JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את טכניקות שונות הדרושות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים כולל צביעת שלילי, חלוקתה ודק במיוחד עבור מבנה נתונים היסטוריים, חיסונית-זהב labelling כדי לקבוע את המיקום של חלבונים ספציפיים ב- exosomes.

Abstract

Exosomes בגודל ננו שלפוחית חוץ-תאית מופרש על ידי נוזלי הגוף, ידועים כדי לייצג את המאפיינים של תאים מפרישים אותם. התכנים ואת המורפולוגיה של השלפוחיות המוגלתיות המופרש לשקף בהתנהגות התא או מצב פיזיולוגי, לדוגמה צמיחת תאים, הגירה, המחשוף ומוות. התפקיד של exosomes תלויה מאוד בגודל, הגודל של exosomes משתנה בין 30 ל- 300 ננומטר. השיטה הנפוצה ביותר עבור הדמיה exosome הוא מכתים שלילי, ואילו תוצאות אחרות מבוססות על מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה-הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי. המורפולוגיה של exosome טיפוסי העריך דרך מכתים שלילי גביע-צורה, אבל עוד יותר פרטים עדיין אינן ברורות. מאופיין היטב באמצעות לימוד המבנית exosome הוא הכרחי במיוחד בתחומים הרפואי ובתחום הרוקחות. לכן, מורפולוגיה תלוית פונקציה צריך להיות מאומת על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים טכניקות כגון תיוג חלבון מסוים במבנה נתונים היסטוריים של exosome. להתבונן מבנה נתונים היסטוריים, הושוו תמונות משרטוטי זגוגית ותמונות מוכתם השלילי של exosomes. ב פרוטוקול זה, אנו מציעים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים עבור ההדמיה של exosomes כולל צביעת שלילי, מכתים חיסונית הר שלמה, הכנה בלוק, מקטע דק, וסימון חיסונית-זהב.

Introduction

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם השומנים bilayer שלפוחית מופרש על ידי תאי, גודלם נע בין 30 עד 300 ננומטר. EVs דווחו לראשונה בשנת 1978 עם עדויות שלפוחית של חולים עם מחלת הודג'קין1. שלפוחית אלה דווחו להיות 40 עד 120 ננומטר בגודלם. בשנת 1980, נמסר EVs מעורבים פקקת, היווצרות קריש דם בתוך כלי דם סרטן המטופלים2ומערכת קרישת הדם. אחרי 30 שנה, EVs דווחו להיות גורם חשוב לקדם את הגידול הפלישה, הבריחה מחוסן ואנגיוגנזה3. בנוסף, הפונקציות של EVs נחקרו כמבקרי באינטראקציה תאית בתחומים של דלקת, הפרעות המערכת החיסונית, מחלות נוירולוגיות סרטן4. EVs מכילות מולקולות ספציפיות כגון חלבון, mRNA microRNA5, שלהם פוטנציאל היישום אבחון ו הרפוי מאז שנותחה6,7. EVs הם קטגוריה מורכבת של קבוצות כולל exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes ו exosome דמויי שלפוחית, בהתאם מקור הסלולר שלהם פונקציה ביולוגית3. בנוסף, על סמך להן שלהם, EVs אלה ניתן לחלק שלפוחיות זעירות (שלפוחיות זעירות לסככה, nm 100-1000) ו- exosomes (30-300 ננומטר)8,9. בין אלה, exosome דווחה מתקשרת תא התגובה החיסונית10,11,סרטן12של מחלה זיהומית13.

עניין exosomes כמו סמן לאבחון מוקדם גדלה במהירות, לטיהור ודה -אפיון של exosomes חייב להיות מלווה עם טכניקות הדמיה מולקולרית. גדלים מורפולוגיות של exosomes, בהתאם שלהם מוצא ותפקוד14, ניתן להבחין על ידי טכניקות במיקרוסקופ עם רזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. רוב exosomes היו דמיינו ידי שלילי מוכתם הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)15,16,17, תוצאות אלה שאושרו על-ידי immunolabeling של חלבון ספציפי ב הר כל שלפוחית 18. מספר קבוצות המחקר דיווחו על המבנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי19,20, הקפאה-TEM21,22. עם זאת, ואילו טכניקות אלה שימושיים עבור לימוד מבנה exosome, הם אינם מספיקים להתבוננות המיקום של חלבונים ספציפיים הממוקם בתוך exosome. לכן, הצגנו פרוטוקול הדמיה exosomes עם תוויות של חלבון ספציפי. אנחנו מוחלים בלוק הכנה, חלוקתה ודק במיוחד ו immunostaining עבור ברור מיקום מפורט של החלבון exosome. זה היה לעומת מכתים שלילי ואת כל הר immunostaining, המשמש באופן מסורתי אפיון exosome.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. גוש הכנה, חלוקתה, צביעת והדמיה של Exosome

  1. גלולה את exosomes של תגובת שיקוע התרבות של תאים HCT116 על ידי צנטריפוגה-g 100,000 x עבור 1.5 h23. להסיר את התרבות supernatant ולתקן בזהירות בגדר מטוהרים exosome עם 1 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד בפתרון 0.1 M נתרן cacodylate (pH 7.0) עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. עבור 0.1 M נתרן cacodylate, להמיס חומצה cacodylic 4.28 g 160 מ ל מים מזוקקים (DW). להתאים את ה-pH ל 7.4 עם 0.1 M HCl ואז להפוך עד 200 מ ל מים מזוקקים.
  2. הסרת מקבע את ולשטוף את כדורי עם 1 מ ל 0.1 M נתרן cacodylate מאגר בטמפרטורת החדר. אני חוזר שלוש פעמים עם כל שינוי שנמשך 10 דקות.
  3. פוסט-לתקן את הדגימות עם 1 מ"ל של 2% אוסמיום ארבע-חמצני עבור 1 h-4 מעלות צלזיוס.
  4. הסר את מקבע ולאחר שטיפה שלוש פעמים עם 0.1 M נתרן cacodylate מאגר כל 10 דקות.
  5. תקופת דגירה של 10 דקות עם סדרה מדורגת אצטון (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, בהתאמה) על ניעור.
  6. הסר אצטון, דגירה הפתרון של תערובת ההטבעה צמיגות אצטון 3:1: נמוך למשך 30 דקות. בגדר exosome יש במבחנה.
  7. להסיר את המדיום, להוסיף 1:1 אצטון: נמוך צמיגות בינונית תערובת ההטבעה ולאחר מכן תקופת דגירה של 30 דקות.
  8. להסיר את המדיום, להוסיף 1:3 אצטון: נמוך צמיגות בינונית תערובת ההטבעה ולאחר מכן תקופת דגירה של 30 דקות.
  9. להסיר את המדיום ולהוסיף 100% נמוך צמיגות הטבעה תערובת דגירה ללילה בטמפרטורת החדר.
  10. להטביע את הדגימה טהור צמיגות נמוכה הטבעה תערובת שימוש ההטבעה כייר ואופים במשך 24 שעות ביממה ב- 65 מעלות צלזיוס.
  11. להכין סעיפים 60 ננומטר בעובי דרך אולטרה-מיקרוטום.
  12. זוגיות-הכתם עם 2% אצטט uranyl עבור 20 דקות ולהוביל ציטראט למשך 10 דקות.
    הפתרון המוביל ריינולדס, להוסיף 1.33 גרם של חנקת עופרת ו- g 1.76 של סודיום ציטרט סך של 50 mL מזוקקים מים.
  13. לבחון את הרשת תחת מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 80 kV.
  14. לחץ על לחצן "ייבוא" ולאחר מכן לחץ על "קובץ", "שמור כמו" במערכת מצלמת CCD תחת המיקרוסקופ אלקטרון 80 kV. עקבו אחר הגדרות אוטומטית זמן החשיפה.

2. חיסונית מכתים סעיפים ו הדמיה (איור 1)

  1. חתך 60 ננומטר ודק במיוחד סעיפים באמצעות של אולטרה-מיקרוטום, ולאסוף ברשת ניקל.
  2. דגירה רשתות ב 50 טיפות µL של גליצין מ' 0.02 נקודות 10 דקות להרוות קבוצות אלדהיד חופשית.
  3. שוטפים ב- 100 μL של DW שלוש פעמים כל אחד עבור 10 דקות Incubate בטמפרטורת החדר במשך 1 h ב- PBS המכיל 1% BSA.
  4. תקופת דגירה רשתות ב 50-100 µL טיפות אנטי KRS נוגדן24 (בטחונות ב- PBS המכיל 0.1% BSA) של h 1 (אם יש צורך, שלב זה צריך להתבצע ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.)
  5. רחץ רשתות עם 5 טיפות נפרד (50 µL) ל- PBS המכיל BSA 0.1% למשך 10 דקות.
  6. העברה רשתות טיפות של נוגדן 2nd לשעה (ארנב אנטי איג מצומדת כדי 10 ננומטר זהב חלקיקים (1: 100) ב- PBS המכיל 0.1% BSA).
  7. רשתות לשטוף עם חמישה להפריד טיפות PBS המכיל BSA 0.1% (50 µL) כל 10 דקות.
  8. חדר זוגי-הכתם עם 2% uranyl אצטט כעשרים דקות בתנאים כהה ועם עופרת ציטראט של וריינולד למשך 10 דקות, בהתאמה.
  9. לחץ על לחצן "ייבוא" ולאחר מכן לחץ על "קובץ" ו "שמור כמו" במערכת מצלמת CCD תחת TEM 80 kV. זמן החשיפה עקב הגדרות אוטומטית.

figure-protocol-3165
איור 1: תהליך של הכנת הדוגמא immunostaining. (א) exosome קבוע זוגי מיובשת, הסתננו עם צמיגות נמוכה הטבעה תערובת שרף. (B) שרף הטבעה. (ג) סעיף דקים עם סכין יהלום. תוכנית ההתקנה עבור תוויות חיסונית-זהב (D) . הרשתות עם הסעיפים ודק במיוחד הם לשים את טיפות נוזל על מצלמות-מיקרוסקופים, אשר ממוקם עם מגבת נייר רטובה. כל מקטע הוא מתפשט עם טיפות של נוגדן µL 50-100, ואז לרחוץ עם מאגר. (ה) כפול מכתים עם uranyl אצטט ולהוביל ציטראט. המכסה מכוסה ברדיד אלומיניום עבור צביעת מתכות כבדות. (נ) צביעת פתרון יוסר על ידי נייר סינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. שלילי מכתים

  1. זוהר-פריקה הסרט formvar דק/פחמן מצופה 200 רשתות EM רשת נחושת עבור 1 דקות על ידי זוהר פרירים.
  2. לתקן מטוהרים exosomes עם 1 מ"ל של 2% Paraformaldehyde (PFA) במשך 5 דקות.
    התראה: Paraformaldehyde אדים רעילים. כל העבודה צריכה להיעשות בשכונה fume מאוורר.
  3. לטעון 5-7 µL exosome השעיית פתרון על הרשת, תקופת דגירה של 1 דקות. אם הריכוז של exosome הוא גבוה מדי, לדלל את ריכוז 1/2 - 1/5.
  4. מיד להכתים ~ 20 טיפות של פתרון אצטט (UA) uranyl 1% מסונן על פני השטח של רשת אמ על ידי מזרק.
  5. הסר את הפתרון UA עודף על הרשת על-ידי פנייה אל קצה הרשת עם נייר סינון.
  6. מהר לשטוף הרשת עם טיפת מים. שלב זה יסיר את הפתרון מכתימים עודף.
  7. מניחים את הרשת על השולחן על-ידי החזקת עם פינצטה, ו כיסוי הרשת חלקית לצלחת תרבות לייבוש למשך 10 דקות מתחת לטמפרטורת החדר.
  8. חנות הרשת בתיבה רשת EM להסתכלות לעתיד על ידי TEM 80 kV.

4. כל הר עבור Immunostaining

  1. זוהר-פריקה הסרט formvar דק/פחמן מצופה 200 רשתות EM רשת נחושת ל 30 s.
  2. לתקן מטוהרים exosomes עם 1 מ"ל של 2% Paraformaldehyde (PFA) במשך 5 דקות.
    התראה: Paraformaldehyde אדים רעילים. כל העבודה צריכה להיעשות בשכונה fume מאוורר.
  3. לטעון µL 5-7 קבוע פתרון exosome על הרשת, תקופת דגירה של 5 דק שטיפה עם 100 µL ל- PBS שלוש פעמים כל 10 דקות.
  4. פנקו רשתות עם 50 µL של גליצין 0.05 M 10 דקות להרוות קבוצות אלדהיד חופשית.
  5. העברה רשתות טיפה של מאגר חסימה (PBS המכיל 1% BSA) למשך 30 דקות.
  6. תקופת דגירה רשתות עם 50-100 µL אנטי-PD-L1 נוגדנים (בטחונות ב- PBS המכיל 0.1% BSA) של 1 h (במקרה הצורך, שלב זה צריך להתבצע ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה).
  7. רחץ רשת עם 5 טיפות נפרד (50 µL) ל- PBS המכיל BSA 0.1% למשך 10 דקות.
  8. העבר הרשת טיפה של נוגדן 2nd לשעה.
העכבר אנטי אג מצומדת ל 9-11 ננומטר זהב חלקיקים מדולל-מטריים ב- PBS המכיל BSA 0.1%.
  • רחץ רשת עם 5 טיפות נפרד (50 µL) ל- PBS המכיל BSA 0.1% למשך 10 דקות. רחץ רשת עם שתי טיפות נפרד (50 µL) של DW. לבצע צביעת שלילי עם 2% uranyl אצטט כמתואר מ 3.4 ל 3.8.
  • חנות הרשת בתיבה רשת EM להסתכלות לעתיד על ידי TEM 80 kV.

    • Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    תוצאות

    כיום, exosomes מסווגים לקטגוריות גודל וצורה על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. איור 2 מציג שלילי צבעונית exosome ו מתויג החיסון exosome במעמד הר שלמה. איור 3 מראה exosome משרטוטי exosomes שאותה ניתן להתאים חיסונית לאחר חלוקתה דק. חיסונית-זהב מכתים באמצעות ?...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    מאמר זה מציג פרוטוקול להתבוננות המבנה של exosome מפורט תיוג מהחלבונים ספציפיים. צביעת שליליות נחשב כמו השיטה הטובה ביותר עבור exosome הדמיה17. הטכניקה המקובלת הזו מראה מבנה דמוי ספל של exosomes. עם זאת, צורת גביע היא צורה של החפץ יכול להתרחש עקב תהליך הייבוש. הקפאה-TEM התוצאות הראו כי exosomes י...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    המחברים אין לחשוף.

    Acknowledgements

    מחקר זה נתמך על ידי הצלת חיים & תוכנית פיתוח טכנולוגיה רפואית של קרן המחקר הלאומי (NRF) & ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP & MOHW) (מספר 2016M3A9B6904244). אנו מודים גם חברי המרכז לחקר Medicinal Bioconvergence טיהור של exosome.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    GlutaraldehydeEMS16200
    Sodium cacodylate EMS12300
    Osmium tetroxide 1 g crystalEMS19100Use only in fume hood
    acetoneJUNSEI1B2031
    Spurr mediumTED PELLA18108
    Ultra-microtomeLeicaUCT
    Uranyl acetateEMS22400Hazardous chemical
    Lead citrateEMS17900
    Transmission Electron MicroscopyHitachiH7600
    nickel gridEMSG200-Ni
    Copper gridEMSG200-Cu
    glycineSIGMA022K5404
    Phosphate buffer salineSIGMAP4417
    Bovine serum albuminAurion25557
    1st Antibodypurification in manually 
    Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) AntibodyBioLegend329710Whole mount Immumogold
    Purified Mouse IgG2b, κ Isotype CtrlBioLegend401202Whole mount Immumogold (Control)
    2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particlesigmaG7652
    Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM2200FS
    Glow dischargerJEOLJFC1100E
    Carbon gridEMS121119
    ParaformaldehydeEMS19210
    Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)EMSFCF200-CU
    Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh)EMSFCF200-NI

    References

    1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
    2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
    3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
    4. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
    5. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
    6. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
    7. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
    8. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
    9. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
    10. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
    11. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
    12. Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
    13. Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
    14. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
    15. Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
    16. Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
    17. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
    18. Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
    19. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
    20. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
    21. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
    22. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
    23. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
    24. Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
    25. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
    26. Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
    27. Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
    28. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
    29. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
    30. van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    131Exosomeultramicrotomy

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved