JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לומד microenvironment הגידול עשוי לזהות סמנים ביולוגיים prognostic או ניבוי של תגובה קלינית חיסוני. המוצג כאן, שיטה חדשנית מבוסס על בחיי עיר פלורסצנטיות מולטי ספקטריאליות הדמיה לנתח ולספור באופן אוטומטי שונים subpopulations של CD8+ T תאים. טכניקה זו אמינה הדירים מתאים עוקבה גדול ניתוחים.

Abstract

תאים חיסוניים להשפיע על צמיחת הגידול וההתפתחות בכל שלבי carcinogenesis הינם מרכיבים חשובים של microenvironment הגידול. ראוי לציין, היא עכשיו מבוססת היטב כי לחדור מערכת החיסון האנושית גידולים יכולים לתאם עם הפרוגנוזה והתגובה לטיפול. הניתוח של לחדור המערכת החיסונית ב microenvironment הגידול הפך לאתגר מרכזי עבור הסיווג של המטופלים ואת התגובה לטיפול.

הביטוי שיתוף של רצפטורים מעכבים כגון תוכנית לתא המוות חלבון 1 (PD1; ידוע גם בשם CD279), ציטוטוקסיות לימפוציטים-T הקשורים חלבון 4 (CTLA-4), T-Cell בנוגדנים ו Mucin המכיל חלבון-3 (טים-3; ידוע גם בשם CD366) ו לימפוציטים הפעלת גנים 3 (לג-3; ידוע גם בשם CD223), מהווה סימן היכר של תא T תשישות. פיתחנו immunofluorescence של multiparametric בחיי עיר מכתים כדי לזהות ולכמת ברמה התאית הביטוי שיתוף של רצפטורים אלו מעכבות. על סדרה רטרוספקטיבית של רקמות קפוא של תאי הכליה קרצינומה (RCC), תוך שימוש בטכנולוגיה הדמיה מולטי ספקטריאליות קרינה פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח תמונה התוכנה, זה נמצא את הביטוי שיתוף של PD-1 וטים-3 על הגידול שחדר CD8+ T תאים הוא מתואם עם פרוגנוזה גרועה אצל RCC. לידע שלנו, המייצג את המחקר הראשון הוכחת כי זה אוטומטית מולטיפלקס באתרו בתוך טכנולוגיה שיש כמה הרלוונטיות הקלינית.

Introduction

בשנים האחרונות, התפתחה חיסוני לטיפול בסוגים רבים של סרטן, כולל RCC מבטיח מאוד. במיוחד, חיסוני בהתבסס על עיכוב של מחסומים מעכבות כמו PD-1, CTLA-4 דווחה יהיה יעיל קלינית1,2,3,4,5, 6. נוגדנים חד-שבטיים כנגד CTLA-4, PD-1, או תוכנית מוות ליגנד 1 (PD-L1) כבר אושרו ב סרטן מספר ולהוביל לתגובות הקליניות לאורך זמן יותר מ 20% של חולים7. למרות זאת, לא כל המטופלים המגיבים, העלות של הטיפול היא גבוהה, טיפולים אלה הם רעילים, המוביל אל תופעות לוואי כמו מחלה אוטו-אימונית רציני. לכן, האתגר הנוכחי הוא לזהות סמנים חזוי כדי immunotherapies החדשים האלה. קצב מוטציות הגידול, הביטוי של PD-L1 או רמות intratumoral CD8+ תא T הסתננות דווחו לתאם עם תגובה קלינית. עם זאת, עמותה זו היא עדיין חלשה מכדי ממליצים על השימוש אלה סמנים קליניים הקלינית חוץ המבחן לוויה עבור PD-L1 לפני הנהלת Pembrolizumab תאים לא קטנים הריאה סרטן (NSCLC) חולים8 ,9,-10-11,-12. זה הוכח כי הביטוי שיתוף של רצפטורים מעכבים רבים כמו PD-1, טים-3, לג-3 ומשרה CTLA-4, של פנוטיפ תשישות תא והתנגדות טיפול13,14,15. מאז דם היקפיים אינה מייצגת microenvironment גידול, זה עניין גבוהה כדי לנתח את התכונות פנוטיפי של תאים בתוך באתרו. PD-1 וטים-3 תאים T משותפת לביטוי ידועים להיות תאים פונקציונלית לקוי מספר הקשרים13,16,17. מחקר זה, ההשפעה prognostic של ביטוי משותף של קולטני מעכבות שני PD-1 ו- 3 טים-CD8+ T תאים הוערך.

עד עכשיו, לומד את הביטוי משותף של מספר סמני הגידול שחדר לימפוציטים (הפדגוגי) בוצעה בעיקר על-ידי ניתוח cytometry זרימה, ולכן יש צורך לעבוד על גידולים טריים וניתוחים רטרוספקטיבי ולכן מסלק. עם קונבנציונאלי בחיי עיר מכתים, צביעת אחד בלבד בכל פעם יכול להתבצע, אפיון סוג התא שותף שיבטא את סמני אינה אפשרית. לדוגמה, PD-L1 מבוטא על ידי סוגי תאים רבים microenvironment tumoral, ולכן קשה להגדיר על-ידי ניתוח קונבנציונלי אימונוהיסטוכימיה התאים לבטא PD-L1 הם רלוונטיים יותר ללימודי correlative. בעבודה זאת, פיתחנו שיטה multiparametric immunofluorescence חדשנית בחיי עיר עם ספירת המחשב לתאם הביטוי שיתוף של PD-1 וטים-3 על ידי גידול שחדר CD8+ תאי-T עם התוצאות הקליניות של RCC. טכניקה זו היא בעלת מספר יתרונות, כולל את האפשרות לנתח ברמה של תא בודד, מספר סמני במקביל באמצעות מצלמה מולטי ספקטריאליות אשר יכול ללכוד במרווחי זמן מוגבל > 10 ננומטר דרך גביש נוזלי מסנן18. יתר על כן, התהליך הוא אוטומטי אשר מאפשר הפארמצבטית בין המפעיל של ניתוח מקוצרת לעומת טכניקות ידניות19. מספר מחקרים בתחום הסרטן, דיווח משכנע stainings מרובים של מולקולות מערכת החיסון כמו PD-1, PD-L1 ו CD8-מרקל קרצינומה, סרטן ריאות, ואת הראש והצוואר סרטן20,21,22, 23. ספירת אוטומטיות אפשרי עם הכשרה על-ידי המשתמש (שלב phenotyping). ידי קרינה פלואורסצנטית נמדד על תאים תאים שונים (גרעינים ציטופלזמה, ממברנה).

הנה, קבוצות משנה שונים של גידולים הסתננות CD8+ T תאים לביטוי PD-1 ו/או טים-3 במדגם גדול של RCC נספרו, התוצאות היו בקורלציה עם ציונים הכבידה קליניים ופרמטרים הישרדות. גם ניתן היה לנתח ממברנה עוצמת קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה הסלולר עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית מתכוון (MFI) נתונים כמו cytometry. עד כמה שידוע לנו, זה מייצג הראשון דיווח prognostic תוצאות המחקר בעזרת טכניקה המבוססת על ספירת הדמיה מולטי ספקטריאליות זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם הצהרת הלסינקי, שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (CPP Ile de France. ע נ. 2012-05-04). הסכמה מדעת הושג מהמשתתף כלול את גדודים.

1. רקמות חומר

  1. לאסוף דגימות רקמה RCC ביום של הניתוח. להתמודד עם הדגימה כירורגי בטמפרטורת החדר (המחלקה לפתולוגיה).
  2. לאסוף דגימת גידול של 0.5 ס מ x 0.5 ס מ x 0.5 ס מ גודל צינור יבש. הצמד להקפיא במצב חנקן נוזלי ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
  3. מעיל הדגימות בטמפרטורה אופטימלית חיתוך המורכב. בסעיף הדגימות עם cryostat ב-20 ° C 4-6 חלקים עבה מיקרומטר. תן את דגימות אוויר יבש על שקופיות עבור 12 שעות ולאחסן אותן ישירות ב- 80 ° C כדי להימנע לייבוש.
  4. בדוק את איכות המדגם על-ידי הצגת Hematoxylin וחדר אאוזין צבעונית סעיף.

2. בחיי עיר Immunofluorescence כתמים הפדגוגי

  1. הנחיות מנהליות
    1. בצע את כל השלבים ניסיוני בטמפרטורת החדר.
    2. עבור כל השלבים, לבצע את דילולים עם טריס מאגר מלוחים (TBS; ראה טבלה של חומרים).
    3. ביצוע לשטוף את TBS עבור כל הצעדים חוץ לאחר הדגירה נוגדן ראשוני. עבור האחרון, להשתמש טריס מאגר מלוחים Tween20 (TBST, ראה טבלה של חומרים). מאגר הרכב, שיחזור ראה משלימה טבלה 1.
    4. השתמש תא לחות נוגדן incubations וצנצנת מכתימים לרחצה.
    5. אל תתנו את המקטע להתייבש במהלך ההליך.
  2. רעלני
    1. להפשיר את השקופית המכילה את דגימת רקמה ויבש בקפידה את השקופית סביב הדגימה עם מגבת נייר. Delimitate אזור התגובה הכולל את הרקמה עם עט הידרופובי המכשול (ראה טבלה של חומרים). יבש למשך 2 דקות.
    2. לתקן את הדגימות אצטון 100% למשך 5 דקות, יבש למשך 2 דקות, ולשטוף עם TBS למשך 10 דקות.
  3. רוויה ומצור
    1. Pretreat השקופיות 10 דקות עם 3 טיפות של אבידין 0.1%, ברז ו/או פליק השקופית כדי להפיץ את אבידין להסיר בועות אוויר ולאחר מכן לטפל עבור 10 דקות עם 3 טיפות של ביוטין 0.01% (ראה טבלה של חומרים), הקש על, ו/או קפיצי. לשטוף עם TBS.
    2. לבצע המצור רצפטורים של Fc. החל µL 100 של 5% נפח/נפח של סרום נורמלי מדולל TBS. שימוש בסרום של המארח מאותו המין כמו הנוגדן שכותרתו משנית או שלישוני (ראה טבלה של חומרים); . הנה, סרום החמור היה בשימוש. תקופת דגירה של 30 דקות.
    3. במהלך הדגירה, ספין בקצרה את אנטי-CD8 PD-1, טים-3 נוגדנים (טבלה של חומרים). הכינו את התמהיל של נוגדנים ראשי ב- TBS כפי שמתואר משלימה בטבלה 2.
  4. מכתים חיסונית של CD8, PD-1 וטים-3
    1. להכין לתערובת נוגדן ראשוני. עיין בטבלה של חומרים , משלימה בטבלה 2 עבור הנוגדנים בשימוש (anti-CD8, PD-1, טים-3 ונוגדנים משניים המקביל שלהם) וריכוזי שלהם.
    2. הקש על ו/או לסתור את הנסיוב חמור הנותרים (נוסף בשלב 2.3.2). דגירה של השקופיות עם 100 µL של המיקס שכותרתו שאינם נוגדנים העיקרי עבור h 1 בתוך תא humidified.
    3. במהלך הדגירה, בקצרה לסובב את Cyanine 5 ארנב אנטי AF488-נגד-עז, נוגדנים אנטי עכבר biotinylated והכן את התמהיל של נוגדנים משניים כפי שמתואר משלימה בטבלה 2.
    4. לשטוף השקופיות ב- TBST עבור 5 דק יבש השקופיות.
    5. דגירה של השקופיות עם 100 µL של הנוגדנים משני למשך 30 דקות בחדר humidified.
    6. להכין התערובת של נוגדן שלישוני המכיל Cy3-streptavidin, כפי שמתואר משלימה בטבלה 2.
    7. לשטוף השקופיות TBS במשך 10 דקות יבש השקופיות.
    8. דגירה של השקופיות עם 100 µL של תערובת שלישוני נוגדן למשך 30 דקות.
    9. לשטוף השקופיות TBS במשך 10 דקות יבש השקופיות.
  5. הרכבה תא
    1. הר בשקופיות 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride דאפי המכילות הרכבה בינונית (1.5 µg/mL דאפי) עם coverslip תואם למיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: כפקד שלילי עבור ניסוי, שקופית אחת עם נוגדנים מתאימים isotype שומש ריכוז זהה כמו נוגדנים המתאימים. עבור זה מכתים, השתמשנו העכבר IgG1, ארנב IgG ועז IgG שלילי שליטה נוגדנים (ראה טבלה של חומרים). כפקד חיובית, השתמשנו שקדים hyperplasic האנושי, אשר ידוע להיות חיובי עבור הסמנים שנבדקו, עבור ניסוי. צביעת טיפוסי מתואר בתוצאות (איור 1). מונו-צביעה של CD8, PD-1 וטים-3 צריכה להתבצע באופן אינדיבידואלי (צביעת אחד לכל שקופית) עם אותו טיפול מראש וללא דאפי. שקופית בתנאים ניסיוני אותו ללא כל נוגדן רק דאפי הרכבה בינונית יש גם לבצעו. שקופית צריך לדימות שימוש ניסיוני בתנאים זהים ללא כל נוגדן וללא דאפי.

3. קרינה פלואורסצנטית ניתוח, ספירת התאים אוטומטית

  1. ייבוא תמונות עם המיקרוסקופ אוטומטיות
    1. ליצור פרוטוקול.
      1. הפעל את התוכנה מיקרוסקופ אוטומטיות, המאיר זריחה.
      2. בשורת התפריטים, לחץ על "קובץ", "יצירת פרוטוקול," בחר "דאפי," "FITC", "TRITC".
      3. לחץ על "הבא," "סעיף הרקמה," ולחץ על "הבא","""פרוטוקול שם. לבחור שם, לדוגמה, "CD8-PD-1-טים-3," לחץ על "הבא", ו "שמור".
      4. באופן ידני במקום שקופית על הבמה.
      5. בשורת התפריטים, לחץ על "הגדרות", "הגדרות". לחץ על "קבע Z הביתה" בחלון חדש.
      6. להתאים את זמן החשיפה עם פקד חיובי שקופית קרי CD8, PD-1 וטים-3 טריפל-צבעונית עם דגימת דאפי.
      7. בבר בקרת לחץ על "קבע חשיפה".
      8. התאם את זמן החשיפה כל מסנן עד אות מספיק אבל לא קולח, מתקבל.
      9. עבור הדמיה בשחור-לבן, בצע את הפעולות הבאות:
      10. בחר רכישה ובחרו ' תחת 'פוקוס אוטומטי' מסנן דאפי.
      11. "סריקה אזור גבול", לעבור המטרה העליונה לפינה השמאלית העליונה של השקופית. לחץ על "סימן". לעשות את אותו הדבר עבור פינה הימנית התחתונה.
        הערה: שלב זה delimitates האזור של צריכת חשמל נמוכה, הדמיה (הדמיה LP) ב 4 X; להיות מודע כדי למקם את הסימן טוב אז כדי להקיף את כל הדוגמאות של הסדרה.
      12. לכוח גבוה (HP) הדמיה, בצע את הפעולות הבאות:
      13. תחת 'פוקוס אוטומטי', בחרו "דאפי".
      14. תחת 'רכישה' בנד, בחר "דאפי", "FITC", "Cy3" ו- "Cy5". לחץ על "אישור". בשורת התפריטים לחץ על "קובץ", "שמור פרוטוקול".
    2. סריקת השקופיות.
      1. לטעון את הפרוטוקול על ידי לחיצה על "קובץ", "טען פרוטוקול" של שורת התפריטים. לחץ על "התחל".
      2. הזן 'המעבדה ' ID (מיקום התיקייה לאחסון תמונות). הזן מזהה שקופית כדי לזהות את השקופית. לחץ על "הבא".
      3. לחץ על "הדמיה מונוכרום" (כדי לסרוק כל השקופית תחת אור בהיר שדה ולרכוש רציפים תמונות באמצעות מטרה 4 x).
        הערה: זה מייצר סקירה גווני אפור של השקופית.
      4. לחץ על "חיפוש הדגימה". בחר את אזור הרקמה לסרוק ברזולוציה נמוכה (4x): החזק את מקש 'Ctrl' ולחץ על שדה באמצעות הסמן לבחור או לבטל את שדות (איור 2 א).
      5. לחץ על "LP הדמיה" (4 x הדמיה) עבור רכישת התמונה אדום כחול ירוק ניאון של כל שדה.
      6. עבור בחירת שדה HP, החזק את מקש 'Ctrl' ולחץ על שדה באמצעות הסמן לבחור או לבטל את שדות המקבילים לאזור של רקמות זה ייסרקו ברזולוציה גבוהה (20 x). בחר שדות 5 (איור 2B).
      7. לחץ על "HP הדמיה" (20 x הדמיה) ייבוא תמונות מולטי ספקטריאליות של כל שדה (איור 2C).
      8. לחץ על "אחסון נתונים" כדי לאחסן תמונות בתיקיה שנבחרה ההתחלה ב- LabID.
        הערה: התהליך הוא סיכם, מאויר באיור2. עבור כל שלב (זיהוי הרקמה, בחירת שדה) אלגוריתם יכול להיות גדל בהפרש קבוע, שהוכשרו על-ידי המשתמש עבור תהליך סריקה אוטומטית כל.
  2. ניתוח תמונות פלורסצנטיות ותא אוטומטית ספירה עם ניתוח בשילוב תוכנה
    1. לבנות את ספריית ספקטרלי.
      1. פתח את תוכנת ניתוח של התמונה.
      2. בלוח השמאלי, פתח את "לבנות ספריות". תחת "טען תמונה", לחץ על "עיון" ובחר שהוכתמו מונו תמונה אחת (למשל, 5 CD8/Cyanine).
      3. בחר את fluorophore, (למשל, Cyanine 5). לחץ על "לחלץ". לחץ על 'שמור' כדי לאחסן בספריה. לחץ על "שמור".
      4. חזור על התהליך זהה עבור PD-1, טים-3 ודאפי שהוכתמו מונו שקופיות כדי לשלב את הספקטרום של fluorophore בכל עניין.
        הערה: בניין הספרייה ספקטרלי משלב את הספקטרום עבור כל fluorophore המשמש את רקמות ספציפיות (כאן, כליות), אך ניתן להשתמש בספריות "סינתטיים" שכבר קיימים. כמו הקשת autofluorescence הוא אך ורק ביחס הרקמה, חשוב לבצע אחד אוטומטי-זריחה וספריית ספקטרלי לכל פרוייקט.
    2. יצירת פרוייקט חדש.
      1. בשורת התפריטים, לחץ על "קובץ", "פרויקט חדש". הכרטיסיה 'תכונת החיפוש', בחר "תא פילוח". הכרטיסיה 'Phenotyping', בחר "phenotyping". לחץ על "צור".
      2. לשלב את התמונות נציג בפרוייקט.
        1. בכרטיסיה 'קובץ', לחץ על 'פתח תמונה'. בחרו 10 עד 30 תמונות נציג כל הסדרה. להוסיף את השקופית שאינו מוכתם להסיר את autofluorescence. בלוח השמאלי: בחר ספריית המקור. בחר fluorophore ובחר את אלה המתאימים לספרייה ספקטרלי שנבנו בעבר.
      3. כדי להסיר את רקמת autofluorescence, לחץ על כפתור"AF" ולאחר מכן בחר את האזור של autofluorescence בשקופית הריקה.
      4. טיפול תמונות ויצירת תמונה ללא הפרדות צבע.
        1. לחץ על "הכנת כל" כדי לשלב את הספרייה פלורסצנטיות, ספקטרום autofluorescence כדי ליצור תמונה מורכבת (איור 3). לחץ על הסמל 'עין' כדי לפתוח את החלונית 'עריכת תצוגה', בחר את הנתונים המוצגים: בחר את הסמנים CD8, PD-1, טים-3 ודאפי. להסיר את autofluorescence. בצע את השלבים שהוצגו על ידי התוכנה.
      5. קטע את התאים.
        1. כדי לחלק את התאים, 'תא', בחר באפשרות "גרעינים" ואת "קרום". בכרטיסיה "גרעינים", הגדר דאפי counterstain הגרעין.
        2. בכרטיסיה "גודל מזערי (px) ומקסימום" להזין "40", "176" הערכים המינימליים והמקסימליים, בהתאמה. האות 'מינימום', להגדיר "0.13". בכרטיסייה "פיצול", להגדיר "2.60". בכרטיסייה "גרעינים", להגדיר "0.81". בחר "השתמש ממברנה אות כדי לסייע פילוח".
        3. לחץ על "קטע תאים" בחלק התחתון של המסך. בדוק את חלוקת הגרעינים וממברנות התאים ונסה שנית עם פרמטרים שונים, אם זה לא תואם את פלורסצנטיות דאפי, הממברנה של התאים.
          הערה: התוכנה מזהה את התאים עם דאפי גרעיני מכתים, בהתבסס על גודל התא. כוונן את הפרמטרים תא (גודל, פיצול, פיקסלים) על פי הפרויקט.
      6. פנוטיפ התאים.
        1. הכרטיסיה 'פנוטיפ', לחץ על "הוסף". צור תא פנוטיפ קטגוריות: CD8 (נקודה כחולה) / CD8-PD-1 (נקודה אדומה) / CD8-PD-1-טים-3 (נקודה ירוקה) / אחרים (נקודה שחורה) (איור 4).
        2. בחר יותר מ- 5 דוגמאות תאים של כל קטגוריה. לחץ על "רכבת מסווג".
          הערה: זה יוצר באלגוריתם סיווג סטטיסטי באמצעות התוכנה.
        3. לחץ על "פנוטיפ כל" כדי להשיג את פנוטיפ של כל תא.
          הערה: התוכנה מעניקה את פנוטיפ של תא אחד עם מרווח ביטחון (CI) של דיוק.
        4. לשפר את האלגוריתם על ידי אימון התוכנה עד ההבדל בין העין לבין ספירה אוטומטית concordant (שגיאה < 5%). לבחור מודיע שהיא מקובלת עבור התאים עניין.
          הערה: בחרנו לעשות את האימון על בסיס של 55% CI כמקובלת.
      7. שמור את אלגוריתם ואת הפרוייקט.
      8. תחת 'קובץ' בחר "פרויקט". שם ולחץ על "שמור".
    3. לבצע ניתוח אצווה של הסדרה.
      1. בחר "אצווה ניתוח". בחר את הפרוייקט. להוסיף את התמונות כדי לנתח. בחר תיקיית אחסון עבור הנתונים. לחץ על "הפעל". בדוק את האיכות של תמונה מורכבת. ודא את phenotyping לכל התמונות של הסדרה.
        הערה: התוכנה ניתוח בשילוב תמונה משתלב כל אותות התאים תאים (ממברנה ציטופלזמה גרעין). הצעד phenotyping הוא מכריע אמנם ההכשרה של האלגוריתם יכול להיות צעד גוזלת זמן. כל הנתונים של כל תמונה הם אחד קובץ. txt. כל הנתונים של תא אחד (במיוחד שלה פנוטיפ בהתחשב עם CI שלה) הם בשורה אחת. עבור כל שקופית, ייבוא תמונות וספירות הבאים בוצעו בשדות 5.
  3. אינטגרציה של נתונים גולמיים, דור של ספירת אוטומטיות
    1. חשב את הנתונים עם תוכנית סטטיסטית.
      1. חשב כל הנתונים מן התמונות 5 התואמים לשדות 5 ניתוח לחולה 1. השתמש פלטפורמה סטטיסטי, ויש סטטיסטיקאי מנוסה, עם נתונים מנהל או מדען נתונים לבצע את הניתוח. לבנות קובץ script באופן אוטומטי סופרת את התאים בהתאם שלהם פנוטיפ, בחירה של CI > 55%.
      2. לשים את כל קבצי. txt של הסדרה באותה תיקיה.
    2. לחלץ את הנתונים.
      1. לשים את כל קבצי. txt בתיקיה אחת. להריץ את הסקריפט האוטומטי נבנה בשלב 3.3.1. פתח את הקובץ. csv פלט שנוצרו על-ידי קובץ ה-script R. שמור כתבנית .xl. הפלט שאוסף את מספר התאים עבור כל פנוטיפ (קרי, CD8 לבד, CD8-PD-1, CD8-PD-1-טים-3) עבור כל מטופל.
      2. לחשב את המספר הממוצע של תאים עבור כל מטופל לכל שדה: לחלק את מספר התאים לפי מספר שדות (כלומר, 5) לנרמל את מספר התאים עבור כל מטופל לכל שדה.
      3. לחשב את אחוז תאים PD-1+ בין CD8 הכולל+ T תאים ותאים PD-1+ טים-3+ בין CD8 הכולל+ T תאים. לקבלת סיכום של שלב זה, ראה איור 5 .
        הערה: השפה R (או תוכנה אחרת תכנות של הבחירה) נדרש כדי ליצור ולבצע כראוי את הפקודות, אז משתמש מנוסה או מדען סטטיסטיקאי/נתונים חיוניים. התוכנית R ניתן לחשב את הנתונים של המטופל אותו, אבל השם של קבצי. txt 5 של מטופל אחד צריכה להיות התחלה זהה, המתאים החולה מזהה ייחודי.
  4. ניתוח סטטיסטי
    1. השתמש בתוכנה סטטיסטית לניתוח סטטיסטי של התוצאות.
    2. לבצע ניתוחים סטטיסטיים המתאימה בעזרת סטטיסטיקאי.
      1. השימוש Wilcoxon ללא פרמטרי חתם על דרגה בדיקות להשוואה של PD-1 MFI בין תא שני פנוטיפים (איור 6). לתאם את covariate ואת מאפייני היסטולוגית עם מבחן כי בריבוע פירסון.
      2. להשתמש בשיטה קפלן-מאייר כדי להעריך את ההישרדות ללא התקדמות, ומודלים קוקס רגרסיה כדי להעריך את ההשפעות covariate על תוצאות זמן-כדי-אירוע, כגון הכללית ועל ההישרדות ללא מחלה.
      3. שקול p-ערכים נמוך מ- 0.05 כמו משמעותית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול כללי שתוארו לעיל, כיוונו לכמת intratumoral CD8+ T תאים שותף ביטוי קולטני מעכבות PD-1 וטים-3 ברקמות קפוא מחולים עם RCC, כדי לתאם את התוצאות עם התוצאות הקליניות25.

אופטימיזציה של ההכתמה CD8/PD-1/טים-3:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שינויים, פתרון בעיות:

איכות רקמת הוא פרמטר חשוב; זה יכול בקלות להיבדק על ידי הגיוון hematoxylin ואאוזין.

אחד היתרונות של השיטה היא האפשרות של stainings מרובבת, אך כדי למנוע fluorophore והתאמת, מומלץ לבחור אורכי גל פליטה עם דלתא של מינימום 10 ננומטר. כאן, כי היינו stainings 4...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

כל המחברים יש אין ניגוד אינטרסים להכריז.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים אינסטיטוט הארצי du לסרטן (האינקה) (ET), ליגה חדר מרווח וחדיש le סרטן (ET), אוניברסיטת סורבון פריז סיטה (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex חיסונית-אונקולוגיה (ET), CARPEM SIRIC (CG, ואח '). הקצוות עם הגבלת זמן מומן על ידי מלגת ד'ארק Fondation. EV ו- CD, במימון של אחוות APHP (bourse באסכולה הסוציולוגית רשרש). ChB ממומן על ידי מלגת של אוניברסיטת סורבון פריז סיטה (contrat דוקטורט). המחברים מודים בריסטול מאיירס סקוויב על המימון בפרויקט זה. המחברים תודה המחלקה לפתולוגיה של חולים Européen פומפידו, נקר (Laurianne Chambolle, מישל אלודי, Gisèle Legall). המחברים תודה פלטפורמת היסטולוגיה של PARCC, חולים Européen פומפידו (קורין Lesaffre).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging Perkin ElmerCLS142338
inForm cell analysis 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen delimiting penDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7.6 100 tablets
Biotin blocking systemDakoX0590Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serumJackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPISigma-aldrichF60571.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslipKnittel Gläser,10003924x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-VnovusNBP1-79055use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NATabcamab52587use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3R&DAF2365use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142Roche7309457001use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11Cell Signalling4528use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9R&DAF2045use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbitJackson Immunoresearch711-175-152use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgGJackson Immunoresearch715-066-150use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgGabcamab150133use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidinAmershamPA43001use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1DakoX0931use at 2 µg/mL
IgG from goat serumSigma-aldrichI5256use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serumSigma-aldrichI5006use at 4µg/mL

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437(2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221(2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10(2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47(2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120(2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132immunofluorescence3PD 1microenvironment

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved