JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה פרטים הקמה ותפעול של מיקרוסקופ מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד מסוגל מעקב הננומטרי פלורסנט רגשים במהירויות גבוהות המפזרת, המחירים ספירה נמוכה פוטון.

Abstract

בזמן אמת חלקיק יחיד תלת מימדי מעקב (RT-3D-SPT) יש פוטנציאל לשפוך אור על תהליכים מהירים, 3D במערכות סלולריות. למרות שיטות RT-3D-SPT שונות יש כבר העלו בשנים האחרונות, מעקב אחר במהירות גבוהה 3D לשדר חלקיקים במחירים נמוכים פוטון הרוזן נשאר אתגר. יתר על כן, RT-3D-SPT setups הם בדרך כלל מורכבת וקשה ליישם, הגבלת שלהם יישום נרחב לבעיות ביולוגי. פרוטוקול זה מציג מערכת RT-3D-SPT בשם 3D דינמי פוטון לוקליזציה מעקב (3D-DyPLoT), אשר ניתן לעקוב אחר חלקיקים עם המתפשט במהירות גבוהה (עד 20 /s2מיקרומטר) במחירים ספירת פוטון נמוך (עד 10 קילו-הרץ). 3D-DyPLoT מעסיקה מטה הטיה אלקטרו-אופטיים 2D (2D-EOD), עדשה tunable אקוסטית הדרגתי (תג) בכונן יחיד ממוקד בלייזר במקום באופן דינמי ב- 3D. בשילוב עם אלגוריתם להערכת מיקום אופטימיזציה, 3D-DyPLoT יכול להינעל חלקיקים יחיד עם מהירות גבוהה ודיוק גבוהה לוקליזציה. בשל עירור יחיד והפריסה יחיד איתור נתיב, 3D-DyPLoT הוא קל להגדיר ועמיד. פרוטוקול זה דן כיצד לבנות 3D-DyPLoT צעד אחר צעד. ראשית, מתואר הפריסה אופטי. בשלב הבא, המערכת מכויל, אופטימיזציה על ידי סריקה לסריקת חרוז פלורסנט nm 190 עם nanopositioner פיזואלקטריים. לבסוף, להפגין יכולת זיהוי 3D בזמן אמת, 110 nm חרוזים פלורסנט מתבצע במים.

Introduction

הופעתה של טכניקות הדמיה מתקדמות פתח חלון כדי לראות יותר מפורט מבנה התופעות הסלולר, כל הדרך עד לשלב מולקולארי. שיטות כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)1,2,3, לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ (דקל)4,5,6,7 מובנה תאורה מיקרוסקופ (SIM)8,9,10,11, מגורה פליטה דלדול מיקרוסקופ (STED)12,13, 14 הגיעו רחוק מעבר למגבלת עקיפה כדי לספק פירוט חסרת תקדים לתוך המבנה והתפקוד של תאים חיים. עם זאת, הבנה מלאה של מערכות אלה איך להתנהג דורש מידע דינאמי, כמו גם מידע מבנית. השיטות סופר רזולוציה המפורטים לעיל כוללות פשרה בין רזולוציה מרחבית רזולוציה טמפורלית, הגבלת הדיוק טמפורלית שבה פתור תהליכים דינאמיים. שיטה אשר מספק דיוק מרחבית גבוהה והן רזולוציה טמפורלית היא RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. כאן, אנו לצייר הבחנה בין תלת-ממד מסורתי-SPT30 מסורתית RT-3D-SPT. 3D-SPT פשוט דורש זמן שורה של נתוני תמונה תלת-ממדית (אשר ניתן לרכוש גם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ epifluorescence בהתחשב התצורה הנכונה). ב- 3D-SPT מסורתיים, נקבעות את הקואורדינטות של החלקיק לאחר איסוף נתונים על ידי איתור החלקיק בכל אוסף תמונות ו שרשור את מיקומי אחסון רצופים כדי ליצור מסלול. לשיטות אלה, ברזולוציה הטמפורלית האולטימטיבי נקבעת לפי הקצב הדמיה הנפחי. עבור מיקרוסקופ קונפוקלי, זו בקלות בהיקף של שניות ועד עשרות שניות. על שיטות epifluorescence, שבו הנתיב אופטי הוא מניפולציה כך למידע המיקום צירית ניתן לחלץ, הפתרון זמני מוגבל בזמן חשיפה או readout המצלמה. שיטות אלה פלורסנטי מוגבלים בטווח שדרכן ניתן לאסוף מידע צירית, למרות התקדמות אחרונים בשלב המטוס פורייה מסכות עיצוב, אופטיקה אדפטיבית היא הרחבת טווחים אלה מיקרומטר 10 או31,עוד32 , 33 , 34.

לעומת זאת, RT-3D-SPT אין לסמוך על רכישת ערימה תמונה תלת-ממדית, מציאת חלקיקים לאחר מעשה. במקום זאת, מידע בזמן אמת מיקום מופק באמצעות גלאי בנקודה אחת, משוב מוחל באופן יעיל "נעל" החלקיק באמצעי האחסון המוקד של העדשה המטרה באמצעות שלב פיזואלקטריים מהיר. פעולה זו מאפשרת מדידה רציפה של המיקום של החלקיק מוגבל רק על-ידי כמה פוטונים ניתן לאסוף. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת חקירה ספקטרלי של החלקיק כפי שהוא נע על פני טווחים ארוכים. RT-3D-SPT בתוקף עבודות דומה מלכודת נטולת כוח אופטי עבור ננו אובייקטים, שבו החלקיק הוא ברציפות ובחן, למדוד בזמן אמת ללא צורך כוחות גדולים לייזר או אופטי כוחות. בהתחשב בכך RT-3D-SPT מספק אמצעי לחקירה מתמשכת של אובייקטים המתפשט במהירות (עד 20 מיקרומטר /s2)25,29 בתלת מימד-פוטון נמוך ספירת המחירים20,29, 35, הוא אמור לספק חלון לתוך מהיר או ארעי תהליכים ביולוגיים כגון תובלת המטענים תאיים, איגוד קולטן ליגנד הדינמיקות חוץ-תאי של virions יחיד. עם זאת, בשלב זה, היישום של RT-3D-SPT הוגבלה על קומץ קבוצות הפועלים לקידום טכנולוגיה זו.

מכשול אחד היא המורכבות של הפריסה האופטי הנדרש על-ידי שיטות RT-3D-SPT, אשר הן מגוונות. עבור רוב שיטות, המשוב אופטי מסופק על ידי שלב פיזואלקטריים. כמו חלקיקים גורם קטן התנועות ב X, Y או Z, המפרט של גלאי בנקודה אחת הם המרה לפונקציות שגיאה והאכילה ב במהירות גבוהה nanopositioner פיזואלקטריים, אשר פונים מהלכים הדגימה כדי לנטרל ביעילות התנועה של החלקיק, נועלים אותו במקום יחסית העדשה אובייקטיבי. כדי למדוד תנועות לפי מיקום קטן ב- X, Y ו- Z, או מספר גלאים (4 או 5 בהתאם ליישום)15,18,21 או כתמים עירור מרובים (2-4, יכול להיות מיושם התחתונה אשר אם הנעילה מגבר משמש כדי לחלץ את X ו Y מיקום באמצעות סיבוב של לייזר ספוט)25,28 מוחלים. החפיפה של כתמים מרובים פליטה וזיהוי להקשות ליישר ולשמור את המערכות.

במסמך זה, אנו מציגים שיטה מהירה מטרה נעולה 3D-SPT עם עיצוב אופטי פשוטה בשם 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT משתמש של 2D-EOD של תג עדשה36,37,38 להעביר באופן דינמי כתם הלייזר ממוקדת דרך נפח מוקד אובייקטיבית בקצב גבוה (50 קילוהרץ XY, 70 קילו-הרץ Z). שילוב של מיקום המוקד לייזר ואת זמן ההגעה של פוטון מאפשר המיקום התלת-ממדיים של החלקיק ואפשר להשיג במהירות אפילו במחירים ספירה נמוכה פוטון. 2D-EOD כונני המוקד לייזר של אביר סיור דפוס39 עם ריבוע בגודל של 1 x 1 מיקרומטר במישור X-Y, העדשה תג מעביר את המוקד לייזר לכיוון צירית עם מגוון של 2-4 מיקרומטר. מיקום החלקיק 3D מתקבל על מיקום אופטימיזציה שערוך אלגוריתם29,40 ב- 3D. השליטה של תלת-ממד דינמי נע לייזר ספוט, הפוטון סופר מן המפולת פוטודיודה (APD), חישוב מיקום החלקיק בזמן אמת, הבמה פיזואלקטריים משוב, הקלטה נתונים מבוצעים על מערך לתכנות שער שדה (FPGA).ב פרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבנות מיקרוסקופ 3D-DyPLoT שלב אחר שלב, כולל יישור אופטי, כיול עם חלקיקים קבוע, סוף סוף חופשי חלקיקים מעקב. בתור הדגמה, 110 nm חרוזים פלורסנט שהיו תחת מעקב ללא הרף במים דקות בכל פעם.

השיטה המתוארת במסמך זה הוא הבחירה האידיאלית עבור כל יישום שבו הצורך לפקח באופן רציף בדיקה פלורסנט מהיר-המעבר ברמות האור נמוכה, כולל וירוסים, חלקיקים של שלפוחית כגון endosomes. בניגוד לשיטות הקודמות, יש רק עירור יחיד, מסלול זיהוי יחיד, ביצוע יישור ותחזוקה פשוטה. יתר על כן, האזור זיהוי גדולה מאפשרת את המיקרוסקופ לאסוף בקלות במהירות לשדר חלקיקים, בעוד היכולת לעקוב אחר ברמות אות נמוכה (עד 10 קילו-הרץ) עושה בשיטה זו אידיאלי עבור יישומים תאורה29.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הגדרת פריסת ויישור

  1. התקנה של collimation של עירור מעקב בלייזר
    1. מוספית הלייזר אל השולחן אופטי בעזרת הר הבית בנוי. ההר הוא צלחת אלומיניום פשוטה עם הרכבה חורים בראש לייזר לבין הטבלה אופטי. הלייזר צריך להיות מחובר היטב להר מתכת יציבות, פליטת חום. לעבודה זו, השתמש 488 ננומטר לייזר מצב מוצק לתאורת (איור 1), למרות שניתן לבחור את אורך הגל כדי שיתאימו fluorophore מסוים או התנסה. גורם קריטי היא אורך הגל של הלייזר מתאים את טווח עבודה 2D-EOD, אשר נקבעת בעיקר על ידי ללוחית הגל בין deflectors שני (איור 1: W2). 488 ננומטר לייזר יכולים להלהיב ביעילות את ירוק או צהוב חלבון פלואורסצנטי (GFP/YFP), אשר נפוץ תגיות פלורסנט בניסויים תא חי.
    2. להתאים את גובה קרן הלייזר ואת הכיוון באמצעות זוג מראות מבודד (איור 1: מ'). לוודא קרן הלייזר הוא מקביל הטבלה אופטי וכוונן אותו לגובה המתאים.
      הערה: הגובה צריך להיבחר מבוסס על פלטפורמת מיקרוסקופ. הגובה הזה צריך להישמר כל מראות עוקבות בשימוש פרוטוקול זה, למרות שזה לא יצוינו במפורש.
    3. Collimate את הקורה עם זוג עדשות (איור 1: L1 ו- L2). אורכי מוקד של עדשות צריך להיבחר בקפידה כדי להימנע לייזר במקום להיות ייחתך על ידי הצמצם של 2D-EOD. מסיכה מתבטא על ידי שינוי הצורה קרן לייזר לאחר שחצה 2D-EOD. איכות collimation כאן חשוב מאוד כי סטיות להיות מוגבר על ידי עדשות עוקבות, כל סטייה יחריף את הביצועים הטיה 2D-EOD. באופן אידיאלי, collimate את הקרן על ידי התמקדות הקורה לנקודה בגובה לפחות 20 מ' משם.
  2. מקום הקדמוניות (איור 1: PH) בגודל המתאים על המוקד של העדשה collimation הראשון (איור 1: L1).
    1. לבחור pinhole בגודל מתאים. גודל חריר יכולה להיבחר לפי החישוב הבא:
      figure-protocol-1847
      איפה λ הוא אורך הגל של הלייזר, f הוא אורך המוקד של העדשה הראשונה ו- D הוא הקוטר קרן קלט.
    2. לטעון את חריר על הבמה תרגום 3D כך זה יכול להיות ממוקם בדיוק על המוקד של העדשה collimation הראשון.
    3. להתאים את מיקום חריר. הצב מד כוח לייזר לאחר חריר ולהתאים את העמדה חריר XYZ כדי למקסם את המדידה של מד הכוח. אם נוצרת טבעת עקיפה, לחסום אותו עם קשתית הממוקמים לפני 2D-EOD.
  3. התקנה של Glan-תומפסון מקטב
    1. לשים את מקטב Glan-תומפסון (איור 1: GP) לאחר העדשה collimation השני (איור 1: L2) כדי לנקות את קיטוב של קרן לייזר. לסובב את מקטב למצוא שידור מרבי עם מד הכוח.
  4. התקנה של EODs
    1. השתמש 2 EODs (איור 1: EOD1 & EOD2) כדי להסיט את הלייזר בכיוונים X ו- Y. הגדל את השידור לייזר על-ידי התאמת yaw, זפת, גובה כל EOD.
    2. יישר את EODs שני ביחס אחד לשני באמצעות הסמן יישור המסופקים על ידי היצרן בצד כל מטה הטיה.
    3. להחיל תבנית בדיקה הבקר של 2D-EOD לבחון את הפלט של EOD. זה יכול להיות הסיור של האביר (איור 2) דרך של FPGA המתוארים להלן או גל סינוס פשוטים הניתנים על ידי גנרטור פונקציה. עבור הביצועים הטובים ביותר, סטיה על ידי כל מטה הטיה צריך להיות מקביל כיוון X או Y אלמנט פייזו nanopositioner. כיוון זה מוכתב על ידי כיוון זוויתי deflectors על הציר שידור. כדי לסובב את כיוון סטיה מבלי להזיז את 2D-EOD, הנח מנסרה יונה לאחר 2D-EOD ליישור הצירים סטיה אלמנט פייזו nanopositioner בצירים.
  5. התקנה של לוחית חצי-גל
    1. מניחים צלחת חצי-גל (איור 1: W1) בין מקטב Glan-תומפסון (איור 1: GP) ו- 2D-EOD כדי ליישר את הלייזר נכנסות לשגר קיטוב עם הצירים הסטה של 2D-EOD. הצב עדשה מוקד הרבה זמן (300 מ מ) לאחר 2D-EOD ולמקם מצלמה sCMOS על המוקד לייזר. בשלב הבא, הפעל את 2D-EOD ליצירת הסיור של האביר המתוארים להלן (איור 2). סובב את לוחית חצי-גל עד הפצה לייזר אחיד מרובע נצפית על המצלמה.
  6. התקנה של קרן expending עדשה זוג וזוג עדשה ממסר
    1. במקום זוג עדשות (איור 1: L3 ו L4) לאחר 2D-EOD כדי להרחיב את הקורה כדי למלא את הפתח האחורי של העדשה אובייקטיבי (איור 1: OL), עוד זוג עדשות (איור 1: L5 ו L6) כדי ממסר מטוס מוקד כדי המטרה מיקרוסקופ. הקפד להשאיר מספיק מקום בין אלה שני זוגות עדשות כמו העדשה תג יותקן ביניהם בשלב מאוחר יותר.
  7. התקן את המסנן ודיקרואיק זוהר, מפצל קרן 10/90, מיקוד העדשה APD, המטרה עדשה, מסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית כדי להשלים את המעבר זיהוי.
    1. התקנת את המסנן ודיקרואיק זוהר (איור 1: DC) כדי לשקף את הלייזר לעבר העדשה המטרה. יישר את הלייזר ללכת ישר דרך מרכז העדשה המטרה באמצעות שני קשתיות העין על העליון והתחתון של שפופרת בעדשה ארוכה.
    2. להתקין מפצל קרן 10/90 (איור 1: BS) על ידי איזה 10% של אור הוא בא לידי ביטוי עבור הדמיה המצלמה sCMOS (המתוארות להלן) ו 90% של כרטיסים דרך APD לצורך מעקב.
    3. יישר את APD. להתמקד הלייזר על גבי coverslip על ידי העדשה אובייקטיבי. להשתמש בהשתקפות. coverslip כדי ליישר רכיבים כל הזרם על ידי לשים את coverslip של המוקד אובייקטיבית ובדיקת האינטנסיביות של מדידה APD. לאחר המפצל קרן, להתקין את APD התמקדות העדשה (איור 1: L7) ואחריו את APD על הבמה תרגום תלת-ממד. מקם את העדשה כזה לייזר בהשתקפות. המטרה עובר דרך המרכז של העדשה.
ניתן למטב את המיקום APD על-ידי התאמת התנוחה התלת-ממד כדי להגדיל את העוצמה של השתקפות לייזר על coverslip. המיקום APD הוא במיקום האופטימלי כאשר מהלך של העמדה גלאי בכל כיוון פוחתת עוצמת.
  • התקנת מסנן פליטה של זריחה longpass (איור 1: F) לפני המפצל קרן כדי להסיר את האור המוחזר, פזורים.
  • התקנה של העדשה תג
    1. מקם את העדשה תג בין שני צמדי של עדשות (בין איור 1: L4 ו- L5) כפי שהוזכרו קודם, המוצגת באיור1. התאם את yaw, זפת, גובה, והמיקום לרוחב כך הקורה בניצב עובר דרך העדשה מרכז של תג.

    • 2. הכנת הדוגמא.

    1. הכנה חלקיקים קבוע
      1. לדלל 190 חרוזים פלורסנט nm ל ~ 5 × 108 חרוזים/מ"ל ב- PBS. להוסיף 400 פתרון חרוזים µL עלו על coverslip הר על המחזיק לדוגמה של השלב פיזואלקטריים (הנפח של חרוזים יהיה תלוי בעל מדגם; הקוטר של התא בעל הדגימה המשמש כאן הוא 18 מ מ). עבור החרוזים המשמש כאן, PBS גורמת החלקיקים להפקיד על coverslip.
    2. הכנה חלקיק נע חינם
      1. לדלל 110 חרוזים פלורסנט nm ל ~ 5 × 108 חרוזים/mL במים DI. להוסיף 400 פתרון חרוזים µL אל coverslip והר אל בעל מדגם של השלב פיזואלקטריים.

    3. למטב מעקב פרמטרים

    1. סריקה סרוק חלקיקים קבוע
      1. שים מדגם חלקיקים קבוע על המיקרוסקופ.
      2. הפעל את לייזר, בקר micropositioner, אלמנט פייזו nanopositioner בקר, בקר עדשה תג, ו EOD בקר. שימו לב כי הצו לא קריטי. להפעיל את nanopositioner piezo לולאה סגורה.
      3. סריקה סרוק את הדגימה ב XYZ באמצעות תוכנית מותאמת אישית הסריקה התוכנה (איור S3, התוכנה זמינה על פי בקשה מן המחברים), אשר נוהג 2D-EOD בסיור של אביר (איור 2), אוספת ספירות ממשטרת אלבוקרקי, מניע את piezo nanopositioner, ומבצעת חישוב מיקום (איור S2). גודל צעד הוא 40 ננומטר ואת טווח סריקה זה 2 מיקרומטר.
        1. כדי למקם את coverslip על המוקד של המטרה, להסיר את המסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית ולהשתמש ההשתקפות של הלייזר מ coverslip כדי למקסם את עוצמת האות כ פונקציה של מיקום Z micropositioner. לאחר הנחת המדגם על המטוס מוקד, במקום לחזור למסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית.
        2. פתח את התוכנית סריקה. הגדר את טווח סריקה ואת גודל צעד על-ידי הקלדת המספר ב 'התחל', 'סיום', ו 'שלב'. תחילה הגדר טווח סריקה גדול וגודל צעד כדי לאתר חלקיק (למשל, 10 x 10 מיקרומטר טווח עם 200 ננומטר שלב גודל). לאחר מציאת החלקיק, לכווץ את טווח סריקה ולא להקטין את גודל הצעד (למשל, 2 x 2 מיקרומטר טווח עם 100 גודל צעד ננומטר). לחץ על לחצן 'סריקה' כדי לבצע סריקה סריקה תלת-ממד כדי למצוא את המוקד פלורסנט.
    2. תג עדשה הגדרות (ראה גם איור 3)
      1. לחץ על התוכנה הבקרה של העדשה תג. לחץ על 'התחבר', 'הפעל' ברצף.
      2. כדי לשנות את שלב הפלט של האותות על ההדק, זה הכרחי לשנות את מצב הגורם המפעיל פלט. ראשית לשנות את המצב של 'RGB' 'Multiplane', אז תשני אותה בחזרה. עכשיו השלב יכול להיות שונה (איור 3b).
      3. הגדר שלב הפלט להיות 0 °, 90 ° ו- 270 מעלות. בעוד כל שלושה שלבי אשר מכסים את שלב החלל יכול לשמש, שלושת אלה מצויים לעבוד טוב מדעית (איור 3 c).
      4. בחר את הגדרת תדירות 68,500 Hz.
      5. את התדר האופטימלי זה לעתים קרובות צורך לשנות את טווח החיפוש תדר. לחץ על 'מתקדם', 'הגדרה'. שינוי ' מקס. Freq(Hz)' של העמודה 0 מ 70,000 הרץ 71,500 Hz. זה יכול להיות מותאם כדי שיהיה טווח תדר מתאים. לחץ על 'שמירת כיול', 'יציאה כיול' (דמות תלת-ממד).
      6. כדי להפוך את הכיול החדש יעיל, לעבור את התהודה בתדר אחר (לדוגמה, 189,150 Hz), ואחר כך הוא החליף בחזרה אל ההגדרה תדירות 68,500 Hz (איור 3e).
      7. לשנות את משרעת בהדרגה ל- 35%. לחץ על 'תנעלו תהודה'. לאחר התדירות נעול, לחץ על 'נעילת תהודה' (איור 3e). העדשה תג הוא מוכן להשתמש עכשיו.
      8. כדי לכייל, לשנות את הפרמטרים המשמשים הערכת לעשות את המיקום המשוער שווה למצב אמיתי, כפי שמוצג באיור 4e, פ קלט את טווח סריקה של x, y, z ולאחר מכן לחץ על 'סריקה' כפתור כדי לסרוק את הדגימה ב XYZ כדי להזיז חלקיק נע במקום לייזר. המיקום של החלקיק בעת דרך המוקד לייזר צריכים להסכים עם העמדה המשוערת של חלקיקים נקבע על ידי הלולאה הערכת מיקום (איור S1). הקשר בין מיקום משוער והמיקום אמיתי (איור 4 d) יכול להיות מופק תמונות מיקום משוער (איור 4f). אם אינך מסכים העמדות, התאם את הערכים של לייזר עמדה (ck) בשימוש הלולאה הערכת מיקום (איור S1).
      9. ליישר תג עדשה
        1. כאשר הבקר עדשה תג מבוטל, הרסטר נסרקים חלקיקים תמונות (המתוארות להלן) נלקח לפני התקנת עדשה תג, לאחר התקנת עדשה תג צריך להיראות זהים. לאחר מכן, לבצע מחסנית פלורסנט חלקיקים Z סריקה על-ידי הזזת המטרה עם nanopositioner z כדי לכוונן את המיקום ואת זווית עדשה תג (איור 4). לכוון את המיקום של העדשה תג עד שיש לא להיסחף של תמונות של חלקיקים במישור XY לאורך בכיוון Z, אשר מושגת כאשר אין שינוי במצב XY של החלקיק כפונקציה של העמדה Z (איור 4 d). מערכת האיתור הוא מוכן לשימוש לאחר יישור של העדשה תג.
    3. התקנה של מצלמה sCMOS עבור ניטור חלקיקים
      1. התקנת מצלמה sCMOS לדמיין חלקיקי בזמן שהם עוקבים. התקן את sCMOS רק לאחר כל הרכיבים של מערכת מעקב התקנה של אופטימיזציה.
    לטעון מדגם קבוע חלקיקים פלורסנט אל המיקרוסקופ ולהפעיל את התוכנית מעקב כדי לנעול מחלקיק אחד באמצעי האחסון מוקד אובייקטיבית. לאחר מכן, התקן 100 מ מ אורך מוקד העדשה (איור 1: L8) ו- sCMOS. להתאים את המיקום sCMOS כך התמונה של החלקיק הוא מרוכז לנקודה הקטנים והחכמים.

    4. מעקב בזמן אמת 3D אחר בחופשיות לשדר חלקיקים

    1. לשים ועשר ננומטר חינם הלאה חלקיקים לדוגמה המיקרוסקופ.
    2. הפעל לייזר, בקר מיקרו-positioner, אלמנט פייזו nanopositioner בקר, בקר עדשה תג ו EOD בקר. הפעל את nanopositioner piezo בלולאה פתוחה. להגדיר את התוכנה עדשה תג לפי שלב 3.2.
    3. לפתוח ולהפעיל את תוכנת מעקב (זמין על פי בקשה מן המחברים). להגדיר את המיקום שערוך פרמטרים לערכים שלהם ממוטבת, אשר נמצאו בסעיף 3.
    4. כדי למקם את coverslip על המוקד של המטרה, להסיר את המסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית ולהשתמש ההשתקפות של הלייזר מ coverslip כדי למקסם את עוצמת האות כ פונקציה של מיקום Z micropositioner. לאחר מציאת את coverslip, להגדיל את מיקום המוקד מיקרומטר 15 למקד את הלייזר הרחק את coverslip, בתוך תמיסת. המקום בחזרה את המסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית.
    5. הגדר את קבועי שליטה נפרד. ניתן להגדיר את קבועי שליטה החל מ- ערך נמוך והגברת לאט עד ניתן לראות תנודות נתוני המיקום של החלקיק. פעם אחת הם נצפו תנודות, הגדר הקבועים שליטה 80% של הערך גורם תנודות. ערכים אופייניים יהיה סביב 0.012 לרווח XY' נפרד' 0.004 עבור זי 'נפרד רווח'.
    6. לקבוע את ספי מעקב ב- ' 'סף מסלול' ' 'המסלול מינימום' ולהתחיל את הניסוי מעקב על ידי לחיצה על 'חיפוש' ולעקוב ' אוטומטי '. הסף עבור מעקב אחר סיום מוגדר מעט גבוה יותר מאשר רמת רקע, הסף עבור מפעילה מעקב על שתי פעמים גבוה יותר מאשר את הרקע. . הנה, הסף עבור מפעילה מעקב 3 kHz והוא הסף לסיום המסלול 1.5 קילו-הרץ.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    תוצאות

    החלקיקים קבוע סריקה (איור 4), בחופשיות באמצעי 110 nm פלורסנט חלקיקים מעקב (איור 5) בוצעו בעקבות בפרוטוקול לעיל. חלקיק הסריקה בוצעה על-ידי הזזת והפוטונים nanopositioner ו- bin פיזואלקטריים בזמן בו זמנית חישוב של החלקיק מוערך בעמדה בכל נקודה הסריקה. התמו?...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    למרות סוגים רבים של חלקיק בודד 3D מעקב אחר שיטות שהתגלו בשנים האחרונות, חזקים מעקב בזמן אמת אחר דיפוזיה תלת-ממד במהירות גבוהה במחירים ספירה נמוכה פוטון עם הגדרת פשוטה הוא עדיין אתגר, אשר מגביל את תחולת ביולוגית חשובה בעיות. השיטה 3D-DyPLoT המתוארת בעלון זה מטפל פרוטוקול האתגרים הללו במספר דרכים...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

    Acknowledgements

    עבודה זו נתמכה על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס R35GM124868 ועל ידי אוניברסיטת דיוק.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    2D Electro-optic Deflector ConOpticsM310A2 required
    Power supply for EODConOptics412Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  LensTAG OpticsTAG 2.0Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositionerMadCity LabsNano-PDQ275HSUsed for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitonerMadCity LabsNano-OP65HSUsed to move the objective lens to follow the diffusing particle
    MicropositionerMadCity LabsMicroDriveUsed to coarsely position sample and evaluate
    Objective LensZeissPlanApoHigh numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS cameraPCOpco.edge 4.2Used to monitor the particle's position
    APDExcelitasSPCM-ARQH-15Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate arrayNational InstrumentsNI-7852r
    SoftwareNational InstrumentsLabVIEW
    Tracking excitation laserJDSUFCD488-30
    LensThorLabsAC254-150-A-MLL1
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL2
    PinholeThorLabsP75SPH
    Glan-Thompson PolarizerThorLabsGTH5-AGT
    Half-wave plateThorLabsWPH05M-488WP
    LensThorLabsAC254-75-A-MLL3
    LensThorLabsAC254-250-A-MLL4
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL5
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL6
    Dichroic MirrorChromaZT405/488/561/640rpcDC
    Fluorescence Emission FilterChromaD535/40mF
    10/90 beamsplitterChroma21012BS
    PBSSigmaD8537
    190 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/10617
    CoverslipFisher Scientific12-545A
    PowermeterThorlabsPM100D
    CMOSThorlabsDCC1545M
    IrisThorlabsSM1D12D
    MicroscopeMad City LabsRM21

    References

    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606(2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    1313D

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved