JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של וקטורים אינטגרציה מבוססת-transposon מאפשרת יציבה תרביות תאים של hepatocytes מאתר ויוו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעשית למערכות תרביות תאים המאפשרת ביטוי מכוננת ארוכת טווח של transgene יחיד או ביטוי מכוננת ו דוקסיציקלין-inducible משולב של transgene או של מיר-shRNA בכבד.

Abstract

במודלים המחקר של סרטן הכבד, התחדשות, דלקת, פיברוזיס, מערכות גמיש ויוו ביטוי גנים והשתקה שימושיות מאוד. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של המבנים מבוססי transposon היא שיטה יעילה עבור הנדסה גנטית של hepatocytes בעכברים בוגרים. בנוסף לביטוי transgene המכונן, מערכת זו יכול לשמש ליישומים מתקדמים יותר, כגון בתיווך shRNA גן במשתמע דפיקה למטה, את מערכת CRISPR/Cas9 כדי ליצור מוטציות או מערכות inducible. כאן, השילוב של הביטוי CreER מכוננת יחד עם ביטוי inducible של transgene או מיר-shRNA להתמקד מוצג בתור דוגמה של טכניקה זו. אנו מכסים את ההליך רב שלבי החל משלב הכנת היפהפיה הנרדמת-transposon בונה, הזרקה, וטיפול של עכברים, הכנת רקמת הכבד לניתוח על ידי immunostaining. מערכת הציג היא גישה אמין ויעיל להשגת שינויים גנטיים מורכבים ב hepatocytes. היא שימושית במיוחד בשילוב עם זנים העכבר מבוססות-Cre/loxP, ניתן להחיל על מגוון דגמים בחקר מחלת כבד.

Introduction

מחלת כבד כרונית מציג ברחבי העולם נטל1הבריאותיות העיקריים. מחקר בבעלי חיים מודלים כלים מהותיים בחקר מחלת כבד, סייעו לענות על שאלות מורכבות התחדשות כבד, דלקת הכבד, ו steatosis, כמו גם סרטן הכבד2. מספר ניכר של מודלים בבעלי חיים אלה מסתמכים על השינוי הגנטי של תאי כבד. לכן, כלים יעילים לתמרן ביטוי גנים ב hepatocytes הן מועילות3. הוקמה שיטות כגון הרבייה של זנים מהונדסים גנטית עכבר או הדור של וקטורים ויראלי לדלקת hepatocyte נמצאים גם הנמל זמן רב, חששות בטיחות, או תשואה transgene המסכן ביטוי hepatocytes ויוו 4 , 5. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic (HTVI) היא שיטה חלופית עבור ויוו תקנים של hepatocytes המאפשר קל, מהיר ויעיל עלות חקירת פונקציה ג'ין בכבד. עבור HTVI, וקטור נושאת את רצף ה-DNA הרצוי הוא מומס נפח תמיסת המתאים ל-10% של משקל הגוף של החיה מוזרק. הפתרון אז מוזרק לווריד הזנב תוך 5-10 s6. העולה על תפוקת הלב, תמיסת המלח זורם מן הכלילי התחתון לתוך הורידים בכבד, המוביל אל הרחבה של הכבד, תרביות תאים hydrodynamic של hepatocytes7. כדי להשיג אינטגרציה הגנומי יציב, השיטה יש כבר בשילוב עם וקטורים מבוססי transposon, כגון מערכת שינה יופי -transposon. מערכות זו שמתווכת על רקומבינציה של וקטורים היעד עם רקומבינציה גנומית אתרים על ידי שינה יופי -transposase8,9. עבור מודלים של פיברוזיס בכבד או carcinogenesis, רצוי לעיתים קרובות כדי גנים overexpress או השתיקה בנקודות זמן מסוימות של מודל המחלה. למטרה זו, כלי ביטוי גנים inducible כגון Cre/LoxP-המערכת או מערכת ביטוי גנים inducible-טטרציקלין (ט-על) עשוי להיות בשימוש10.

כאן, אנו מתארים עבור ויוו תקנים של hepatocytes מאתר באמצעות HTVI של היפהפייה הנרדמת transposon מערכת מבוססת פרוטוקול. בנוסף פרוטוקול לביטוי יציב, המכונן של transgene תחת השליטה של מקדם מכירות ספציפי לכבד, נתאר מערכת וקטור מתקדמים יותר המשלבת ביטוי recombinase (CreER) Cre תלויי-טמוקסיפן מכוננת עם הביטוי inducible של transgene או הותאם-microRNA shRNA (מיר-shRNA), קרא על המנגל ט-מערכת11. במערכת זו וקטור, inducible transgenes או מיר-shRNAs תלויי-טטרציקלין ביטוי הם משובטים לתוך המבוססת על עמוד השדרה עם מערכת השכפול recombinational, המאפשר הדור קלה ומהירה של וקטורים חדש12. מדריך זה מבוסס וידאו מכסה את הכנת וקטורים מתאימים, הזרקת וטיפול של עכברים כדי להשיג את הביטוי transgene/מיר-shRNA inducible והכנת סוף סוף רקמת הכבד לניתוח. השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה תוכנן כדי לאפשר השילוב של כל מערכת עכבר Cre/loxP משולבת עם ביטוי או דפיקה למטה של כל הגנים של בחירה, שהופך אותו מערכת החלים נרחב במחקר של מחלות כבד.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי ההנחיות עבור טיפול והשתמש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי הרשויות אחראי (Regierung פון Oberbayern, מינכן, גרמניה, סטנפורד מוסדיים חיה טיפול, שימוש הוועדה, בסטנפורד, קליפורניה, ארה ב). רשימה של כל פלסמידים לקראת שיבוט (שלב 1 עד 4) מסופק בטבלה משלים S1.

1. שכפול של Transgene עבור ביטוי גנים המכונן

  1. עיצוב תחל transgene הגברה13,14.
  2. הוסף אתרים הגבלה עבור פאצי (TTAATTAA) 5' בסוף פריימר לפנים. להוסיף באתרים מגבלת AscI (GGCGCGCC) או FseI (GGCCGGCC) 5' סוף ומהצמיגים הפוכה.
  3. להגביר את transgene על ידי ה-PCR באמצעות תנאים אופטימיזציה עבור הרצוי transgene14. לטהר באמצעות ערכת טיהור DNA זמינים מסחרית.
    הערה: חישול הזמן תלוי תחל תוכנן בשלב 1.1., התארכות הזמן תלוי האורך של הבונה. לדוגמה, עבור מבנה של 1,000 bp של התארכות זמן s שימוש 60 אורך.
  4. לעכל transgene, וקטור ביטוי גנים מכוננת15 עם הגבלת בהתאמה nucleases (ראה שלב 1.2), מאגר של הנפח הכולל של 50 µL ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לדוגמה, לעכל לבנות עם 5 יחידות פאצי ו- 5 יחידות FseI במידת הצורך (ראה שלב 1.2).
  5. ג'ל לטהר וקטור מתעכל והוספה באמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרי על פי הוראות היצרן. ביצוע של מצדו סטנדרטי של 100 ננוגרם של וקטור ו 100 – 1000 ננוגרם של הוספה באמצעות 400 T4 U להשבית ליגאז ב 14 ° C עבור ה 16 חום-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. להפוך המוסמכת חיידקים באמצעות חום-הלם-פרוטוקול תקן16.
  7. צלחת על אגר צלחות המכיל אמפיצילין µg/mL 100. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
  8. לבחור אחת המושבות, לטהר את הדנ א פלסמיד באמצעות ערכת miniprep מסחרי על פי הוראות היצרן ולוודא את הרצף מאת סנגר רצף17 (רצף פריימר: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
  9. שימוש חיובי מושבות של מקסי קנה מידה הגברה של פלסמיד DNA ולטהר באמצעות של פלסמיד אנדוטוקסין ללא הכנה kit18 לפי הוראות היצרן.
  10. לבנות הוא מוכן להזרקה, וכך המשך לשלב 5.

2. שכפול של Transgene עבור ביטוי גנים Inducible

  1. עיצוב תחל transgene הגברה13,14.
  2. הוסף אתרים הגבלת SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) או KpnI (GGTACC) 5' בסוף פריימר לפנים. להוסיף באתרים מגבלת NotI (GCGGCCGC) או XhoI (CTCGAG) 5' סוף ומהצמיגים הפוכה.
  3. להגביר את transgene על ידי ה-PCR באמצעות תנאים אופטימיזציה עבור הרצוי transgene14. לטהר באמצעות ערכת טיהור DNA מסחרי.
  4. לעכל את transgene מטוהרים, 4 µg של ערך וקטור (pEN_TTmcs-וקטור, ראה טבלה של חומרים)19 בנפרד עם הגבלה מתאימה nucleases (ראה שלב 2.2), מאגר של הנפח הכולל של 50 µL ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. ג'ל לטהר וקטור מתעכל והוספה באמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרי על פי הוראות היצרן. לבצע מצדו סטנדרטי עם 100 ננוגרם של וקטור ו 100 – 1000 ננוגרם של הוספה באמצעות 400 T4 U להשבית ליגאז ב 14 ° C עבור ה 16 חום-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. להפוך המוסמכת חיידקים באמצעות חום-הלם-פרוטוקול תקן16.
  7. צלחת על אגר לוחות המכילים גנטמיצין 15 µg/mL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
  8. לבחור אחת המושבות, לטהר את הדנ א פלסמיד ולוודא הוספה על ידי רצף17 באמצעות פריימר לפנים של pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
    הערה: ה-PCR על מושבות יחיד יכול להתבצע ללא טיהור מוקדמת עם תחל pCEP קדימה, pCEP להפוך (5' אגא AAG CTG GGT CTA גת ATC TCG 3'). שלב זה יכול שימושי עבור מיון מוקדם של מושבות חיובי.
  9. המשך לשלב 4.

3. שיבוט של מיר-shRNA עבור Inducible ג'ין דפיקה למטה

  1. עיצוב מיר-shRNA oligonucleotides על פי pSLIK שיבוט פרוטוקול19. Anneal, לטהר את oligonucleotides ואת לדלל 1:20 ב- ddH2O.
  2. µG 3 תקציר של הערך וקטור עם 5 BfuAI U ב 50 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות, ואז להשבית את התגובה ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    הערה: אם ביטוי משותף של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רצוי, שימוש pEN_TTGmiRc19 כווקטור הפוסט, אחרת להשתמש pEN_TTmiRc219.
  3. ג'ל לטהר וקטור מתעכל כמו שלב 2.5. לבצע מצדו סטנדרטי של 100 ננוגרם של וקטור, µL 1 של טיהור, מדולל shRNA oligonucleotides (שלב 3.1) באמצעות 400 U T4 להשבית ליגאז בטמפרטורת החדר במשך ה 1 חום-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. להפוך המוסמכת חיידקים באמצעות חום-הלם-פרוטוקול תקן16.
  5. צלחת על אגר לוחות המכילים גנטמיצין 15 µg/mL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
  6. לבחור אחת המושבות, לטהר את הדנ א פלסמיד ולוודא הוספה על ידי רצף סנגר17 (רצף פריימר: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
  7. המשך לשלב 4.

4. שיבוט recombinational כדי ליצור שיבוטים מוכן-עבור-הזרקה

  1. תערובת 150 ng של ערך וקטור (מתוך שלב 2 או שלב 3) ו- 150 ng של pTC ט-וקטור20.
  2. להוסיף מאגר טה הנפח הכולל של 8 µL (ה-pH = 8).
  3. להעביר את תערובת אנזימים LR-clonase II (ראה טבלה של חומרים) לקרח, תקופת דגירה של 2 דק מערבולת פעמיים.
  4. להוסיף 2 µL של תערובת אנזימים LR-clonase II התגובה, דגירה 25 ° c עבור 1 h.
  5. לעצור את התגובה על-ידי הוספת 1 µL של Proteinase K-פתרון. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. להפוך Stbl3 המוסמכת חיידקים עם 2 µL של שיבוטים recombinational לערבב באמצעות חום-הלם-פרוטוקול תקן16.
  7. צלחת על אגר צלחות המכיל אמפיצילין µg/mL 100. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
  8. לבחור אחת המושבות לטהר דנ א פלסמיד באמצעות של פלסמיד אנדוטוקסין ללא הכנה kit18 לפי הוראות היצרן, לאשר את תקינות וקטור סנגר רצף17 (רצף פריימר 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
  9. המבנה הוא מוכן להזרקה, המשך לשלב 5.

5. מכינים את הפתרון להזרקה וריד הזנב Hydrodynamic

הערה: הכנת בונה על ביטוי גנים מכוננת, inducible מתוארים בשלב 1, 2, 3 ו- 4.

  1. להתכונן saline 0.9% סטרילי הזרקה (לעשות לא השתמש PBS). שימוש באמצעי אחסון המתאים על 10% ממשקל הגוף העכבר. דוגמה: לעכבר השוקל 20 גרם, להכין 2 מ"ל של פתרון.
  2. להכין את הווקטורים הזרקת היו לטהר על-ידי ערכת טיהור של פלסמיד נטולת אנדוטוקסין18 (ראה שלב 1.8 או 4.8, בהתאמה).
  3. להוסיף 10 µg או 15 µg של נטול אנדוטוקסין היפהפייה הנרדמת לבנות וקטור (מ שלב תריחבל 10 µg, משלב 4 שימוש 15 µg, בהתאמה) ו- µg 1 של pc-HSB5 נטולת אנדוטוקסין21 לכל מ ל תמיסת סטרילית.
  4. חנות פתרון עבור עד 4 שעות-4 מעלות צלזיוס. אין להקפיא.

6. ביצוע הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

  1. השתמש restrainer של הזרקת וריד הזנב (מסחרי או מוכן של צינור חרוטי 50 מ עם חורים על הנשימה ועל הזנב). למלא התחתון של הצינור עם נייר טישו.
  2. להזרקה, השתמש עכברים של בערך בגיל 8-10 שבועות עם משקולות של 20 – 25 גר'.
  3. שוקל לעכברים לפני הזרקת ולהכין נפח הזרקה לפי משקל הגוף (המקביל 10% ממשקל הגוף, ראה שלב 5.1). היכונו סטרילית 3 מ"ל-מזרק עם מחט-G 27 הזרקה ומילוי עם נפח הנדרשת.
  4. הנח את העכבר לתוך restrainer. התאימו את כמות נייר טישו (ראה שלב 6.1) לעזוב את שטח מזערי לתנועה אבל מספיק מקום לנשום.
  5. ודא כי העכבר הוא נושם באופן קבוע.
  6. חם הזנב באמצעות מנורת אינפרא-אדום עבור 30-60 ס בזהירות לצפות סימנים של התחממות יתר.
  7. לנקות את הזנב עם ספוגית אלכוהול.
  8. הכנס את המחט כמעט אופקית או שאחד הוורידים הזנב לרוחב שני קרוב בבסיס הזנב.
    הערה: אם מניחים בהצלחה, כמות קטנה של דם וזורמים לתוך קונוס של המחט. לא מומלץ לרוקן פעיל כמו כל תנועה נוספים של המחט עלולה לגרום תזוזה שלה ו/או פגיעה הווריד.
  9. להזריק את הנפח הכולל המזרק הזנב בתוך 8-10 s.
  10. מיד להסיר את העכבר restrainer. לדחוס הזרקת פצע לפחות 30 s או עד דימום שוככת.
  11. הנח את העכבר לתוך כלוב נפרדים. ברגע העכבר שיחזר מההליך (בערך 30-60 דקות), להעביר את העכבר בחזרה לכלוב המקורי שלה. בדוק על העכבר באופן קבוע על ה 24 הבא.
    הערה: סמי הרגעה קלים של העכבר הוא ציין באופן שגרתי עבור עד 2 שעות לאחר ההזרקה.
  12. לפני שתמשיך עם עוד ניסויים (קרי, שלב 7), לחכות 10-15 ימים לאישור של וקטורים שאינה משולבת.

7. אינדוקציה של CreER Transfected עם טמוקסיפן

התראה: טמוקסיפן היא מזיקה, עשוי להיות סרטניים או נזק לפוריות. נא לפנות גיליון בטיחות.

  1. מתכנן טמוקסיפן בקרום הבטן זריקות שלושה ימים רצופים.
  2. יום 1, להמיס 10 מ"ג טמוקסיפן באתנול µL 40. דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות מערבולת מספר פעמים עד טמוקסיפן יש התפרקה.
  3. מוסיפים שמן תירס µL 960. תקופת דגירה של 5 דקות-55 מעלות צלזיוס. מערבולת כמה פעמים כדי לקבל פתרון ברור.
  4. הכינו את הפתרון ב מזרק אינסולין 1-mL עם מחט 27 גרם.
  5. עורפה העכבר על ידי תופס בצוואר של העכבר בזהירות עם האגודל, האצבע השניה, לתקן את הזנב בין הבסיס של היד את האצבע הרביעית והחמישית.
  6. מזריקים 0.1 מ"ל (= 1 מ ג של טמוקסיפן) של הפתרון intraperitoneally לתוך המשולש התחתון השמאלי של הבטן.
  7. חזור על הזריקות בימים השני והשלישי.

8. אינדוקציה של טטרציקלין תלוית גן או shRNA ביטוי

התראה: דוקסיציקלין עלול להיות מזיק. נא לפנות גיליון בטיחות.

הערה: בהתאם לסוג משך הניסוי, דוקסיציקלין יכול להיות מסופק על שתיית מים (שלב 8.1) או צ'או (שלב 8.2)

  1. לניסויים לטווח קצר (< 10 ימים) לנהל דוקסיציקלין באמצעות שתיית מים באמצעות פרוטוקול הבאים.
    1. להמיס סוכרוז 5 g ב- 100 מ של מי ברז. אוטוקלב.
    2. להמיס 100 מ ג דוקסילין-hyclate ב 5 מ של סוכרוז פתרון (שלב 8.1.1) צינור חרוטי 15-mL.
    3. באמצעות מזרק 10-mL, מסנן סטרילי הפתרון דרך מסנן 0.2 µm. הוסף הפתרון סוכרוז מוכן בשלב 8.1.1.
    4. לספק פתרון דוקסיציקלין-סוכרוז כמו שתיית מים העכבר. בדוק מדי יום והחלף הפתרון הופך מעוננים המציין מוגבר (החלף, ברור פתרון לאחר שלושה ימים לכל המאוחר).
  2. לניסויים לטווח ארוך (> 10 ימים) או ניסויים רגיש לשינויים מטבוליים, השתמש דוקסיציקלין מסחרי-צ'ו (למשל, דוקסיציקלין Hyclate צ'או 0.625 g/kg) כדי למנוע התייבשות ו/או שינויים סוכרוז-induced הכבדים של מטופלים בעלי חיים.

9. הכנת הכבד העכבר לניתוח על ידי Immunostaining

התראה: Paraformaldehyde עלול להיות מזיק. נא לפנות גיליון בטיחות.

הערה: timepoint כאשר עכברים ינותחו תלוי בניסוי. מומלץ לנתח רקמת הכבד לאחר לא פחות מ 3 ימים של טיפול דוקסילין כדי להבטיח מספיק אינדוקציה של הביטוי transgene או shRNA.

  1. להכין מזרק 1 מ"ל עם מחט 27 G עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde פתרון (PFA).
  2. המתת חסד העכבר על ידי שיטה המתאימה על פי פרוטוקול בעלי חיים מאושרים.
    הערה: הנחיות שיטות המתאימות של המתת חסד עשוי להשתנות בהתאם המוסד.
  3. בזהירות באמצעות מספריים ויבתר ומלקחיים אנטומיים, פתח חלל הבטן עם פתיחה של הבטן החציוני כדי לחשוף את הכבד. להעביר הזכות לחשוף את וריד שער הכבד ואת הכלילי התחתון (IVC) המעי הדק.
  4. את המחט של המזרק מוכן (ראה שלב 9.1) לתוך IVC ו לחתוך וריד שער הכבד. להזריק 1 מ"ל של כדורגלן לאט לתוך IVC perfuse רקמת הכבד ולהסיר כדוריות דם אדומות אוטומטי-פלורסנט (רצוי אם צביעת immunofluorescent יבוצעו).
  5. הסר את הכבד. לשטוף במים ולהעביר ל 5-10 מ של 4% PFA פתרון.
  6. עבור מקטעים פרפין, תיקון רקמות עבור 36-48 ה רקמה מוכן עבור פרפין והטבעה של התייבשות.
  7. עבור מקטעים קפוא, לתקן את הרקמות ב 4% PFA לשעה.
    1. עבור cryoprotection, העברת 10% סוכרוז פתרון. דגירה 60 דקות.
    2. העברת 20% סוכרוז פתרון. דגירה 60 דקות.
    3. העברת 30% סוכרוז פתרון. דגירה 12-16 ה Embed ההטמעה של תרכובת למקטעי קפוא ומקפיאים ב-20 ° C.

תוצאות

תקנים היעילות באמצעות הזרקת וריד הזנב hydrodynamic: האחוז של hepatocytes מאתר זה הם transfected hydrodynamically על ידי זריקה אחת הוא משתנה ותלוי במספר פרמטרים כגון נפח הזרקה, הזרקת זמן, כמות ה-DNA מוזרק וגודל של הבונה מוזרק6, 22,23. בנוסף, ה?...

Discussion

תרביות תאים של hepatocytes עם הזרקת וריד הזנב hydrodynamic הפכה שיטה הוקמה מאז השקתו לפני יותר מ- 15 שנה6. אמצעי האחסון מוזרק חורג תפוקת הלב, זורם מן הכלילי התחתון לתוך sinusoids של הכבד7, שמוביל תקנים של בערך 10-20%, במקרים מסוימים עד 40% של hepatocytes25,26. גורמ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Krebshilfe, גרמניה (מספר גרנט 111289 כדי UE), הקרן ולוסיל פקארד הבריאות של הילדים (ארנסט, אמיליה גאלו ניחן הבתר - CTSA מספר גרנט UL1 RR025744 מורה). אנו מודים ד ר מארק א קיי על וקטור בונה ותמיכה עצה ניסיוני ומרווה ג'וליאן ד ר עבור עכברים ו ניסיוני.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher#SM1331DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T.Sakura4583embedding of cryo-sections
Biozym LE AgaroseBiozym840004
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
D(+)-SaccharoseCarl Roth4621.1For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium SaltAppliChemA0839,0010For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller)Carl RothX969.1
LB Broth (Luria/Miller)Carl RothX968.1
S.O.C. MediumThermo Fischer15544034
Gentamicin sulfateAppliChemA1492,0001For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 %Fa. RothP087.6para-formaldehyde solution
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mixinvitrogen/ThermoFisher11791-020contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent CellsThermo Fisher11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo FisherC737303
NameCompanyCatalog NumberComments
Restriction Enzymes
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacINew England BioLabsR0156S
SpeINew England BioLabsR0133S
KpnINew England BioLabsR0142S
NotINew England BioLabsR0189S
XhoINew England BioLabsR0146S
BfuAINew England BioLabsR0701S
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean UpMacherey & Nagel740609.10
NucleoBond PC20Macherey & Nagel740571Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500Macherey & Nagel740574Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo FisherF530S
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 mlBraun9166017VFor intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 mlBraun4616025VFor intravenous injection
Sterican Cannula 24GBraun4657675
Sterican Cannula 27GBraun4657705
TamoxifenSigma-AldrichT5648-1GFor CreER activation
Corn oilSigma-AldrichC8267-500MLCarrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclateAppliChemA2951,0025Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml SyringeBraun4606108V
Filtropur S 0.2Sarstedt831,826,001For filtration of doxycycline
NaCl 0,9%Braun3200905Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50mlCorning Life Science352095
Infrared LampN/AN/AFor warming of mouse tail
IVISPerkin Elmer124262In vivo imaging system
NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTCn/aVector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcsAddgene #25755Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2Addgene #25753Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2Addgene #25752Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-TetAddgene #85578Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-TetAddgene #85577Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11

References

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132transposonhydrodynamic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved