מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לנתק את ותרבות osteoclasts במבחנה ממח העצם העכבר, וכדי ללמוד את התפקיד של מטרת מידע יונקים/מכניסטית rapamycin 1 מורכבים במבנה אוסטאוקלסט.

Abstract

Osteoclasts הם ייחודיים עצם-resorbing תאים כי להבדיל מן השושלת מונוציט/מקרופאג של מח העצם. תפקוד לקוי של osteoclasts עלולה לגרום לסדרה של מחלות מטבוליות העצם, כולל אוסטיאופורוזיס. כדי לפתח מטרות תרופות למניעת איבוד מסת העצם פתולוגי, יש להבין את המנגנונים שבאמצעותו osteoclasts להבדיל סימנים מקדימים. היכולת לבודד תרבות מספר גדול של osteoclasts במבחנה הוא קריטי על מנת לקבוע את התפקיד של גנים ספציפיים אוסטאוקלסט בידול. איון של מטרת מידע יונקים/מכניסטית rapamycin מורכבים 1 (TORC1) של osteoclasts יכולים להקטין את מספר אוסטאוקלסט ולהגדיל את מסת העצם; עם זאת, המנגנון הבסיסי דורש מחקר נוסף. במחקר הנוכחי, פרוטוקול מבוסס רנקל לבודד, תרבות osteoclasts ממח העצם העכבר וכדי ללמוד את ההשפעה של איון mTORC1 על היווצרות אוסטאוקלסט מתואר. פרוטוקול זה הביא בהצלחה מספר רב של osteoclasts ענק, בדרך כלל תוך שבוע אחד. מחיקה של Raptor לקוי אוסטאוקלסט היווצרות וירידה הפעילות של הפרשה פוספטאז חומצה tartrate עמידים, המציין שאת mTORC1 הזה הוא קריטי עבור אוסטאוקלסט היווצרות.

Introduction

עצם הוא איבר המשתנה, היא שופצה על ידי תאי העצם osteoclasts לאורך החיים. Osteoclasts אחראים על בסיס מינרלים מן מטריקס resorption ותאי העצם לסנתז להפריש עצם חדש מטריצות¹. האיזון בין ספיגת עצם היווצרות העצם היא חיונית לבריאות העצם כולל תחזוקה של העצם מסה ו בתגובה לגירוי ופציעה. אם איזון זה מופרת, סדרה של מחלות מטבוליות העצם עלולה להתרחש, כולל אוסטאופורוזיס ומחלות חניכיים. במחלות אלה, אובדן מסת עצם הנובע ספיגת עצם osteoclastic חורג העצם ויוצרים קיבולת של תאי העצם^2,3. לכן, על מנת לפתח מטרות התרופות לטיפול בהפרעות השלד כגון אוסטיאופורוזיס, זה קריטי להבין את הדור ואת הביולוגיה של osteoclasts⁴.

Osteoclasts הם ייחודיים תאים multinucleated ענק הממוקם ליד או על פני עצם, שייך מונוציט/מקרופאג משפחה¹. Ibbotson ק. י. ואח דיווח שיטה ליצירת תאים דמויי אוסטאוקלסט במבחנה בינונית המכיל 1,25-dihydroxy-ויטמין D3⁵. זיהוי גורם מגרה מקרופאג-המושבה (M-CSF), קולטן activator עבור הפקטור הגרעיני-κ B ליגנד (רנקל) כגורמים חיוני היווצרות אוסטאוקלסט גדל באופן דרמטי את היעילות של osteoclastogenesis חוץ גופית בתוך ^{1 , 6 , 7}. יכולת התרבות osteoclasts במבחנה השתפרה ההבנה שלנו של הדור וויסות של osteoclasts.

המטרה מידע יונקים/מכניסטית של פונקציות rapamycin (mTOR) שני מתחמי מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית ברורים, כלומר mTORC1 ו- mTORC2^8,9. שני מתחמי חלבון רב נפרדים אחד מהשני בשל מרכיבים שונים ותערובות במורד הזרם שלהם. mTORC1 מכיל חלבון רגולטורי הקשורים ייחודי של mTOR (בז), בעוד mTORC2 מכיל ובת לוויתו rapamycin-רגישות של mTOR (Rictor)⁹. mTORC1 ניתן לשלב ולשדר אותות חשוב לווסת צמיחת תאים, התפשטות ובידול. לאחרונה, להדגים שאת mTORC1 ממלא תפקיד מרכזי ברשת של ספיגת עצם קטבולי על-ידי מחיקה של Raptor בטל mTORC1 osteoclasts¹⁰. עם זאת, המנגנון הבסיסי דורש מחקר נוסף. במחקר הנוכחי, שיטה המבוססת על רנקל osteoclastogenic שימש לייצר osteoclasts הנגזרות מח עצם מקרופאגים (BMMs) של פראי-סוג (WT) ועכברים ראפ^Ctsk , כדי לחקור את ההשפעה של איון mTORC1 על אוסטאוקלסט צורה.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים החיות בוצעו לפי הפרוטוקול שאושרו על-ידי הפאנל ניהול סטנפורד על טיפול חיות מעבדה (APLAC), אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של שנגחאי המכון לביוכימיה, תא ביולוגיה.

1. הכנה

1. צור אוסטאוקלסט ספציפי ראפטור מחיקה עכברים (ראפטור^{חליל/חליל}; Ctsk-cre, מכאן והלאה ראפ^Ctsk) על ידי הזדווגות ראפטור^{חליל/חליל} עכברים עם עכברים Ctsk-cre . השתמש העכברים ראפטור^{חליל/חליל} של הפקד WT במחקר זה.
2. יש מיכל עם קרח כדי לשמור על העצם המבודד.
3. להכין את תרבות בינוני.
   1. הכן α-מ תרבות בינוני על ידי שכשהם המינימום חיוני בינוני אלפא (α-מ) עם 1 x גלוטמין פניצילין-סטרפטומיצין, סרום עגל עוברית 10%.
   2. להכין את מח העצם מקרופאג אינדוקציה בינוני בהיקף של 50 מ של α-מ בינוני ו- M-CSF-20 ng/mL.
   3. להכין אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני המורכב מ- CSF ו רנקל ב 20 ng/mL, בהתאמה, ב- 50 מ של α-מ בינוני.
4. להכין המאגרים הבאים לפני צביעת מלכודת.
   1. להכין פתרון בהיקף של 6.5 מ של אצטון, 2.5 מ של פתרון ציטראט ו- 0.8 מ של 37% פורמלדהיד (vol/כרך) פתרון.
   2. להכין מלכודת מכתים פתרון.
      1. Prewarm מים יונים 37 מעלות צלזיוס.
      2. להוסיף 100 µL של גארנט מהר פתרון בסיס מסויימות, 100 µL של נתרן חנקיתי פתרון microtube 1.5-mL ומערבבים על ידי היפוך עדין רשות ס' 30 לתערובת לעמוד למשך 2 דקות.
      3. Prewarm 9 מ של מים יונים 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 200 µL בפתרון מסויימות diazotized מהיר גארנט בסיס מהשלב 1.4.2.2, µL 100 של פתרון פוספט naphthol AS-BI, µL 400 של אצטט פתרון µL 200 tartrate פתרון.
      4. לשמור את המלכודת מכתים תערובת פתרון באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
5. הכנת המאגר הבאים לפני מלכודת כימות פעילות של תרבות בינוני.
   1. הכנת מאגר tartrate (50 מ"ל): 2 מ ל חומצה L טרטרית 0.33 מ', מ 48 ל ז 0.33 tartrate נתרן dibasic מייבשים. התאם את ערך ה-pH 4.9.
   2. להכין 4-Nitrophenyl פוספט ניתרן (pNPP) מאגר (200 מ"ל): g 1.502 של גליצין, 41 מ ג של MgCl₂, 27.2 מ ג של ZnCl₂ו- 180 מ ל מים יונים. להתאים את ערך ה-pH 10.4 עם 3 M NaOH לאמצעי האחסון 200 מ ל מים יונים.
   3. הכנת מאגר pNPP עם סובסטרט פוספטאז (עבור לוח 96-ובכן אחד): מ ג 49.37 פוספטאז המצע ו- 175 µL pNPP מאגר של צעד 1.5.2.
   4. הכנת מאגר המצע (9 מ ל/96-ובכן צלחת): 6.24 מ של מים יונים, μL 360 של אצטט פתרון, mL 2.4 tartrate המאגר. לערבב על ידי מערבולת, מחממים ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
   5. להוסיף μL 90 pNPP מאגר עם substrate(1.5.3) פוספטאז 9 מ של טרופה המצע buffer(1.5.4) כדי להפוך את התערובת המצע מערבולת 10 s.

2. ניתוח (יום-1)

1. המתת חסד 3 בן חודש אחד נקבה WT ו ראפ^Ctsk עכברים ב- CO₂ בנפרד. לבצע אינהלציה₂ CO עם הציוד המתאים על ידי צוות מיומן.
2. לטבול 6 עכברים בתוך גביע עם 100 מ של 75% אתנול (vol/כרך) עבור 5 דקות כדי למנוע זיהום חיידקי ולאחר מכן מניחים על קרש חיתוך במצב פרקדן. אעשה חתך-הדיסטלי של עצם השוקה אנכית ומנתחים את העור לאורך האיבר הינד במספריים אופטלמולוגיות.
3. לחתוך רצועה במפרק של מפרק הירך עם מספריים, לנקוע את הגפיים האחוריות מתא המטען.
4. לחתוך ברצועה במפרק הברך ולהתנער בקפידה על שוקה ועל עצם הירך של הברך. הסר בעדינות את הרקמות הרכות עם מספריים.
5. מקום שכל העצמות של גנוטיפ אחד של עכבר אחד כל טוב של שש-ובכן-צלחת עם 2 מ של α-מ על קרח.
   הערה: כדי לשמר את הכדאיות תא, העצם יש לשמור בתנאים אלו עבור פחות מ 1 h.

3. בידוד (יום-1)

1. למלא אחד טוב של צלחת 6-ובכן עם 75% אתנול (3 מ ל) ואת הבארות אחרים 5 α-מ בינוני (3 מ ל).
2. לשים בכל עצמות גנוטיפ אחת בכביסה אתנול עצמות s ושטיפת 15 5 פעמים עם α-מ בינוני 10 s בכל פעם.
3. לחתוך את epiphyses עם מספריים והכנס מחט מזרק 0.45 מ מ לתוך חלל, סומק מח העצם החוצה עם α-מ בינוני לתוך שפופרת צנטרפוגה 50-mL.
4. לשטוף את חלל העצם באמצעות אותה שיטה מהקצה השני של העצם. חזור על פחות פעמיים כדי לשטוף את חלל העצם ביסודיות עד העצם היא חיוורת.
5. Centrifuge מח העצם כדי להשיג גלולה תא ב 800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע.
6. להוסיף 3 מ"ל של מאגר פירוק תאי הדם האדומים לתוך צנטריפוגה שפופרת ואת פיפטה בעדינות כדי resuspend מח העצם. שמור את הצינור צנטריפוגה בקרח במשך 8 דקות lyse כדוריות דם אדומות.
7. להוסיף 6 מ של α-מ בינוני לתוך הצינור צנטריפוגה כדי לעצור את פירוק התא. צנטריפוגה-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
8. Resuspend ב 3 מ"ל של α-מ תרבות בינוני ומניחים את התאים על פלטה 6-טוב (בדרך כלל אחד עכבר לכל טוב).
9. דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה₂ CO 5% בין לילה.

4. ציפוי (יום 0)

1. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. לאיסוף תאי כעיגולים בצבע למחרת בבוקר.
2. צנטריפוגה-800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
3. Resuspend ב 4 מ של α-מ תרבות בינוני.
4. . קח 20 µL של הפתרון תא ומערבבים עם 20 µL של Trypan Blue. להוסיף 10 µL של התערובת לחדר הספירה והשג את ספירת התאים לכל מ של פתרון.
5. הוסף אמצעי אחסון המתאים של α-מ בינוני התרבות כדי להשיג פתרון תא של תאים למ"ל 500,000.
6. להוסיף 500 µL ו- µL 50 של מח העצם מקרופאג אינדוקציה בינוני לבאר כל צלחת 24-טוב ואת צלחת 96-ובכן, בהתאמה.
7. להוסיף 500 µL ו- µL 50 של פתרון תא לבאר כל צלחת 24-טוב ואת צלחת 96-ובכן, בהתאמה.
8. דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה₂ CO 5% במשך 3 ימים.

5. בידול (3-7 ימים)

1. שלושה ימים לאחר ציפוי, לאסוף 50 בינוני µL מכל קידוח של 96-ובכן-הצלחת להקפיא ב-20 ° C ו ואז האחות המדיום שיורית.
2. להוסיף 1 מ"ל ו 100 µL אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני לבאר כל צלחת 24-ובכן, צלחת 96-ובכן, בהתאמה.
3. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
4. לאסוף 50 µL בינוני מכל קידוח, תשאף המדיום שיורית.
5. הוסף אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני כל טוב.
6. דגירה ב 37 ° C עבור יום אחד.
   הערה: בשלב זה הזמן ', osteoclasts גדול, multinucleated צריך ניתן לראות תחת מיקרוסקופ הפוכה (איור 2 א).
7. אם לא ראיתי את osteoclasts, לשנות את המדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט ולצפות מדי יום עד osteoclasts הם ראו.
8. לאסוף 50 µL בינוני מכל קידוח של צלחת 96-ובכן אחרי osteoclasts יצרו.

6. tartrate מכתים עמיד חומצה פוספטאז (השמנה)

הערה: בוגרת osteoclasts עשוי להיות נוכח לאחר 6-7 ימים של in vitro לקשרי תרבות (שלב 4).

1. האחות בינוני, לשטוף בעדינות 3 פעמים עם 1 x PBS.
2. לתקן את התאים היטב כל צלחת 96-ובכן עם 100 µL של פתרון עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
3. לאחר קיבוע, וארוקן את הפתרון ולשטוף בעדינות 3 פעמים עם מים יונים prewarmed ל- 37 מעלות צלזיוס. האחות מים יונים.
4. להוסיף 100 µL של מלכודת כתם לבאר כל צלחת 96-ובכן ולמקם את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, מגן מפני אור.
5. לאחר צביעת, וארוקן את הכתם מלכודת ולשטוף בעדינות 3 פעמים עם מים יונים.
6. התמונה osteoclasts באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ב 40 X הגדלה.

7. מלכודת כימות פעילות של תרבות בינוני

1. לאסוף את התרבות µL 30 supernatant מכל קידוח של צלחת 96-ובכן משלב 5.1, 5.4 ו- 5.8; השתמש µL 30 שאינו תרבותי אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני של הפקד שלילי. מקם את הדגימות צלחת 96-ובכן חדשה.
2. הוסף μL 90 של המצע mixture(1.5.5) לבאר כל צלחת 96-ובכן.
3. מקם את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C 1 h, מגן מפני אור.
4. לעצור את התגובה על ידי הוספת µL 50 של 3 M NaOH לבאר כל צלחת 96-ובכן.
5. למדוד את theabsorbance-אורך הגל של 405 ננומטר.

8. המערבי סופג

הערה: על אחרי 6-7 ימים של in vitro לקשרי תרבות בצלחת 24-ובכן, בוגרת osteoclasts צריך להיות גלוי.

1. האחות של המדיום.
2. לשטוף בעדינות עם טרום מקורר 1 x PBS 3 פעמים.
3. האחות PBS.
4. להוסיף 100 µL 1 x מרחביות פירוק מאגר המכיל פרוטאז מעכב קוקטייל.
5. חום lysates ב 105 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, צנטריפוגה-12,000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לאסוף את supernatants המכיל חלבונים.
6. להפריד את lysates המכילה 30 µg של חלבונים על-ידי 10% מרחביות-דף¹¹ ולאחר מכן להעביר את קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene.
7. לחסום את הקרומים עם 5% חלב דל שומן למשך 30 דקות.
8. דגירה בקרום עם הראפטור אנטי אנטי-P-S6, אנטי-S6, אנטי-β-אקטין-דילול 1:1,000 בחלב דל שומן 5% ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
9. לשטוף את הקרומים עם טריס Buffered מלוחים עם Tween-20 (TBST) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
10. חזור על שלב 8.9 פעמיים.
11. דגירה בקרום עם חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים IgG אנטי עכבר או ארנב-דילול 1:5,000 בחלב דל שומן 5% לשעה בטמפרטורת החדר.
12. לשטוף את הקרומים 3 פעמים עם TBST 10 דקות בטמפרטורת החדר.
13. לצורך זיהוי chemiluminescent, להוסיף המצע HRP chemiluminescent המערבי על הממברנות, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. לרוקן את המצע עודף ולחשוף את שהכלים לסרט צילום רנטגן.

תוצאות

משתמש בפרוטוקול הנוכחי, מספר גדול של osteoclasts ענק נראו ביום 6; אם osteoclasts ענק לא נראים, יום נוסף של בידול אוסטאוקלסט ייתכן צורך (איור 1). אוסטאוקלסט מוצלחת היווצרות אושר ע י מלכודת מכתים (איור 2 א). Osteoclasts היו ענקיים-יין אדום/סגול תאים עם גרעינים יו?...

Discussion

הבדיקה osteoclastogenic היא השיטה הנפוצה ביותר כדי לבודד את תרבות osteoclasts במבחנה^12,13. בעוד מספר inductions מבוססי רנקל אוסטאוקלסט כבר מתואר^13,14,15, המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול עם כמה שיפורים בהתבסס על השיטות הקודמות.

...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Raptorfl/fl mice	The Jackson Laboratory	013188
Ctsk-cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM	Corning	10-022-CVR
Glutamine	Gibico	25030081
Penicillin streptomycin	Gibico	15140122
Fetal calf serum	BioInd	04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein	R&D	Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein	R&D	Q3TWY5
RBC lysis buffer	Beyotime	C3702
Trypan blue	Sigma-Aldrich	302643
Acetone	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution	Sigma-Aldrich	915
Formaldehyde solution	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution	Sigma-Aldrich	3872
Sodium Nitrite Solution	Sigma-Aldrich	914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution	Sigma-Aldrich	3871
Acetate solution	Sigma-Aldrich	3863
Tartrate solution	Sigma-Aldrich	3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Corning	21-031-CVR
L-tartaric acid	Sigma-Aldrich	251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate	Sigma-Aldrich	s4797
Glycine	Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate	Sigma-Aldrich	P4744
anti-Raptor	Cell Signaling Technology	2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)	Cell Signaling Technology	2317
anti-ribosomal protein S6	Cell Signaling Technology	2211
anti-β-actin	Santa Cruz Biotechnology	sc-130300
37% formaldehyde	Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)	Millipore	00000367MSDS
IX71	Olympus
Envision	Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep