. להסיר לאלתר את המדיום של כל טוב באמצעות פיפטה עם טיפ חרוט מותאם, מטפל לא לגעת את הפצע.
   4. לשטוף את התאים פעמיים על-ידי חזרה על השאיפה ושימוש μL 100 ס"מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס במשך כל.
   5. הסר את ס מ באמצעות פיפטה עם טיפ חרוט מותאם אחרי השלבים כביסה.
   6. להוסיף 100 μL בינוני ספציפיות עבור כל תנאי הטיפול בכל טוב.
   7. נסו להימנע מיצירת בועות בתוך הבארות. בטכניקה הפוכה-pipetting עשוי להיות שימושי כאן. לחלופין, להסיר בועות עם מחט מזרק.
   8. מקם את הצלחת לתוך המדף מותאם של מיקרוסקופ וידאו.
   9. כדי לשפר את איכות התמונה, לאפשר את הצלחת לחמם למשך לפחות 15 דקות לפני הסריקה הראשונה כדי למנוע עיבוי בצדו התחתון של הלוח.
   10. תוכנית לוח הזמנים של סריקות, שימוש בתוכנה מיקרוסקופ וידאו-תמונה אחת לכל טוב. מרווח זמן מירבי 2-h נדרש ניסוי הפלישה-העברה. אם מטרת הניסוי להפיק סרטון, בהפרשים של מקסימום 30 דקות היא עדיפה.
   11. בסוף הניסוי, לשטוף את המכשיר wounding בקפידה, בצע את כל השלבים כביסה ארבע שציין היצרן.

ימים 3, 4 ו-5

3. ניתוח של העברה באמצעות מיקרוסקופ וידאו
   1. עבור שהייה של 24 שעות ו עד 5 ימים, לפקח ולבדוק את נדידת תאים.
   2. להשתמש במסיכת תאים מתאים המותאמים לכל סוג התא כדי לנתח נדידת תאים. כדי להשיג מסכה תא הותאם עבור כל קו תא, ליצור תא עיבוד הגדרה מתוך התוכנה באמצעות אוסף תמונות תאים מסוים.
   3. לאתר. את העקומות ולייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני, אשר ניתן להשתמש כדי לנתח ולהשוות את התוצאות.

3. לגרד פצע Assay: הפלישה תא

הערה: ההוראות חייב להיות מותאם לכל סוג של תא.

יום 1

1. תא זריעה
   1. השתמש באותו הפרוטוקול עבור תא זריעה כפי שמתואר בשלב 2.1.

יום 2

2. הכנת את ה-ECM
   1. מפשירים את מטריצת לפחות 12 שעות לפני השימוש ב- 4 מעלות צלזיוס. ודא כי אין אגרגטים גלויים. אם אגרגטים גלויים, לשמור המטריצה ב 4 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן ארוך עד מצרפי להיעלם. שמור את המטריקס על קרח. השתמש בעצות פיפטה precooled.
      הערה: המטריקס יחזק את אם לא שמרו ב 4 º C.
   2. מקררים הצינורות microcentrifuge בקרח במשך 5 דקות.
   3. קח ס מ מקורר עד 4 ° C מהמקרר, לדלל את המטריצה את החצוצרות שלה precooled microcentrifuge בריכוז הסופי של 300 μg/mL.
   4. לחזור הצינורות microcentrifuge עם מטריקס prediluted המקרר ב 4 º C.
      הערה: מתלה קירור מותאם microcentrifuge צינורות מועיל לשמירה על הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל הניסוי.

יום 2

3. פצע שריטה Assay וטיפול ה-ECM
   1. הסר את לוחית מוכן בשלב 3.1 מן החממה.
   2. מתחת למכסה המנוע, להפוך את הפצע באמצעות המכשיר wounding מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
   3. להסיר לאלתר את המדיום של כל טוב באמצעות פיפטה עם טיפ חרוט מותאם מטפל לא לגעת את הפצע.
   4. לשטוף את התאים פעמיים על-ידי חזרה על נוהל השאיפה ושימוש μL 100 ס"מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
   5. לאחר לשטוף את השניה, מניחים את הצלחת על החממה 4 ° C כדי equilibrate את הטמפרטורה שלו במשך 5 דקות.
   6. הסר את המדיום קר מכל קידוח עם פיפטה השאיפה עם טיפ חרוט, מטפל פיפטה בקפידה מהקצה וכדי להימנע מלגעת הפצע.
   7. להוסיף 50 μL של מטריקס prediluted מכל קידוח באמצעות טיפים חרוט precooled ב 4 º C.
   8. מקם את הצלחת בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: מתלה prewarmed תמיכה ב 37 מעלות צלזיוס שימושי להאיץ את ההתחממות של צלחת 96-ובכן.
   9. הסר את הלוחית של החממה ולהוסיף μL 100 ס"מ להתאים כל טוב כפי שמצוין עבור כל תנאי הטיפול.
   10. נסו להימנע מיצירת בועות בתוך הבארות. בטכניקה הפוכה-pipetting עשוי להיות שימושי כאן. לחלופין, להסיר בועות עם מחט מזרק.
   11. מקם את הצלחת לתוך המדף מותאם במיקרוסקופ וידאו.
   12. כדי לשפר את איכות התמונה, לאפשר את הצלחת לחמם למשך לפחות 15 דקות לפני הסריקה הראשונה כדי למנוע עיבוי בצדו התחתון של הלוח.
   13. לתכנת את לוח הזמנים של סריקות, שימוש בתוכנה מיקרוסקופ וידאו-תמונה אחת לכל טוב, במצב סריקה לגרד פצע. מרווח זמן מירבי 2-h בנדרש עבור ניסוי הפלישה-העברה. אם מטרת הניסוי להפיק סרטון, בהפרשים של מקסימום 30 דקות היא עדיפה.
   14. בסוף הניסוי, לשטוף את המכשיר wounding בקפידה, בצע את כל השלבים כביסה ארבע שציין היצרן.

ימים 3, 4 ו-5

4. ניתוח של הפלישה התא באמצעות מיקרוסקופ וידאו.
   1. חזור על שלב 2.3.

תוצאות

. מדווחים כאן שתי שיטות שונות כדי לנתח תא הפלישה והעברה. איור 1 מציג בוידן קאמרית הניסוי. התוספות ממוקמים בתוך צלחת לוויה chemoattractant בינונית, התאים הם נזרע בס מ. הקרום יכול להיות ניטראלית (העברה assay) או מצופה (הפלישה assay). התאים הם נזרע לתא העליון ב- s-ס"מ. תא תחתון ...

Discussion

. מדווחים כאן שתי שיטות שונות ללמוד הפלישה תא את תהליך ההעברה. הניתוח של תהליך זה חשוב להבנת הגורמים המעורבים הישנות גרורתי, אשר יכול להיות מוסבר על ידי תנועתיות מוגברת subpopulation של תאים סרטניים נקרא סרטן בתאי גזע^10,11.

הניסוי קאמרית בוידן היא אחת ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	-
Wound Maker	Essen Bioscience	4494	Store in safe and dry place
96-well ImageLock Plate	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F System with CoolSink 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox with M30 System	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden Insert	Dominique Dutcher	353097
Boyden Coated Insert	Dominique Dutcher	354483	Store at -20 °C
Companion 24-well Plate	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel standard	BD BioScience	BD 354234	Store at -20°C.
RAL 555 Staining Kit	RAL Diagnostics	361550	Store in safe and dry place
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	33511