וזמינותו פשוטה מבוססת-תא Immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי כנגד הקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) בדם

Summary

אנחנו ectopically לידי יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים עובריים אנושיים (HEK293) כמו אנטיגן לזהות עצמיים כנגד קולטן NMDA בדם של חולים חשוד עם דלקת אוטואימונית. שיטה פשוטה זו עשויה להיות מתאימים לסינון למטרות בהגדרות קליניים.

Abstract

הנוכחות של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי יכול לגרום לסימפטומים מנוטלי שונים של חולים מושפעת, כינה דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA. זיהוי נוגדן עצמי ספציפי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי שדרתי (CSF) חיונית לאבחון מדויק של מצב זה. קולטן NMDA הוא יון ערוץ חלבון מורכב המכיל ארבע subunits, כולל שני חובה NMDA קולטן יחידת משנה 1 (NR1), אחד או שניים קולטן NMDA 2A יחידה משנית (NR2A), 2B יחידת משנה של קולטן NMDA (NR2B), יחידת משנה של קולטן NMDA 2C (NR2C), או קולטן NMDA יחידת משנה 2D (NR2D). Epitope של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי נמסר להיות נוכח בכל תחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה מבוססת-תא immunofluorescence יכול לשמש כבדיקת סינון כדי לזהות הנוכחות של עצמיים נגד NR1 יחידת משנה של קולטן NMDA בדם כדי להקל על מחקר קליני ובסיסי של דלקת אוטואימונית קולטן אנטי-NMDA.

Introduction

דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA הינה ישות לאחרונה המחלה יכולה להתרחש אצל חולים בכל הגילאים, והוא משפיע בעיקר המטופלות^1,2. . זה אחד אנצפליטיס מאובחנים לעתים קרובות ביותר בקרב מטופלים עם אטיולוגיה לא ידועה הראשונית של דלקת קרום המוח³ החולים מושפעים עם אנטי-NMDA קולטן אנצפליטיס בדרך כלל יש prodromal סימפטומים של כאב או חום, ואחריו התפתחות מהירה של התודעה רמת השינוי ומגוון רחב של סימפטומים מנוטלי חריפה, כולל עצבנות, רגזנות , חרדה, נדודי שינה, הזיות, אשליות, תוקפנות, התנהגויות מוזרות, הפרעות התנועה, dysregulation אוטונומי, ותפיסה תוקף^4,5. זיהוי מוקדם של תנאי זה במועד טיפול עם חיסוני חשובים תוצאה טובה יותר, החלמה מלאה אפילו חולים מושפעת⁶. לפיכך, הוא הציע כי דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA צריך להיחשב אבחנה מבדלת חשוב מהחולים בדלקת חריפה או התפרצות חדשה תכונות פסיכוטיות^7,8.

מלבד תכונות קליני, זיהוי של נוגדן עצמי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי-שדרתי חיונית לאבחון מדויק של אנטי-NMDA קולטן דלקת אוטואימונית⁹. רוב הבדיקות אימונולוגי כדי לזהות את נוגדן עצמי קולטן NMDA נגד זמינים כמה מחקר מעבדות^10,11, ויש אחד בלבד זמינים מסחרית מבוססת-תא immunofluorescence assay להקרנה אנטי-NMDA קולטן עצמיים¹². מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה ללא צורך במיקור חוץ immunofluorescence מבוססת תא בנוחות ניתן במעבדה למסך את הנוכחות של אנטי-NMDA עצמיים קולטן כדי לקדם את המחקר הקליני של קולטן NMDA-נגד דלקת אוטואימונית. קולטן NMDA הוא heterotetramer יון ערוץ חלבון מורכב הביעו במפורש במוח. הוא עשוי שתי subunits NR1 חובה, ואת השילוב של subunits אחד או שניים של NR2A, NR2B, NR2C או NR2D¹³. מחקר קודם דיווחו כי epitope הראשי ממוקד על ידי הנוגדנים התחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR1⁵. לפיכך, ב פרוטוקול זה, אנו מבטאים את החלבון NR1-יחידת משנה רקומביננטי האנושי של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשורת תאים אפיתל כליות עובריים אנושיים (HEK293), ולפתח assay מבוססת-תא immunofluorescence כדי לזהות מחלקת IgG של אנטי-NMDA קולטן עצמיים בדם.

Protocol

המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה לוח של צ'אנג קונג ממוריאל החולים לפי Linkuo, שוויץ (102-2577A3).

1. הכנת פלסמיד ביטוי NR1-GFP

1. מיקס 10 ng של NR1-GFP פלסמיד עם 100 µL של זן תאים המוסמכת Escherichia coli DH5α ב mL 1.5 סטרילי צנטריפוגה שפופרת, pipet התערובת בעדינות למעלה ולמטה בעיות 4 - 6 פעמים, דגירה הצינור על קרח למשך 20 דקות.
2. דגירה הצינור ב 42 ° C עבור 1 דקות באמבט מים, להסיר את הצינור לאמבט מים, להוסיף 1 מ"ל lysogeny מרק (LB) בינוני לתוך הצינור, דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור ברעידות לשעה.
3. להפיץ את µL 50 של התערובת על צלחת אגר LB המכיל אמפיצילין (0.1 mg/mL), דגירה של צלחת אגר LB ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור בן לילה.
4. לבחור מושבה בודדת מהצלחת לילה LB אגר באמצעות טיפ סטרילי, ו מערבולת הטיפ ב צינור התרבות חיידקי המכיל 5 מ ל LB בינונית, אמפיצילין (0.1 mg/mL). דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור ברעידות בן לילה.
5. Aliquot 3 מ"ל של התרבות חיידקי לילה לתוך בקבוקון 500 מ"ל המכיל 250 מ ל LB סטרילי בינוני אמפיצילין (0.1 mg/mL). דגירה. הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות. לבדוק באופן קבוע את צפיפות סיב אופטי (OD) של התרבות חיידקי-גל של 600 nm באמצעות ספקטרומטר עד OD600 מגיע 0.6-1.0.
   הערה: מערבבים היטב 800 µL של התרבות חיידקי לילה עם 200 גליצרול µL להכין את המניה גליצרול, ולאחסן את המניה גליצרול תחת-80 ° C לשימוש עתידי.
6. להכין NR1-GFP פלסמיד ביטוי מן התרבות חיידקי 250 מ
   1. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C.
   2. Resuspend בגדר חיידקים 10 מ"ל resuspension מאגר המכיל RNase A; מערבולת ביסודיות עד סבך לא נתפסת.
   3. להוסיף 10 מ ל מאגר פירוק המתלה חיידקי בעדינות להפוך את התערובת 4 - 6 פעמים, דגירה lysate בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
   4. להוסיף 10 מ ל משקעים טרום מקורר מאגר lysate, היפוך בעדינות את התערובת 4 - 6 פעמים.
   5. שופכים את lysate לתוך החבית של מחסנית מסנן עם הכיפה על; לחכות 10 דקות ב- RT.
   6. להסיר את הכובע של הצינור לשקע מחסנית הכנס פומפה לתוך הדיו, לחץ בעדינות על הבוכנה. לאסוף את המסוננות lysate לתוך צינור 50 מ ל.
   7. להוסיף 2.5 מ ל קניינית מאגר מהיצרן כדי המסוננת lysate, לערבב את התערובת על ידי היפוך הצינורית כ 10 פעמים, דגירה התערובת בקירור למשך 30 דקות.
   8. החל את התערובת lysate מסוננים עמודה מסנן זה היה מראש equilibrated עם 10 מ"ל equilibration מאגר. לאפשר את העמודה לנקז חוק המשיכה.
   9. לשטוף את העמודה עם מאגר לשטוף 30 מ ל פעמיים, ולאחר מכן elute DNA מן העמודה באמצעות מאגר • תנאי 15 מ"ל.
   10. להוסיף אלכוהול איזופרופיל 10.5 מ ל (0.7 כרכים) מאגר ה-DNA eluted, מערבבים היטב, וכן centrifuge את התערובת ב g x 20,000 למשך 30 דקות ב 4 º C.
   11. Decant את תגובת שיקוע בקפידה בגדר DNA עם אתנול 70% ללא אנדוטוקסין מ ל פעם אחת, וקונטה צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 10 דקות.
   12. Decant את תגובת שיקוע, מתייבשים בגדר למשך 5-10 דקות בשכונה כימי, להמיס בגדר ב- 300-500 µL אנדוטוקסין ללא מאגר.
   13. לקבוע את הריכוז פלסמיד על ידי מדידת ספיגת הפתרון ב UV 260/280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.
       הערה: להכין את הביטוי פלסמיד GFP שימוש באותו הפרוטוקול.

2. תקנים של תאים HEK293 עם NR1-GFP ביטוי פלסמיד

1. Aliquot µL 200, ג'לטין 2% לפתרון אחד טוב של צלחת התרבות 48-ובכן, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
2. האחות הפתרון ג'לטין מתאי 5 x 10⁴ HEK293 היטב, הזרע ב 200 µL בינוני התרבות התא המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) כל היטב. דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה humidified שסופק עם 5% CO₂ בן לילה.
   הערה: תאים נספרו באמצעות של hemocytometer.
3. ביום הבא, להחליף את המדיום תרבות בילה µL 200 טרי בינוני תרבות המכיל 10% FBS לכל טוב.
4. עבור כל יחידה, להכין פתרון A על ידי ערבוב 100 ננוגרם של פלסמיד NR1-tGFP עם 20 µL תרבות בינוני, פתרון B על ידי ערבוב 0.8 ריאגנט תרביות תאים µL 20 µL תרבות בינונית. הכפל את מספר בארות דרושים כדי להכין את הנפח הכולל עבור כל ניסוי.
5. להכין פתרון C על ידי ערבוב פתרון A ו- B פתרון, דגירה התערובת ב RT למשך 20-30 דקות.
6. Aliquot µL 40 לפתרון C כל טוב המכילה תאי HEK293, מערבולת את הצלחת בעדינות, דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה humidified שסופק עם 5% CO₂ בן לילה.
7. בדוק את הביטוי של NR1-GFP חלבון רקומביננטי בתאי המארח במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 40 X-200 X הגדלה (עירור/פליטה: 482/502 nm), והמשך וזמינותו מבוססת-תא immunofluorescence.
   הערה: Transfect את פלסמיד ביטוי GFP לתוך התאים HEK293 תוך שימוש באותו הפרוטוקול.

3. מבוססת-תא Immunofluorescence Assay

1. האחות המדיום בילה מן הבארות, ואז תשטוף בכל טוב עם µL 200 של פוספט buffered מלוחים (PBS) שלוש פעמים.
2. להוסיף 200 µL של 4% paraformaldehyde פתרון כל טוב; דגירה את הצלחת ב RT למשך 15 דקות.
3. האחות הפתרון paraformaldehyde מן הבארות, ולשטוף את כל טוב עם µL 200 ל- PBS שלוש פעמים.
4. להוסיף 200 µL של חלב רזה 10% ב- PBST (0.1% Tween-20 ב- PBS) פתרון אחד טוב, דגירה את הצלחת ב RT עבור h 1 ברעידות עדין.
5. האחות של חלב רזה 10% הפתרון PBST מן הבאר, ולאחר מכן לשטוף פעם הבארות עם 200 µL PBST.
6. דגירה הבארות עם פלזמה מדולל (בטחונות ב PBST) כמו נוגדן ראשוני עם טלטול עדין-RT לשעה.
   הערה: פלזמה מתקבל מהדם של חולים החשודים יש דלקת אוטואימונית.
7. האחות פלזמה מדולל מן הבארות, ולשטוף כל טוב עם 200 µL של PBST שלוש פעמים.
8. להוסיף 200 µL של עז בן אנוש אנטי איג מצומדת עם אלקסה עבור חיל הים 594 (1:1, 000 דילול ב- PBST) כדי מכל קידוח, דגירה לצלחת תרבות ב RT עם טלטול עדין לשעה.
9. תשאף עז האנושי אנטי איג מצומדת עם אלקסה עבור חיל הים 594 פתרון, ולשטוף כל טוב עם 200 µL של PBST שלוש פעמים.
10. להוסיף 100 µL גליצרול פתרון (50% גליצרול PBS, כוללות של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)) כל טוב.
11. לצפות, תמונה התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות 10 X עינית, ו- 4 X 10 X, 20 X מטרות.
    הערה: השתמש במסנן המתאים עבור כל צבע: עבור NR1-GFP (עירור/פליטה = 482/502 nm), עבור אלקסה עבור חיל הים 594 (עירור/פליטה = 561/594 nm), עבור דאפי (עירור/פליטה = 358/461 ננומטר). לנהל את הפקד שליליים באמצעות התאים HEK לבטא GFP באותה דרך.

תוצאות

בממוצע, אנחנו יכולים להשיג 200-300 µg ביטוי נטולת אנדוטוקסין פלסמיד NR1-GFP GFP מתרבות חיידקי 250 מ ל ביצוע הפרוצדורות המתוארות בסעיף 1 של הפרוטוקול. כמות של 100 ng/טוב של פלסמיד הביטוי שימשה תרביות תאים של תאי HEK293 תרבותי בצלחת 48-ובכן, כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. h 24-30 לאחר תרביות תאים, ה...

Discussion

ישנם מספר מבוססת תא אימונולוגי מבחני למסך את הנוכחות של עצמיים כנגד קולטן NMDA שדווחו בספרות, כולל חיים מבוססת-תא immunofluorescence assay¹¹, קבוע מבוססת-תא immunofluorescence assay⁹ , ואת וזמינותו מבוססי cytometry זרימה¹⁴. וזמינותו immunofluorescence מבוססת תא חי יש לבצעו מיד לאחר ההכנה של ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate	Thermo Fisher	11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher	A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)	Euroimmun AG, Lübeck, Germany	CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit