שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשיג שילוב יציב הגן עניין הגנום האנושי על ידי המערכת היפהפייה הנרדמת transcriptionally מוסדרים. הכנת השילוב של וקטורים lentiviral פגומים, התמרה של במבחנה חושית של תאים אנושיים ואת וזמינותו המולקולרית בתאי transduced מדווחים.

Abstract

Transposon היפהפייה הנרדמת (SB) היא מערכת שילוב נגיפי עם יעילות מוכחת עבור העברה גנטית, גנומיקה תפקודית. כדי למטב את מכונות transposon SB, הם מועסקים, transcriptionally מוסדרים היפראקטיביים transposase (SB100X) ו transposon מבוסס-T2. בדרך כלל, transposase ואת transposon הינם מסופקים transiently על ידי פלסמיד תרביות תאים, SB100X ביטוי מונעת על ידי יזם מכוננת. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה כדי לספק את הרכיבים SB תאים אנושיים, כי הם עמידים בפני מספר שיטות פיזיקליות, כימיות תרביות תאים, SB100X הביטוי שליטה ולשלב stably הגן עניין (גוי) דרך SB "גזור והדבק" מנגנון. הביטוי של transposase היפראקטיבי מפוקחת באופן קפדני על-ידי מערכת ט-ON, בשימוש נרחב כדי לשלוט ביטוי גנים מאז 1992. הגן עניין משני צדדיה הפוך חזרה (IR) של transposon T2. שני הרכיבים SB ארוזים בשילוב פגומים וקטורים lentiviral transiently המיוצר בתאים HEK293T. תאים אנושיים, או שורות תאים או ראשי תאים מרקמות אנושיות, הם במבחנה transiently transduced עם וקטורים ויראלי. על תוספת של דוקסיציקלין (dox, טטרציקלין אנלוגי) לתוך המדיום תרבות, כוונון של ביטוי transposase נמדד, התוצאה היא שילוב לטווח ארוך של הגן עניין הגנום של תאים שטופלו. שיטה זו היא יעילים וישימים שורת התאים (למשל, הלה תאים) ותאים הראשית (למשל, אדם ראשי keratinocytes), ובכך מייצג כלי רב ערך עבור הנדסה גנטית, העברה גנטית טיפולית.

Introduction

Transposase SB100X היפראקטיבי מצמידים את transposon מבוסס-T2 שימש כבר ג'ין פרה טיפול יישומים^1,2,3, הגנום שינויים^4,5, ו pluripotent המושרה תא גזע (iPSC) התכנות^6,7. בדרך כלל, הרכיבים SB transiently הינם מסופקים על ידי תרביות תאים פלסמיד וכונני מקדם מכוננת חזקה הביטוי של transposase. עם זאת, למרות השיטות חדש משופר של תרביות תאים, משלוח של מערכת שני עדיין אתגר עבור יישומים רבים. לפיכך, הפיתוח של פרוטוקול מסירה חדש יש עניין גובר. מלבד השיטות תרביות תאים פלסמיד⁸ ו- mRNA⁹, משלוח ויראלי בהתבסס על adenoviral^10,11, adeno-הקשורים ויראלי (AAV)¹², Baculovirus¹³, gammaretroviral¹⁴ , lentiviral וקטורים¹⁵ הוצע בעבר. ראוי לציין, המערכת של בחירה חייבת להבטיח את משלוח ארעית של רכיבי SB בלי אינטגרציה של וקטור ויראלי. למרות זאת, הביטוי המכונן של transposase מעלה חששות בטיחות בשל הסכנה של rehopping בלתי נשלט של transposon.

לכן, רגולציה תעתיק של SB100X על-ידי מערכת ט-אן מעודן הוא האתגר הראשון. מקדם ט מגיב שונה, שהושג על ידי החלפת ייצוג המקדם cytomegalovirus מינימלי מפותחת (CMV) המקורי עם האמרגן מינימלי (-81) של הגן Timidine קינאז (TK) 1 וירוס הרפס סימפלקס (HSV-1)¹⁶, שוכפל הזרם של CDNA SB100X (pTetOTKSB100X). מוטציה rtTA2 הפוכה-טטרציקלין-transactivator^s-M2¹⁷ מבוטא תחת השליטה של האמרגן מכוננת חזקה (מקדם phosphoglycerate, PGK) שיכפל בתוך פלסמיד שונים (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). בעת הוספת המדיום תרבות, dox מאגד את rtTA2^s-אפנן M2 ו tethers ט ייצוג המקדם מורכבים או, המתקבל ב מוסדר בחוזקה אינדוקציה של הביטוי SB100X¹⁸.

האתגר העיקרי השני נובע תרביות תאים לא יעיל של תאים אנושיים הראשי באמצעות מספר שיטות פיזיקליות, כימיות. להעביר ביעילות transposase בתאי אדם עמיד תרביות תאים, את SB100X של ה-rtTA2^s-קסטות הביטוי M2 ארוזים אל תוך שילוב שני וקטורים פגומה lentiviral (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB ו- IDLVrtTA2^s- M2. וקטורים ויראלי מיוצרים transiently כמו וקטורים הדור השלישי HEK293T תאים²⁰ ו- pseudotyped עם גליקופרוטאין G של הנגיף Vescicular Stomatitis (VSV-G), אשר מקנה לקשת רחבה של זיהום. וקטור חלקיקים מרוכז על-ידי ultracentrifugation, טיטרציה על ידי HIV-1 להקיא p24 immunocapture. כדי מגלי שורות תאים ותאים הראשי, וקטור חלקיקים הם ומורכבת עם polybrene, מודגרת עם התאים היעד ב נוכחות או היעדרות של dox. התרופה תלוית ההפעלה של הביטוי SB100X בתאים transduced נמדד על ידי RT-PCR (לרביעיית-PCR) כמותית¹⁸.

ברגע מוסדר ט SB100X ביטוי הוכח, טרנספוזיציה של ממשלת ישראל (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) לתוך הגנום בתא היעד עוקב אחר האירועים המולקולריים schematized בבירור על ידי בק, Mikkelsen²¹. שליש IDLV וקטור נושא קלטת הביטוי עבור ממשלת ישראל משובטים בין ההכנסה T2-transposon (IDLVT2) חייב להיות נבנה ונארז כאמור לעיל. לבסוף, שלושת הווקטורים IDLV יכול לשמש ביעילות מגלי תאים אנושיים (למשל, ראשי keratinocytes) במבחנה ולשלב ממשלת ישראל בנוכחות דוקסיציקלין¹⁸.

Protocol

1. פלסמידים המועסקים

הערה: פלסמיד pCCL-PGKrtTA2^S-M2 היה בחביבות שסופקו על-ידי פרופסור Zappavigna (אוניברסיטת מודנה, רג'יו אמיליה, שוויץ). פלסמיד pCMVSB100X נושאת את רצף קידוד של transposase היפראקטיבי של פלסמיד transposon pT2/BH בחביבות שסופקו על-ידי פרופ ' / ח' ז' Ivics (פול ארליך המכון, Langen, גרמניה), פרופסור צ Izvak (Max Delbruck מרכז לרפואה מולקולרית, ברלין, גרמניה).

1. עבור כל שכפול ב- Escherichia Coli (e. coli), בצע את האסטרטגיה שיבוט של הליך הבחירה ואת אנזים הגבלה או PCR הגברה של השבר להיות משובטים.
   הערה: טבלה 1 מסכמת כל פלסמידים המועסקים פרוטוקול זה. תיאור והפניות עבור כל פלסמיד הינם מסופקים.

2. ייצור וקטור ויראלי

הערה: כל הווקטורים ויראלי מיוצרים ברדס הביולוגי ברמה הבלימה אבטחה BSL2, על פי תקנות וכללים מוסדיים.

1. התרבות תאים HEK293T חסיד של Dulbecco ששינה נשר בינוני בתוספת 10% HyClone סרום פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, גלוטמין 2 מ מ.
2. יום 0: להכין חמישה הכנת לוחות/ויראלי 15 ס מ זרע 5.5x10⁶ תאים 30 מ של המדיום.
3. יום 1: תקנים
   1. לפני שמתחילים תרביות תאים, הכן 100 מ ל תמיסת מלח 2 x HEPES מאגר (HBS):
      NaCl (5 מ') מ ל 5.6
      HEPES (1 מ') 10.0 מ ל
      נה₂HPO₄ (0.5 M) 0.3 mL
      סטרילי מים 84.1 mL
      להתאים את ה-pH 7.1 עם 37% HCl.
      הערה: 2 x HBS ניתן לאחסן ב 4 º C. PH המדויק חשוב מאוד עבור תקנים יעיל. הטווח pH אופטימלי הוא 7.10 עד 7.12.
   2. הסר בינוני ומוסיפים 22.5 מ ל/צלחת של טרי בינוני 4 שעות לפני תרביות תאים.
   3. Transfect תאים HEK293T עם פלסמיד העברה, את פלסמיד אריזה pMD.Lg/pRRE.D64VInt, פלסמיד קידוד המעטפה את pMD2.G את pRSV-Rev (טבלה 1) על פי הלוח/הכמות הבאים:
      העברת פלסמיד 25.00 µg
      µg pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25
      pMD2.G 8.75 µg
      µg pRSV-Rev 6.25
      הערה: פלסמיד DNAs מוכנות לפי הפרוטוקול CsCl שתואר על ידי Maniatis²² או באמצעות ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין פלסמיד.
      1. Resuspend µg 56.25 של DNA (שילוב של פלסמידים 4) ב- 1.125 מיליליטר מים סטריליים ולהוסיף µL 125 של 2.5 מטר CaCl₂ (פתרון A).
      2. להוסיף 1.250 מ של 2 x HBS שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15מל (פתרון B).
      3. להוסיף פתרון (1.250 mL) ל B (1.250 מ ל) dropwise תוך בעבוע באמצעות פיפטה מ"ל 1 או 2 (הפתרון תרביות תאים, הנפח הכולל 2.500 מ ל).
      4. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      5. באמצעות micropipette של P1000, להפיץ את כל הפתרון תרביות תאים (2.500 מ ל) טפט תא dropwise.
   4. דגירה בין לילה בחממה תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
4. יום 2: להסיר את המדיום ולהוסיף 15 מ"ל בינוני טריים (ראה שלב 2.1).
5. יום 3: לאסוף ולרכז את תגובת שיקוע lentiviral המכילים חלקיקים.
   1. לאסוף כל תגובת שיקוע (~ 70 מ ל) (n = 5) transfected תא צלחות, לסנן דרך מיקרומטר 0.45 וסטיית לסנן ולמלא polyallomer 2 צינורות (1 אינץ ' x 3.5 ס מ) / ויראלי הכנה.
   2. לרכז את החלקיקים וקטור על ידי ultracentrifugation ב 106,000 g x עבור 2.5 h, 15 ° C עם בלם.
   3. מיד לאחר שעצרה את ultracentrifugation (כדי למנוע resuspension של בגדר בצינור), בעדינות שופכים את תגובת שיקוע לתוך מיכל המכיל 10% מלבין ו להשעות את כדורי בקושי נראה 2 ב 100 µL ל- PBS 1 x (+1% BSA). . זה נורמלי כמו בגדר ברורים וקצרים. השתמש הווקטור מרוכז טרייה, או aliquot ולאחסן את ההכנות ויראלי ב-80 מעלות צלזיוס.
      התראה: תגובת שיקוע מכיל חלקיקים lentiviral חייב להיות מולבן ביסודיות לפני השלכת של פסולת חומרים מסוכנים.
6. כדי titrate ההכנה וקטור ויראלי, השתמש HIV-1 להקיא p24 immunocapture ערכה לפי הפרוטוקול של היצרן.
   הערה: כדי לתקנן את הייצור וקטור ויראלי, ריאגנטים מבוססי ליפוזומים יכול להיות מועסק. למרות זאת, כייל וקטור ויראלי תלויה מאוד תרביות תאים יעילות וטוהר פלסמיד ה-DNA.

3. התמרה חושית של שורות תאים אנושיים (למשל, הלה תאים)

הערה: הלה תאים מתורבתים במדיום הנשר של Dulbecco ששונה בתוספת 10% עגל עוברית סרום פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, גלוטמין 2 מ מ. טבלה 1 מסכמת כל הווקטורים המועסקים פרוטוקול זה. תיאור עבור כל וקטור מסופק. התמרה חושית של תאים הלה מאפשר אימות של התקנון תעתיק של SB transposase בשילוב במינון הכי טוב שני וקטורים IDLV. וריאציה של מינונים IDLV עשויה להיות קשורה וקטור טיטור החלקיקים וסוג תא היעד.

1. יום 0: זרע 2 x 10⁵ תאים 3 מ"ל של מדיום עבור כל טוב של צלחת 6-. טוב. להכין 4 בארות.
2. יום 1: התמרה חושית של הלה תאים.
   1. עבור כל תנאי, לדלל וקטורי lentiviral נפח סופי של 1 מ"ל בינוני (ראה הערה לעיל) בנוכחות 10 μL של polybrene (ריכוז סופי 8 μg/mL):
      דילול טוב # 1: ללעוג transduced תאים (בקרה שלילית).
      דילול עבור #2: וקטור IDLVTKSB (2,600 ng של p24).
      דילול-וולס #3, #4: וקטור IDLVTKSB (2,600 ng של p24) + IDLVrtTA2^s-M2 וקטור (9,600 ng של p24).
   2. להסיר את המדיום מכל קידוח איפה הלה תאים מצופים ביום 0 ומוסיפים דילולים וקטור lentiviral המתאימה היטב.
   3. Spinoculate הצלחת. ובכן 6 ב g 754 x למשך 45 דקות ב 20-25 ° C, ואז העברת הצלחת 6-ובכן חממה התרבות התא-CO 37 ° C ו-5%₂.
   4. לאחר 6-אייץ ', החלף את הווקטורים המכילות בינוני בינוני טריים בבארות כל ולהוסיף דוקסיציקלין μM 1 טוב # 4. מכניסים את הצלחת חממה התרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
3. יום 3: הכנת תא צניפה לחילוץ RNA.
   1. לפני ניתוק התאים, הכן הפתרון עובד טריפסין (1 x):
      2.5% טריפסין (10 x) מ ל 5.0
      500 מ מ EDTA (ריכוז סופי = 5 מ מ) 0.5 mL
      1 x PBS 44.5 מ
   2. טריפסין חמים הפתרון עובד ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לאחסן טריפסין הפתרון עובד ב 4 º C.
   3. הסר בינוני ולשטוף תאים עם 1 x PBS. להוסיף 0.5 מ של הפתרון עובד טריפסין מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס מכל קידוח, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות (ב חממה התרבות תאים).
   4. לאחר הדגירה, להוסיף 0.5 מ של סרום המכיל בינוני עד בכל טוב כדי להשבית טריפסין ותאים לאסוף בשפופרת צנטרפוגה. לשטוף טוב פעם אחת עם 3 מ"ל של PBS 1 x, centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב 240 x g.
   5. לשטוף תאים עם 5 מ של 1 x PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 240 x g ולמחוק את תגובת שיקוע. השתמש כדורי תא שנאספו טרי או לאחסן ב- 80 ° c חלץ RNA הכולל של כדורי לבצע RT-PCR כמותי למחצה (ראה שלב 6).

4. התמרה חושית של התאים הראשי של האדם (למשל, keratinocytes)

הערה: keratinocytes ראשי האדם הם נזרע על גבי לקרינה אולם 3T3-J2 תאים (שכבה מזין)²³, מתנה נחמדה יאן Barrandon (EPFL, לוזאן, שווייץ).

1. לגדול העכבר שוויצרי 3T3-J2 בתאים ששינה נשר בינוני של Dulbecco בתוספת 10% התורם סרום שור פניצילין U/mL 50-סטרפטומיצין, גלוטמין 4 מ מ (בינוני 3T3).
2. לצמוח keratinocytes מצופה על גבי התאים לקרינה אולם 3T3-J2 cFAD בינוני, בינוני נשר שונה של Dulbecco F12 מדיה תערובת של חזיר (3:1) המכילים סרום שור עוברית (10%), פניצילין-סטרפטומיצין (1%), גלוטמין (2%) אינסולין (5 µg/mL), אדנין ( 0.18 מ מ), הידרוקורטיזון (0.4 µg/mL), טוקסין הכולרה (0.1 nM), ו תריודוטירונין (2 ננומטר).
3. יום 0: זרע 3 x 10⁵ אולם מוקרן 3T3-J2 תאים, בעבר מדולל 3T3 בינוניים עד ריכוז סופי של תאים⁵ עונה 1 פרק 10/mL, בבאר בכל צלחת 6-. טוב. להכין 9 בארות.
4. יום 1: התמרה חושית של keratinocytes ראשי
   הערה: התמרה חושית של keratinocytes מאפשר כימות של התקנון תעתיק של SB transposase בשילוב במינון הכי טוב שני וקטורים IDLV (על-ידי לרביעיית-PCR) וכדי לאמת את השילוב של גוי (GFP) בתאי המטרה (על-ידי cytofluorimetric ניתוח).
   1. לפני ניתוק התאים, הכן את הפתרון עובד טריפסין:
      0.5% טריפסין-EDTA (10 x) מ ל 5.0
      500 מ מ EDTA (ריכוז סופי = 5 מ מ) 0.5 mL
      1 x PBS 44.5 מ
   2. טריפסין חמים הפתרון עובד ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לאחסן טריפסין הפתרון עובד ב 4 º C.
   3. כדי לנתק keratinocytes subconfluent בתרבות, הסר בינוני, לשטוף תאים עם 1 x PBS ולהוסיף 1 מ"ל של הפתרון עובד טריפסין ומחוממת מראש מכל קידוח. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות החממה התרבות תאים.
   4. לאחר הדגירה, resuspend התאים של באר ביסודיות ולהעביר התליה תא שפופרת צנטרפוגה המכיל 2 מ של סרום המכיל בינוני (אם תאים רבים עדיין מחוברים, דגירה דקות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס). לשטוף טוב פעם אחת עם 3 מ ל 1 x PBS או בינונית טרייה ולהוסיף את הפתרון שטיפה ברכבת התחתית צנטריפוגה עם התליה תא.
   5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 580 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
   6. לשטוף תאים עם 5 מ של 1 x PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 580 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
   7. צינור פוליפרופילן 15-mL, לדלל 1.6x10 keratinocytes⁵ ב 1 מ"ל של cFAD בינוני, דילול אחת עבור כל תנאי.
   8. לדלל lentiviral וקטורים ב 1 מ"ל של מדיום cFAD בנוכחות 20 μL של polybrene (ריכוז הסופי של µg/mL 8 בווליום הסופי של 2 מ ל):
      דילולים וולס #1, #2, #3: ללעוג transduced תאים (שליטה שלילי ללא וקטורים).
      דילולים וולס #4, #5: וקטור IDLVTKSB (13,000 ng של p24) + IDLVrtTA2^s-M2 וקטור (48,000 ng של p24).
      דילולים וולס #6, #7, #8, #9: וקטור IDLVTKSB (13,000 ng של p24) + IDLVrtTA2^s-M2 וקטור (48,000 ng של p24) + וקטור IDLVT2 (9,160 ng של p24).
   9. מגלי בתאים השעיה על-ידי הוספת כל דילול וקטור lentiviral (1 מ"ל) כדי המתלה תקין המתאים (1.6x10 keratinocytes⁵ ב 1 מ"ל).
   10. להסיר את המדיום מתאי לקרינה אולם 3T3-J2 נזרע יום 0 ו keratinocytes צלחת transduced (1.6x10 keratinocytes⁵ ב- 2 מ"ל) עלתה עליהם. לאחר transducing היטב המשך פעם הבאה.
   11. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן להעביר את התאים עד 37 ° C בחממה התרבות התא במשך 6 שעות.
       הערה: תעשה לא keratinocytes, ראשי spinoculate הכדאיות והתפשטות חריפה יושפעו.
   12. לאחר 6 שעות, להוסיף 1 מ"ל של מדיום cFAD כל טוב. הוסף μM 1 דוקסיציקלין (ריכוז סופי) בבארות #5 #8, #9. לחזור תאים 37 מעלות צלזיוס.
5. יום 2: להחליף cFAD בינוני 3 מ"ל של מדיום KC עם 10 ננוגרם למ"ל EGF.
6. יום 3: Trypsinize ולשטוף תאים מבארות #1, #4 ו 5 # כמתואר קודם (ראה 4.4.1 כדי 4.4.6). הקפאת תאים כדורי ב- 80 ° C כדי לחלץ RNA הכולל לניתוח לרביעיית-PCR (ראה שלב 7).
7. Trypsinize תאים מן #2, #6 ו- #8 כמתואר בצעדים 4.4.1 כדי 4.4.5 ולבצע ניתוח cytofluorimetric לביטוי GFP (ראה שלב 5).
8. שמור את התרבות מבארות #3 #7, #9 עבור הטווח לפחות 3-4, מספיקות לדלל IDLVT2 האו ם משולב וקטור (5 ימים עבור האדם keratinocytes הראשית מצופה בשכבה מזין).
9. יום 6: כ 5 ימים לכתוב התמרה חושית, trypsinize תאים (ראה שלבים 4.4.1 כדי 4.4.5) מבארות #3 #7, #9 לבצע ניתוח cytofluorimetric לביטוי GFP (ראה שלב 5).
   הערה: תזמון ניסוי ויעילות התמרה חושית מושפעות מאוד לפי סוג התא הראשי ולפי השתנות של הדוגמאות שנאספו.

5. Cytofluorimetric ניתוח על keratinocytes ראשי transduced

הערה: זרימה cytometer נקבעה עם לייזר כחול (488 ננומטר), לייזר אדום (633 ננומטר) מסננים עבור זיהוי של קרינה פלואורסצנטית GFP, APC הוא מועסק (ראה טבלת חומרים).

1. להפלות keratinocytes משכבת מזין 3T3-J2, תווית transduced keratinocytes מנותקת-ביום 3 וביום 6 (ראה שלבים 4.7 ו- 4.9) עם העכבר monoclonal APC-נוגדן אנטי-מזין מצומדת.
   1. להכנת 4 מיליליטר מכתימה את המאגר עבור כל דגימה:
      5% FBS 200 ΜL
      500 מ מ EDTA (ריכוז סופי = 2.5 מ מ) 20 μL
      ΜL PBS 1 x 3780
   2. רחץ מנותקת תאים עם 1 מ"ל של צביעת מאגר. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 580 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
   3. בשפופרת עבור רכישת cytometry זרימה, resuspend 5 x 10 תאים⁴ ב 100 μL מאגר מכתימים ולהוסיף 2 μL של נוגדן אנטי-מזין (1:50). מערבבים היטב, תקופת דגירה של 30 דקות על קרח בחושך.
   4. לאחר 30 דקות, לשטוף עם 2 מ של צביעת מאגר. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 580 x g וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend ב μL 200 של צביעת מאגר.
   5. רוכשים APC ו- GFP אותות על ידי ניתוח cytofluorimetric¹⁸. השבר תאים GFP⁺ של אוכלוסיית תאי APC^– מציין transduced keratinocytes.
      הערה: אם רצונך בכך, לתקן את הדגימה מוכתם לפני cytometry זרימה עם 2% paraformaldehyde ב- PBS 1 x וחנות ב 4 ° C בחושך עד ההפעלה.
2. ניתוח נתונים cytometry זרימה ידי היחס בין אחוז GFP⁺תאים על הקצה (5 ימים) ואת אחוז GFP⁺תאים יומיים לפרסם התמרה חושית, מנורמל לרמה שיורית של IDLVT2-transduced תאים.

6. חצי כמותית RT-PCR

הערה: השתמש הצנטרפוגה תרמי של ה-PCR.

1. לחלץ סך RNA מ transduced או לשלוט תאים באמצעות ערכת טיהור RNA, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
   הערה: RNA הכולל שניתן לאחסן ב- 80 ° c
2. לסנתז cDNA בתגובה 20 µL באמצעות 100 ננוגרם של RNA הכולל וערכת רוורס טרנסקריפטאז, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
   הערה: cDNA שניתן לאחסן ב-20 ° C.
3. עיצוב תחל ספציפיות עבור SB100X, rtTA2^s-M2 ו- GAPDH (גן משק בית).
   עיצובים המוצע:
   SB קדימה פריימר: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
   SB הפוך פריימר: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
   rtTAM2 להעביר פריימר: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
   rtTAM2 הפוכה פריימר: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
   GAPDH להעביר פריימר: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
   GAPDH הפוכה פריימר: 5'–CCACCACCCTGTTGCTGTAG–3'
4. ביצוע PCR נפח התגובה האחרונה של 50 µL. בפרט, להרכיב כל צינור PCR את התגובה הבאה:
   cDNA (1:5 דילול) (מתוך שלב 6.2) 1.00 µL
   קדימה פריימר (10 מיקרומטר מניות) 1.00 µL
   הפוך פריימר (10 מיקרומטר מניות) 1.00 µL
   dNTPs (10 מיקרומטר מניות) 1.00 µL
   מאגר (+ MgCl₂) (10 x מניות) 5.00 µL
   . אנזימים (5 מניות U/µL) 0.25 µL
   µL במים סטריליים 40.75
5. השתמש בתוכנית הבאה של הצנטרפוגה תרמי: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ואז להמשיך עם 95 ° C ל 30 s, 58 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s 34 מחזורים עבור SB100X, 32 מחזורים עבור rtTA2^s-M2 , ומחזורי 25 עבור GAPDH.
6. הכנת ג'ל agarose 1%. להמיס 1g של agarose ב- 100 מ של TBE 1 x (10 x מניות מדולל במים סטריליים), גביע או את הבקבוק. ממיסים במיקרוגל, מתערבל בכל דקה עד agarose זה התפרקה לחלוטין. מגניב של agarose נמס עד שהוא מגיע כ 50 ° C, ולאחר מכן להוסיף 5 µL של אתידיום ברומיד (10 mg/mL במלאי). יוצקים agarose נמס במגש ג'ל התאספו עם מסרק, לליהוק ג'ל.
7. טען דוגמאות (10 µL כל אחד) על הג'ל agarose ולבצע אלקטרופורזה.
8. במידת הצורך, לרכוש ג'ל התמונה ולבצע ניתוח densitometric על הלהקות PCR.

7. כמותיים RT-PCR (לרביעיית-PCR)

הערה: מערכת זיהוי רצף מסחרי הוא מועסק. תחל PCR ו- 6-carboxyfluorescein (FAM) רגש גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) נרכשים באופן מסחרי.

1. ראו רטרו-שעתוק, שלב 6.2.
2. השתמש בתוכנה כדי לעצב תחל ולאחר בדיקה ספציפית עבור SB100X.
   עיצוב המוצע:
   SB.2 להעביר פריימר: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
   SB.2 הפוכה פריימר: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
   בדיקה SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
3. לבצע PCR בזמן אמת ב- 96-ובכן צלחות עם שילוב PCR מאסטר ומערבבים תחל + רגש, באמצעי אחסון התגובה האחרונה של 25 µL. בפרט, שקול את התגובה הבאה עבור כל טוב:
   cDNA (1:10 דילול במים סטריליים) 1.00 µL
   2 x מיקס מאסטר 12.50 µL
   צבעי יסוד + 20 x רגש לערבב 1.25 µL
   µL במים סטריליים 10.25
   הערה: לבצע תגובות כל דולר. כדי למנוע שגיאות pipetting, להכין תערובת לפחות n + 3 תגובות (ללא cDNA). Aliquot באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
4. הפעל PCR בזמן אמת באמצעות התוכנית הבאה: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואז 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C 1 דקות, להחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
5. ניתוח נתונים לרביעיית-PCR על ידי נרמול הביטוי יחסי (ערך RQ) SB100X לרמה של GAPDH של המדגם cDNA אותו על ידי 2^–ΔΔCT כימות, באמצעות תוכנה לניתוח נתונים טיפוסי.

תוצאות

שימוש בהליך המובאים כאן, שלושה וקטורים IDLV נושאת את הרכיבים SB מוסדר (SB100X, rtTA2^S-transposon M2 ו- T2-GFP) היו באריזה, נהגה לספק ביעילות, בחוזקה לווסת את המערכת SB בתאים אנושיים. איור 1A מציג ערכה עבור במבחנה התמרה חושית של הלה תאים, אשר נערך כדי להעריך את התקנון ת?...

Discussion

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה נגישים נרחב stably שילוב של גוי לתוך הגנום של התאים היעד על ידי היפהפייה הנרדמת-מתווכת טרנספוזיציה. למרות שהמערכת SB פותחה כדי לספק שיטה nonviral לעריכה הגנום, העברה יעילה של מכונות אינטגרציה (transposase ו- T2 transposon) הוא חובה. לכן, להשתמש במערכת SB בתאי ראשי בקושי transfectable, מש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	-	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	-	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	-	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	-	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	-	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	-	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	-	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	-	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	-	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	-	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	-	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.