לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Summary

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

Abstract

אינטראקציות חלבון-חלבון הם מנגנוני היסוד ממסר אותות ב תהליכים תאיים ביותר; לכן, זיהוי של זוגות אינטראקציית חלבון הרומן וניטור dynamics אינטראקציית חלבון הן עניין מיוחד לחשוף כיצד צמחים מגיבים גורמים סביבתיים ו/או אותות התפתחותית. שפע של גישות פותחו כדי לבדוק אינטראקציות חלבון-חלבון, או בתוך חוץ גופית או ויוו. ביניהם, קומפלמנטציה לוציפראז הוקמה לאחרונה הדמיה (LCI) וזמינותו היא השיטה הפשוטה והמהירה על הפגנת ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון. ב הזה assay, חלבון א' או חלבון B הוא התמזגו עם החצי אמינו-מסוף או carboxyl-מסוף של לוציפראז, בהתאמה. כאשר חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, מחדש את שני החצאים של לוציפראז כדי ליצור אנזים לוציפראז פונקציונלי ופעיל. ניתן לרשום לוציפראז פעילות luminometer או של מצלמות-מצלמה. לעומת גישות אחרות, וזמינותו LCI מראה אינטראקציות חלבון-חלבון איכותית והן באופן כמותי. Agrobacterium חדירה טבק benthamiana העלים היא מערכת בשימוש נרחב עבור ביטוי חלבון ארעית. עם השילוב של LCI וביטוי ארעי, גישות אלה מראים כי האינטראקציה הפיזי בין COP1 SPA1 צומצם בהדרגה לאחר הטיפול יסמונט.

Introduction

על מנת לתאם צמיחה עם סביבתו, הצמחים התפתחו אלגנטי איתות המסלולים לחוש, מגלי, ולהגיב רמזים איתות. כמו הרצים במירוץ שליחים, חלבונים הם שחקנים הכרחי צמח מעבר אותות. זה הוכרה נרחב אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI) ממלא תפקיד חשוב לקשר סוללרי. זירחון חלבונים, acetylation, והשפלה תלויים כל מגע פיזי בין חלבון המטרה ואנזימים שינוי שלה. לדוגמה, חלבונים משפחה של חלבון (ג'אז) יסמונט צים-תחום אינטראקציה עם גורם שעתוק MYC2, לדכא את פעילות גנים ברמת השעתוק^1,2. לאור החשיבות של PPI, חלבון בקנה מידה גדול interactomes בצמחים כבר בחנו לאחרונה^3,4,5. תוצאות interactome אלו עוד יותר לחשוף את הרשת רגולטוריות מורכבות מרכזת תאיים מגוונות.

יש כמה גישות הוקמה עבור ניטור PPI. שמרים שני וזמינותו היברידית (Y2H) היא השיטה הנפוצה ביותר לגילוי PPI. Y2H הוא קל לביצוע, מתאים בדיקה מהירה לבדוק אינטראקציות חלבון. Y2H הוא גם משמש לסינון שותפים אינטראקציה לא ידוע עבור ספציפיים החלבון-של-הריבית. עם זאת, מכיוון Y2H מתבצעת לחלוטין בשמרים, זה אינו יכול לשקף התרחיש האמיתי בצמח תאים, מביא תעריפים חיובי כוזב. האסטרטגיה דומה נוספת היא וזמינותו נפתחים. באופן כללי, שני חלבונים הם הביעו מטוהרים מתאי Escherichia coli ו מעורב ואז מתאושש לגילוי אינטראקציות חלבון. למרות ששיטה זו אינה אורכת זמן רב, באפשרותו לקבל ויוו תוצאות האינטראקציה גם. למטרות ויוו אינטראקציה, co-immunoprecipitation (co-IP) הוא וזמינותו הפופולרי ביותר, אשר דורש נוגדן באיכות גבוהה כדי immunoprecipitate החלבון-של-הריבית לא יכול לפסול את האפשרות של להדברה עקיף. יתר על כן, בשל ההליכים ניסויי הסבוכים ב- co-IP, התוצאות בדרך כלל משתנות עם מומחיות בודדים.

מבחני שיחזור כתב מבוסס במידה רבה מראש הזיהוי ויוו PPI. שיטות אלה כוללות פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)⁶, זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC)⁷ו את גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה assay (LCI)⁸. אמנם אלה שלוש גישות יותר co-IP כדי לשקף את ישירה ויוו PPI, סריג, BiFC צריך מיקרוסקופ ספציפי כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית אותות, בקלות לא יכול לכמת את עוצמת האינטראקציה. לעומת זאת, LCI מנצל גחלילית לוציפראז, אשר יווצר מצב לאחר מגיבים luciferin המצע שלה. חשוב יותר, עוצמת PPI יכול להיקבע מהערך של לוציפראז פעילות. לפיכך, LCI מציין לא רק אם שני חלבונים אינטראקציה או לא, אך מספק מידע על הדינמיקות אינטראקציה בעת הטיפול. אמנם יש כמה שיטות הוקמה עבור ניטור אינטראקציה דינמיקה (מבוסס על משטח פלזמון תהודה או תרמו-יציבות משמרות)^9,10, גישות אלה דורשות כלים עדינים או תיוג ספציפית. לעומת זאת, LCI קל לבצע ולגלות.

העיקרון של LCI זה החצאים אמינו-מסוף, carboxyl-מסוף של לוציפראז (בשם N-לוק או C-לוק, בהתאמה) היו התמזגו עם חלבון A ו- B, אלה היתוך שני חלבונים היו בו זמנית לידי תאי צמחים. אם חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, להיות מחדש את שני החצאים של לוציפראז להיות אנזים לוציפראז פעיל. לוציפראז פעילות יכול להתגלות עם luminometer או מצלמת CCD. זה לא הכרחי כדי לקבל transformants יציב LCI; הביטוי ארעי מספיקה כדי להשיג תוצאה אינטראקציה באיכות גבוהה.

סוג הטבעת E3 אוביקוויטין ליגאז קונסטיטוטיביות photomorphogenic 1 (COP1) אינטראקציה עם מספר עצום של גורמי שעתוק ומקדם שפלותם דרך ה 26 פרוטאוזום¹¹. כמה גורמי שעתוק, ממוקדות COP1 אלה הם חיוביים לשסתומי פוטומורפוגנזה. באפלה, COP1 מקיים אינטראקציה עם משתיק קול של פיטוכרום A-105 1 (SPA1), אשר מגביר פעילות COP1 E3⁸. לאחר תפיסת האור, photoreceptors ביטל את האינטראקציה COP1-SPA1 לעכב פעילות COP1 ו אז תייצב COP1 סובסטרטים^12,13,14. דוגמה זו ממחישה את משמעות ביולוגית לומד PPI וקביעת PPI dynamics.

Protocol

1. הכנת הצמחים (8 שבועות)

1. הכניסו זרעי benthamiana טבק 50 1.5 mL microcentrifuge שפופרת אחת המכילה 1 מ"ל של 5% NaClO ו- 0.1% טריטון X-100 (וי/V) פתרון ולהשאיר למשך 5 דקות לחטא את הזרעים.
2. לשטוף את הזרעים במים סטריליים 5 פעמים, להשעות את הזרעים ב 200 µL של מים סטריליים.
3. בזהירות המקום בודדים זרעים על גבי המשטח של MS-אגר בינוני (1 l: 1 x מלחי Murashige & Skoog, 10 גרם סוכרוז, pH 5.8 (KOH), 1% אגר) עם טיפים בסדר, חנות צלחות בינוני ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לסנכרן את הנביטה.
   הערה: כדי למנוע זיהום חיידק, יש לבצע פעולה זו על ספסל נקי. אין צורך לנער את הצינור במהלך עיקור.
4. מניחים צלחות בינוניות בתנאים הצמיחה רגילה (22 ° C, 80-90^-2µmolm s^-1 לבן עוצמת האור) למשך 10 ימים, ולאחר מכן להעביר את השתילים מונבטים לתוך הקרקע.
   הערה: הקפד להוסיף שורשים שתיל באדמה, לא לעשות נזק שורשי. מכסים את המגש עם שקוף פלסטיק מכסה למשך הלילה כדי לשמור על לחות.
5. לגדל צמחים בחדר גדילה מבוקרת על 16 h/8 h/כהה מחזור ו- 70% לחות. בת שבוע 7 צמחים benthamiana ש מוכנים Agrobacteriumtumefaciens חדירה (איור 1א').
   הערה: מים צמחים ושליטה מזיקים לפי הצורך כדי לשמור על הצמחים בריא.

2. ארעי ביטוי עלים (ש ע) Benthamiana (7-10 ימים)

1. לספק 150 ng של פלסמידים (pEGAD-HA-לוק פקד פלסמיד וקטור ריק, פלסמיד נבנה עבור LCI assay, במקרה זה השתמשנו pCAMBIA1300-Nluc ו- pCAMBIA1300-Cluc לבנייה פלסמיד) לתא המוסמך tumefaciens א זן GV3101 עם שיטת אלקטרופורציה סטנדרטי.
2. תרבות tumefaciens א -לוריא-Bertani (LB) אגר בינוני (1 l: 10 גרם NaCl, תמצית שמרים 5 גרם, 10 גרם טריפטון, 1.5% אגר) המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 50 של ריפאמפיצין ב 28 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים.
   הערה: הבחירה של אנטיביוטיקה תלוי וקטור ואת המתח tumefaciens א בשימוש.
3. לחסן אחד יחיד tumefaciens א המושבה של כל צלחת לתוך 3 מ ל LB בינוני נוזלי המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- 50 µg/mL של ריפאמפיצין וללחוץ על סל ד 220-28 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה להפיץ תרבית תאים.
4. העברת µL 75 של התרבות חיידקי לתוך 15 מ"ל טריים LB נוזלי בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 50 של ריפאמפיצין, לדלל אותה לפי פקטור של 200. התרבות החיידק ב 220 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס במשך כ- 8 שעות, עד OD₆₀₀ בין 0.5 ל 1.0.
5. העברת התרבות נוזלי א tumefaciens 15 mL צנטריפוגה צינורות צנטריפוגה ב g 4,000 x ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להשליך תגובת שיקוע, להשעות את צניפה ב 15 מ"ל של טרנספורמציה פתרון לרחוץ גלולה.
6. לסובב את הצינור ב 4,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. חזור על השלב כביסה פעם נוספת.
7. Resuspend בגדר ב 5 מ של טרנספורמציה פתרון ולשמור על 2 h בטמפרטורת החדר. התאם את הצפיפות של תאים tumefaciens א גלולה עם השינוי פתרון עד הריכוז הסופי של יתר₆₀₀ הוא 0.5, או לערבב שני מדגמים עם נפח שווה עבור אינטראקציות חלבון לזווג הבדיקה.
8. לחדור מושעה תאים לתוך 4^th ל 7^th עוזב עם מזרק needleless 1 מ"ל (איור 1בג). לאחר חדירה, לכסות את הצמחים מיד עם כיסוי פלסטיק שחור ומניחים את המגש באפלה במשך 12 שעות. לאחר מכן, לגדל צמחים כרגיל במשך 2-4 ימים לפני גילוי לוק פעילויות.
   הערה: בחר עלים בריאים גודל דומה. החדירה של ארבעה אזורים שונים בתוך עלה אחד בסדר גמור

3. זיהוי פעילות לוציפראז (יום אחד)

הערה: יש שתי דרכים לעקוב אחר פעילות לוציפראז. אחד מבוסס על הדמיה, והשני הוא למדוד באופן כמותי לוציפראז פעילות.

1. שיטת הדמיה
   1. ניתוק של עלה הסתנן ולשים את התשמ"ו באמצעי MS-אגר.
   2. תרסיס luciferin מאגר עובדים על גבי המשטח adaxial עלה עם בקבוק ספריי 50-mL. להשאיר את החומרים באפלה במשך 5 דקות כדי להרוות את כלורופיל האוטומטי-ידי קרינה פלואורסצנטית.
   3. השתמש תאורה CCD מקורר הדמיה המנגנון (מקורר עד למינוס 30 מעלות) כדי ללכוד תמונות (איור 2). חשיפה הגיש אור השעה 50 מילישניות, זמן הארה זיהוי 1 דקות.
      הערה: להתאים את הפרמטרים על פי המדריך המכונה. טמפרטורות נמוכות יותר יהיה לשפר את יחס אות לרעש לשיפור איכות התמונה.
2. לחלופין, למדוד לומינסנציה ישירות עם luminometer מסחרי.
   1. בזהירות לגזור קטעים עלה (כ 0.25 ס מ²) מהאזור הסתננות של העלים (ש ע) benthamiana , לטבול את הדיסק עלה לתוך µL 100 יונים מים בצלחת לבנה 96-ובכן (איור 3).
   2. להוסיף 10 µL luciferin עבודה מאגר ולהשאיר למשך 5 דקות. לאחר מכן לבצע טיפולים ספציפיים כדי ללמוד את הדינמיקה אינטראקציית חלבון.
      הערה: לזהות את הפריה חוץ גופית עם luminometer בנקודות זמן שונות כדי להשיג את הדינמיקה פעילות לוציפראז, אשר מייצגים את קינטיקה של אינטראקציות חלבון-חלבון תחת טיפול מסוים. בשיטה זו יש יתרונות לבדיקת מספר רב של זוגות חלבון בו זמנית. אלה שאינם luminometer מסחרי לבחון את abundances חלבון לוציפראז על ידי תספיג, ולכן מתייחסים quantitively פעילות לוק. אם האור אינו נדרש בהכרח, רק לשמור את הצלחת luminometer ומדידת לומינסנציה בנקודות זמן שונות. אחרת, להעביר את הצלחת לתוך תא הצמיחה במהלך הפער זיהוי. כדי להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, השתמש משכפל ביולוגית לפחות שלושה. אף לוק פעילויות מאזורי חדירה שונים משתנים, דפוסי שינוי שלהם הם עקביים לאחר נורמליזציה.

תוצאות

שלושה שלבים עיקריים יכול עכישו ב פרוטוקול קומפלמנטציה זה לוציפראז ללמוד חלבון אינטראקציות בויוו, כולל צימוח, טבק חדירה ואת וזמינותו לוציפראז. הצעד המכריע ביותר פרוטוקול זה הוא חדירה נוזלי tumefaciens א לתוך עלים (ש ע) benthamiana (איור 1).

Discussion

פרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, ללמוד ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון, הדירים מתאים במיוחד לגילוי חלבון dynamics אינטראקציה תחת טיפול אקסוגני. הצעד מפתח זה וזמינותו היא חדירה benthamiana ש . כדי להבטיח הצלחה הסתננות, הצמחים להיות בריא מאוד. גורם קריטי נוסף הוא מתי לבדוק פעילות לוציפראז לאחר חד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transformation solution
10 mM Morpholineethanesulfonic acid	VETEC	V900336
27.8 mM Glucose	VETEC	V900392
10 mM MgCl2×6H2O	VETEC	V900020
150 μM Acetosyringone	ALDRICH	D134406
pH 5.7
Luciferin working buffer
5 mM Luciferin potassium salt	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O to 10 ml