JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

Abstract

קנדידה אלביקנס היא המחלה פטרייתי הנפוץ ביותר של בני האדם, גורם כ 15% של המקרים רכשה החולים אלח דם. תכונה התקפה אלימה העיקריים של ג אלביקנס הוא היכולת ליצור biofilms שלה, קהילות מובנית של תאים מחוברת משטחים ביוטיים והאביוטיים. Biofilms ג אלביקנס יכולים ליצור רקמות מארח, כגון שכבות הרירית, ועוד מכשירים רפואיים, כגון קטטרים, קוצבי, שיניים תותבות, תותבות משותפת. Biofilms מהוות אתגרים משמעותיים קלינית כי הם עמידים מאוד בפני לפליטת פיזיקליות, כימיות, ויש לפעול כפי מאגרים זרע המופץ זיהומים. מבחני במבחנה שונים כבר נעזרו ללמוד אלביקנס ג ביופילמים, כגון מבחני צלחת microtiter, מדידות משקל יבש, מבחני הכדאיות תא קונפוקלית לייזר סריקה. כל מבחני אלה הם מבחני מובילים בודד, היכן שקובעת ביופילמים בנקודת זמן מסוימת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ללמוד ביופילמים בזמן אמת באמצעות מכשיר microfluidic אוטומטית תחת תנאי זרימה שכבתית. שיטה זו מאפשרת התבוננות ביופילמים כפי biofilm מתפתחת עם הזמן, שימוש להתאמה אישית בתנאים המחקים את אלה של המחשב המארח, כגון אלה המצויים קטטרים לכלי הדם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הליקויים biofilm של מוטציות גנטיות וכן אפקטים המעכבת של סוכני מיקרוביאלית על פיתוח biofilm בזמן אמת.

Introduction

קנדידה אלביקנס הוא חבר commensal microbiota האנושית, אולם זה גם פתוגן הזדמנותית, מסוגל לגרום זיהומים פטרייתיים שטחית וחמור1,2. תכונה התקפה אלימה העיקריים של ג אלביקנס היא יכולתה להעביר טופס גמיש, biofilms עמידים בפני התרופה, קהילות של תאים דבקה משטח המוקף בסוגריים גשמי1,מטריצה חוץ-תאית3. ג אלביקנס biofilms בנויות מאוד, המכיל מספר שכבות של סוגי תאים מרובים (סיבוב ניצני שמרים-טופס תאים, התאים pseudohyphal אובל ותאים hyphal צינורי)4. פיתוח biofilm אלביקנס ג מתחיל עם הדבקות של תאי שמרים עגולה-טופס משטח (זריעה של biofilm), ואחריו ההתפשטות של תאים אלה על פני השטח ולאחר מכן ההבשלה של biofilm ילדותי מבנה לתוך biofilm מלא שנוצר המוקפת מטריצה חוץ-תאית גשמי4. בוגרת biofilm מורכב בעיקר מוארך התאים hyphal היוצרים רשתות צפופות ולא מחוברים, מספקת את היציבות אדריכלי עד biofilm4. לאורך כל מחזור חיי biofilm, עגול ניצני שמרים תאים לפזר מן biofilm בוגרת, עשוי לטייל באזורים אחרים של הגוף כדי לגרום לזיהומים המופץ או זרע biofilms חדש על אתרים אחרים,4,5. ג אלביקנס יכולים ליצור biofilms על משטחים ביוטיים, כגון משטחים הרירית וברחבי רקמות הפונדקאי, ועל משטחים והאביוטיים, כגון קטטרים, קוצבי, שיניים תותבות, המפרקים תותבת. בשל מאפייני biofilms הסרבן, הם קשים מאוד לשרש, במקרים רבים אסטרטגיית טיפול יעיל רק הסרה של התקן נגוע4. לכן חשוב לחקור ביופילמים בתנאים דומים לאלה הנהוגות הגדרות קליניים.

ישנם כמה קריטי ויוו חייתיים המשמשות ללימוד אלביקנס ג biofilm היווצרות6,7,8; עם זאת, מחקרים אלה יכול להיות יקר, זמן רב, מוגבלים על ידי מספר זנים, סוכני מיקרוביאלית יכול להיבדק בזמן נתון. במבחנה biofilm מבחני, מצד שני, לאפשר ההערכה המהירה, תפוקה גבוהה של תרכובות פטריות מוטציה זנים, והם הרבה יותר חסכונית, אתי מבחני biofilm נשא שם חיה מודלים9, 10,11,12,13,14. כאן נתאר assay במבחנה אנו פיתח, אופטימיזציה להתבונן ביופילמים חנותם תחת זרימה שכבתית באמצעות14,התקן15microfluidic להתאמה אישית. וזמינותו מאפשר החזיית בכל שלב של ביופילמים, כולל את שלב הדבקות ראשונית, התפשטות תאים, ההבשלה biofilm תא פיזור. וזמינותו שימושי גם לדמיין תא מורפולוגיה שינויים במהלך התפתחות ממבנה biofilm.

לוחות Microtiter, אשר בדרך כלל מנוצלים עבור במבחנה biofilm מבחני, בעוד תפוקה גבוהה, אינם מאפשרים תנאים זרימה מבוקרת. מסורתי, תא מנדפים תאפשר להערכה מתמשכת של ביופילמים בתנאי זרימה מבוקרת, אך אלה הם לעתים קרובות זמן רב כדי להגדיר, נוטים מוגבל טווח דינמי שליטה והתפוקה. המכשיר microfluidic מנוצל כאן מתגבר על מגבלות אלה על-ידי שילוב לוחות תפוקה גבוהה (מכיל 48 וולס) עם תא זרימה שכבתית מובנה, היא מאוד לשחזור, תכליתי, הניתנים להתאמה אישית.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לשימוש של מכשיר microfluidic אוטומטיים זמינים מסחרית כדי להעריך ביופילמים של פראי-סוג אלביקנס ג להתאמץ, את ההשפעות של סוכן פטריות ידוע על הפיתוח של biofilm ו biofilm -צורה שני זנים מוטציה (Δbcr1/Δ וδ efg1/Δ) אשר היו בעבר דווח כי biofilm פגמים במבחנה , ויוו16,17,18. הפרוטוקול המתואר ניתן לבדוק את היעילות של סוכני מיקרוביאלית עיכוב ביופילמים במהלך התפתחות ממבנה biofilm, וכדי לזהות גנים הדרושים לפיתוח biofilm רגילה על-ידי הקרנת ספריות מוטציה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנה התרבות התא פטרייתי

הערה: תרבית תאים התנהגות עבודה (כלומר פתיחה קריוגני מניות, תא תרבות צינורות, שפופרות מבחנות) בתוך ארון אבטחה. הפעל את אולטרה סגול (UV) קוטל חידקים המנורה לפחות 1 h הקבינט לפני העבודה, כבה מנורת UV תוך פועלת נמרצות הארון. ללבוש כפפות בטיחות משקפיים, ציוד מגן אישי המתאים, decontaminate פני השטח של הספסל, פיפטות עם 70% אתנול לפני תחילת הניסוי. השימוש טיפים מסנן סטרילי והיכרות עם טכניקות בסיסיות מיקרוביולוגית aseptic מומלץ.

  1. פס אלביקנס ג זנים (פראי-סוג, bcr1 Δ/Δ וδ efg1/Δ) על שמרים לחלץ בינוני דקסטרוז (YPD) peptone (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, 2% גלוקוז; pH 6.8) פלטות אגר. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, מיקרוביולוגית הבאים תקן ומתרגלת19.
  2. בחר מושבה מבודדת אחת מהצלחת לחסן לתוך 4 מ של YPD נוזלי בינוני (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, 2% גלוקוז; pH 6.8), דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות ב rpm 225 תקן רועד חממה במשך 12-15 h, כמעט בכל תחום סטנדרטי מיקרוביולוגית הבאים tices19.
  3. לקבוע את צפיפות התאים של התרבות על ידי מדידת צפיפות אופטית (OD)-600 nm, cuvette (1 מ"ל, 1 ס מ אורך נתיב), מיקרוביולוגית הבאים תקן ומתרגלת19.
  4. לדלל את התרבות התא יתר סופית600 של 0.5, שקול ל- 2 x 107 תאים/mL, רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI)-1640 בינוני (המכיל חומצה 3-morpholinopropane-1-sulfonic 165 מ מ (MOPS),-גלוטמין, ללא נתרן ביקרבונט, pH 7.0) או עכביש בינונית (נזיד מזין 1%, 1% מניטול, 0.4% K-2-HPO-4, pH 7.2).
    הערה: המדיה חלופי יכול לשמש כדי לתמוך הגידול הספציפי של זנים מעניינים.
    הערה: אל תבצע תא דילולים רחוק מדי מראש. מומלץ להתחיל דילולים לאחר שלב 3.3 (המתוארות להלן) כדי למנוע אתחול של היווצרות hyphae לפני התאים להיות נזרע בערוץ הצפייה.

2. הכנת Microfluidic ערוצי הבסיס Microfluidic

הערה: עיין במדריך למשתמש של מערכת microfluidic (ראה טבלה של חומרים) לקבלת מידע על צלחות, כלי ההתקנה.

  1. לפני הפעלת הניסוי microfluidic, חם 20 מ של RPMI-1640 מדיה או מדיה עכביש בתוך אינקובטור ב 37 º C. אחסון מדיה נוספים עשוי להידרש המבוסס על חישובים בשלב 2.8. מדיה מראש התחממות כדור הארץ מונע היווצרות בועות אוויר במהלך הניסוי.
  2. להפעיל את המערכת מיקרופלואידיקה אשר כוללת המצלמה המיקרוסקופ, היחידות אספקת כוח שני, הבקר, מחשב המחובר למערכת. לפתוח את התוכנה ששולטים המערכת (ראה טבלה של חומרים) מתוך התפריט תוכנית במחשב. שני חלונות הם יופיעו לאחר פתיחת התוכנית.
  3. לאתר את מספר הברקוד של הצלחת בשימוש ולהזין את מספר כאשר תתבקש על-ידי התוכנה. השתמש שני מסכי מחשב נפרד כדי להציג את התוכנה על החלונות שני. חלון אחד (מודול בקרת) מכיל את הפקדים על הצלחת ומכיל החלון השני (מצרף, מודול ההדמיה) את הפקדים כדי להפוך את המיקרוסקופ המצלמה.
  4. לעבור על כפתור כוח דוד בבקר ולהגדיר מיקרופלואידיקה הטמפרטורה של המערכת 37 ° C באמצעות לחצני החצים של בקר טמפרטורה.
  5. לנקות את הצלחת ממשק (איור 1) שימוש במים סטריליים כדלקמן. לרסס בתחתית הצלחת עם מים סטרילי והשתמש העדשה נייר כדי להסיר אבק/לכלוך. הנח את ממשק צלחת עם הפנים כלפי מטה על העדשה נקייה נייר כדי אוויר יבש. לנקות את החלק העליון של הלוח ממשק משתמש אלכוהול איזופרופיל 70% ונייר עדשות.
    הערה: הצלחת ממשק מקשר את מערכת microfluidic לצלחת שיכיל את התאים ואת התקשורת. ודא כי אין נוזל נשאר כל סיבים ולכלוך יוסרו. לקוי עלול לגרום קטעי וידאו ותמונות באיכות נמוכה.
  6. הסר את התעבות של הצינורות בצלחת ממשק.
    1. להשאיר צלחת הפנים למטה נח על הנייר העדשה. בפקד החלון מודול לחץ על מצב ידני על הצלחת. במקטע גזירה תפריט הבקרה, לחץ על בחירת נוזל עבור עמודות 1-4 ו- 5-8 ובחר 37 ° C מתוך התפריט הנפתח. במקטע בקרת ' הטיה ', הגדר את מצב זרימה קבוע ולהגדיר את ההטיה מקסימום דיין 2/cm2 (0.2 הרשות הפלסטינית) (איור 2 א).
    2. לחץ על הבארות כניסת להתחיל את זרימת האוויר סטרילי דרך הצינורות צלחת ממשק כדי להסיר עיבוי. לאחר 5 דקות, לחץ על הלחצן ' עצור ' במקטע בקרת לוח טוב (איור 2 א). להתבונן הצינורות בצלחת ממשק כדי לוודא כי כל עיבוי הוסר. אם טיפות עדיין גלויים, חזור על זרימת אוויר סטרילי, כאמור לעיל, עבור עוד 5 דקות.
      הערה: כניסת הצינורות מחוברים מסננים מיקרוניים 0.22 כדי להבטיח רק סטרילי אוויר היא הציגה את מערכת מיקרופלואידיקה. ניתן לנטר את זרימת מאת יומן האירועים על המסך החלון מודול הבקרה.
  7. מקם את הצלחת microfluidic 48-ובכן 0-20 דיין על הבמה מיקרוסקופ.

3. קנדידה אלביקנס ביופילמים במערכת Microfluidic

  1. כדי להקליט ביופילמים, להוסיף 600 µL בינוני RPMI-1640 מראש ומחוממת או בינוני עכביש הבארות כניסת (ראה איור 1 לפריסה צלחת). יש משכפל שני עבור כל תנאי הניסוי.
    1. בדיקה ביופילמים של אלביקנס ג זנים פראי-סוג של מוטציה, להוסיף 600 µL עכביש בינוני כניסת בארות של צלחת הניסוי.
    2. בדיקה ביופילמים בנוכחות תרופות נגד פטריות (או תרכובות אחרות עניין), להוסיף 600 µL של RPMI-1640 בינוני כדי שתי בארות (בקרה שלילית) ו- 600 µL בינוני RPMI-1640 בתוספת המפוטריצין (16 µg/mL) (או סם בחירתך-רצוי ריכוז) כדי שתי בארות כניסת אחרים.
      הערה: עבור ניסוי היווצרות biofilm 12 שעות, להוסיף µL 600 של מדיה מראש ומחוממת הבארות מפרץ צר. לניסויים עוד להוסיף מדיה נוספים (µL 50/h) הבארות מפרץ צר. לא יעלה על הנפח המרבי של הבאר (1,500 µL).
  2. הורידו לאט את הצלחת ממשק נקי על גבי לוח 48 microfluidic טוב. החלק את הצלחת ממשק מעט שמאלה עד הצינורות בצלחת לאטמוספרה הממוקמים על גבי הבארות כניסת ו עודפים.
להפוך את הידית על הצלחת ממשק משמאל לימין כדי לנעול את הצלחת ממשק בעמדה, המבטיח את הניסוי הוא אטום.
הערה: זרימה של אוויר סטרילי מן הצינורות בצלחת ממשק ידחוף את הנוזל בתוך הבארות כניסת או עודפים (תלוי בכיוון שנבחר באמצעות התוכנה במחשב), כך הנוזל זורם דרך ערוץ צפייה בין כניסת עודפים בארות מותאם אישית כיוון ומהירות מוכתב על-ידי המשתמש.
  • במקטע בקרת ' הטיה ', הגדר את מצב זרימה קבוע ולהגדיר את ההטיה מקסימום דיין 1/cm2 (0.1 הרשות הפלסטינית). לחץ על כניסת וולס עם התקשורת כדי להתחיל את זרימת המדיה של כניסת עודפים וולס (איור 2 א) לשפר את הערוץ. לאחר 5 דקות לחץ על הלחצן ' עצור ' במקטע בקרת לוח טוב. הסר את לוחית ממשק ולצפות הבארות צלחת microfluidic. לאחר הטרמה הערוצים, רק טיפה קטנה של המדיה צריך להיות גלוי הבארות עודפים. אם הירידה אינה גלויה, פריים הערוצים במרווחים של 2 דקות עד הטיפה קטן של התקשורת הבארות שקע יהיה גלוי.
    הערה: לקרקע נדרש להסיר אוויר ערוצי הצפייה ולהבטיח כי הערוצים מלאים התקשורת הרצוי.
  • הסר את לוחית ממשק של הלוח microfluidic והנח אותו בצד על משטח סטרילי. הוסף µL 50 של תרבית תאים (שמתואר בשלב 1.5) לשקע בכל טוב.
    1. בדיקה אלביקנס ג זנים פראי-סוג של מוטציה, להוסיף 50 µL של תרבית תאים (SC5314) פראי-סוג בתקשורת עכביש שתי בארות outlet, Δ bcr1/Δ בתקשורת עכביש כדי שתי בארות עודפים של efg1 Δ/Δ בתקשורת עכביש כדי שתי בארות עודפים. למקם את הצלחת ממשק בחזרה לצלחת microfluidic, לנעול את המכסה (ראה איור 1 לפריסה צלחת).
      הערה: כפי שמתואר בשלב 3.1.1, כל בארות קלט המתאימה להכיל מדיה עכביש.
    2. בדיקה אלביקנס ג ביופילמים בנוכחות B שהוא גוסס או מתחם אחרת עניין, להוסיף 50 µL של תרבית תאים (SC5314) פראי-סוג RPMI-1640 בינוני מארבע בארות עודפים. למקם את הצלחת ממשק בחזרה לצלחת microfluidic, לנעול את המכסה (ראה איור 1 לפריסה צלחת).
      הערה: כפי שמתואר בשלב 3.1.2, כל בארות קלט המתאימה להכיל מדיה RPMI-1640 עם ובלי B שהוא גוסס או מתחם אחרת עניין.
  • במקטע בקרת ' הטיה ', הגדר את מצב זרימה קבוע ולהגדיר את ההטיה מקסימום דיין 2/cm2 (0.2 הרשות הפלסטינית). לחץ על אאוטלט וולס עם תאים כדי להתחיל זרימת מדיה של כניסת עודפים וולס (איור 2 א) כדי להתחיל זריעה של ג אלביקנס. לאחר 3 לחץ על s ללחצן עצור בפקד צלחת טוב סעיף כדי למנוע חדירה הבארות קלט תאים.
    הערה: התאים מועברים מן הבארות עודפים לקראת הבארות כניסת; זה חיוני כי הזרם מופסק לפני התאים מגיעים הבארות מפרץ צר. פעולה זו מבטיחה כי הבארות כניסת לא להזדהם עם תרבית תאים, כי אמצעי התקשורת הבארות כניסת נותר סטרילי משך זמן הניסוי. הטיית הכוח ואת הזמן הדרוש מבוסס על צמיגות של מדיה המשמשת והגודל של התאים.
  • לאפשר את התאים להישאר נייח עם אין זרימת (0 דיין/cm2) למשך 10-20 דקות בערוץ צפייה ב"זכות תא הראשונית. במהלך שלב זה של דבקות 10-20 דקות, להגדיר את המחשב כדי ללכוד את העמדות הבמה מצלמה ולהתחיל רכישת תמונות מראש סומק (שמתוארת בפירוט ב סעיפים 4-6).

    • 4. הגדרת את העמדות הבמה לניסוי. Microfluidic

    הערה: הבמה עמדות וכיול הצלחת להגדיר בדיוק לפני תחילת הניסוי. תוכנית התקנה זו מאפשרת למחשב לאחסן את העמדות של כל ערוץ צפייה עבור לכידת התמונות במהלך הניסוי. ואסור להפריע את הצלחת microfluidic לאחר הגדרת את העמדות הבמה. אם הצלחת מועבר, העמדות שלב תצטרך לאפס לפני תחילת הניסוי.

    1. השתמש בתוכנת ניתוח של ויזואליזציה (ראה טבלה של חומרים) כדי להגדיר את הבמה עמדות; כל ערוץ צפייה הינו שלב (1-24) (איור 1D) ויש בכל שלב שלושה תת שלבים (1-3) עבור לכידת התמונה לעבר עמדות שונות לאורך הערוץ צפייה (איור 1C). בחלון מודול ההדמיה, פתח את ' Multi-dimensional' (מד א) המודול על ידי לחיצה על הכרטיסיה מד א (איור 2B).
    2. מד א מודול לחץ על הכרטיסיה 'הבמה' בתפריט בצד שמאל (איור 2B). במקטע שלב, לטעון את רשימת שלב בסיס לצלחת microfluidic 48 טוב 0 - 20 דיין. כל ערוץ צפייה צריך שלושה שלבים עבור רכישת התמונה.
    3. לפתוח את 'מדגם רענן התאמת' (ההזמנות) ואת 'שלב לעבור למיקום המוחלט' מודולים (מפה) על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ההזמנות ועל הכרטיסיה מפה (איור 2B). במודול ההזמנות, לחץ על לחצן 'Live' כדי לראות מקדימה של תמונה עם הכוונת.
    4. באמצעות ג ' ויסטיק, מקם את הצלחת טוב כזה בקצה החץ (ממוקם פיזית על הצלחת) יישור סמוכים להצגת ערוץ 4 עם העדשה על התוכנה. בתפריט ' מפה ', לחץ על לחצן 'הגדר מקור' (איור 2B). המיקום הנוכחי צריך לקרוא עכשיו בתוך 0 X, Y ו- Z.
    5. במודול ההזמנות, לחץ על המקטע 'נקודות התייחסות ראשונית' בתפריט השמאלי (איור 2B). לחץ על 'טען קביעות', לטעון את הקובץ לצלחת microfluidic 48 טוב 0 - 20 דיין.
    6. בחלק שלב של המודול מד א, לחץ פעמיים על ' מיקום הבמה 22,2'. עמדה זו עולה באמצע (תת שלב 2) הצפייה ערוץ מספר 22. זה יביא המיקרוסקופ במלונות הבמה וסגור המוקד מצלמה ב מהקרבה סמן החץ על-ידי הצגת ערוץ 22. באמצעות ג ' ויסטיק, מקם את הצלחת טוב כזה בקצה החץ (ממוקם פיזית על הצלחת) יישור סמוכים להצגת ערוץ 22 עם העדשה.
    7. העתק קואורדינטת Y במודול מד א למצב Y של נקודה 2 בכרטיסיה 'נקודות התייחסות עדכון' של מודול ההזמנות (איור 2B).
    8. בכרטיסיה 'עדכון הבמה עמדות' ההזמנות, לחץ על 'החל על רשימה הבמה מד א' (איור 2B).
      הערה: זה לעדכן את כל הצגת עמדות הבמה בצלחת (1-24) כדי להיות מכויל למיקום צלחת microfluidic ספציפית על הבמה מיקרוסקופ.
    הצלחת מוכן כעת עבור רכישת התמונה וישתמש את העמדות הבמה מכוילת כדי להעביר תוך לכידת תמונות מתוך שלושה תפקידים כל 24 במלונות ערוצים.

    5. הגדרת רכישות עבור התמונה ללכוד במהלך הניסוי Microfluidic

    1. בחלון מודול ההדמיה, להשתמש במודול מד א ולחץ על הכרטיסיה 'שמירה' בתפריט השמאלי (איור 2B). בחר את שם הקובץ עבור הניסוי ואת התיקיה כדי לאחסן תמונות רכשה את המחשב.
    2. במודול מד א, לחץ על הכרטיסייה 'Timelapse' בתפריט השמאלי ולהגדיר אותו לרכוש תמונות סה כ 145; הגדר את timelapse בין תמונות ל 5 דקות. התוצאה תהיה 1 תמונה כל 5 דקות עבור ניסוי פיתוח biofilm 12 שעות.
      הערה: מרווח הזמן בין התמונות לבין המספר הכולל של תמונות יכול להיות מותאם בהתבסס על דרישות ניסיוני. אם הדמיה יותר מ 12 שעות, להוסיף מדיה נוספים הבארות כניסת בשלב 3.1 על מנת להבטיח הבארות לא להתייבש. לניסויים עוד להוסיף מדיה נוספים, לפי הצורך (µL 50/h) הבארות מפרץ צר.
    3. במודול מד א, לחץ על הכרטיסייה 'אורכי גל' בתפריט השמאלי (איור 2B) ולהגדיר את מספר הגל לניסוי כ- 1. קבע את אורך הגל כדי ללכוד ב 50% Brightfield ו-50% מצלמה עם מועד החשיפה של 12-20 ms, רווח 0.6 ב- 20mhz digitizer.
      הערה: אורכי גל נוספים ניתן להשתמש, כולל אורכי גל לדימות קרינה פלואורסצנטית (לדוגמה, אנחנו בהצלחה רוחי mCherry וללחצים GFP מתויג אלביקנס ג שימוש במכשיר זה microfluidic). בנוסף ניתן לשנות את הפרמטרים של רכישת בהתבסס על דרישות ניסיוני. לדוגמה, הגדרת אורך גל השני ובחירת 'פוקוס אוטומטי על כל Timepoint' "Autoexposure על כל Timepoint" של הגל השלישי ובחירה מומלץ למתחילים למצות הזדמנויות רכישה תמונות כי הם בפוקוס.
    4. המודול מד א, בחר את הכרטיסיות רשימה הבמה בתפריט השמאלי. שלבים – 1, 1 24,3 יוצג. אחד אחד, לחץ על כל שלב, ולהשתמש בהגדרות המיקוד בסדר להתמקד באופן ידני התאים בערוץ צפייה עבור כל שלב. לאחר שדה הראייה בפוקוס, לחץ על החץ השחור לצד הרשימה הבמה כדי לעדכן ושמור את ההגדרות עבור כל שלב. שהמחשב ישתמש אלה עמדה באופן ידני על-ידי הגדרות והגדרות מוקד לרכוש תמונות בכל נקודת זמן. הסר במות שאינם בשימוש מתוך הרשימה באמצעות החץ 'הסר'.
      הערה: מודול מד א ואת התוכנית להתייחס לצפייה ערוצים כמו שלבים לסירוגין, ומשמש באותה הטרמינולוגיה על ידי התוכנה.

    6. עורכים את הניסוי Microfluidic

    1. בחלון מודול ההדמיה, בעזרת המודול מד א, בחרו 'ייבוא' כדי להתחיל בלכידת תמונות מראש סומק של תאים מודבקת על כל תתי שלבים (איור 2B).
      הערה: את החלון מודול ההדמיה והפקדים מצלמה עכשיו יציג תמונות נמצאים בשבי, המודול מפה, ההזמנות, מד א כבר לא יהיה גלוי. התמונות שנתפסו גם יראה טיימר על הצד, כדי לציין את מספר תמונות שצולמו, את זמן לשגות לפני המחזור הבא של לכידת תמונה יתחיל. המתן סיבוב אחד של תמונות כדי להיות בשבי לפני שתמשיך לשלב הבא.
      הערה: אין להשתמש בלחצנים 'השהה' או "מארק אירוע" על המסך חלון מודול ההדמיה. מנקודה זו ואילך במהלך הניסוי, לשמור על העכבר רק על החלון מודול הבקרה על מסך המחשב השני (איור 2 א). זה חשוב שלא להפריע למטופלים את החלון מודול ההדמיה.
    2. ב בקרה מודול חלון השהייה על מצב ידני על הצלחת. במקטע בקרת ' הטיה ', הגדר את מצב זרימה קבוע ולהגדיר את ההטיה מקסימום דיין 1/cm2 (0.1 הרשות הפלסטינית). לחץ על בארות עודפים O1, O7, O13, O19 להתחיל את זרימת המדיה של כניסת עודפים וולס (איור 2 א) כדי להסיר תאים שאינם דבקה. לאחר 5 דקות לחץ על הלחצן ' עצור ' במקטע בקרת לוח טוב. לאפשר סיבוב שני של תמונות כדי לרכוש. תמונות, ניתן לאבחן ו ניתן לנטר את זמן לשגות במסך השני של החלון מודול ההדמיה.
    3. במקטע בקרת ' הטיה ', להתאים את זרימת מקסימום הטיה דיין 0.5/cm2 (0.5 הרשות) על ידי לחיצה על המספר המירבי להטיה עמודה, שימוש בלוח המקשים כדי להזין 0.5. הקש על מקש enter במקלדת, לאשר את השינוי קצב הזרימה ביומן האירועים של החלון מודול הבקרה (איור 2 א). להשאיר את הניסוי ללא הפרעה בחושך במשך 12 שעות.
      הערה: חשיפה לאור ורעידות/תנועה יכול קשות לצמצם את איכות התמונות רכשה לאורך כל הניסוי. בסוף הניסוי microfluidic, החלון מודול ההדמיה לא יציג תמונות, יחזרו מציג את המודולים ההזמנות, מפה, מד א. התוכנה מודול ההדמיה יכול לשמש כדי להציג את התמונות, להרכיב את קטעי וידאו, לכמת biofilms נוצר (כמפורט להלן).

    7. ניתוח התוצאות

    1. בחלון מודול ההדמיה, בחר את הכרטיסיה 'כלי ניתוח' ולחץ על 'סקירה Multi-dimensional נתונים' (RMD) מהמסירה למטה בתפריט. במודול RMD, לחץ על 'בחר קובץ בסיס'. פעולה זו תפתח חלון 'כלי שירות של ערכת הנתונים Multi-dimensional'.
    2. לחץ על לחצן 'בחר ספריית האתר' ובחר את התיקיה ששימש לשמור את הניסוי בשלב 5.1. ברשימה 'ערכות נתונים', בחר את הניסוי קובץ יומן הרישום (סיומת. .nd). ברגע נטען את יומן הרישום, לחץ על הלחצן 'תצוגה'.
    3. בחר את אורך הגל על ידי לחיצה על האפשרויות בתפריט השמאלי 'אורכי גל' ובחר מיקום הבמה להציג מהתפריט הנפתח. בחר את התמונה שיש לטעון מ המספרים על המודול בלחיצה ימנית על מספר תמונות. ברגע שנבחר, לחץ על לחצן 'טען כתמונות' כדי לטעון את התמונות. באפשרותך להציג תמונה אחת או כל התמונות בבת אחת.
    4. בחר את כל התמונות כדי להפוך את זמן לשגות וידאו. התמונות הנבחרות יפתח כווידאו בחלון חדש. לחץ על הכרטיסיה 'קובץ' ב חלון מודול ההדמיה ובחרו 'שמור בשם' מהתפריט הנפתח. שמירת וידאו שהתקבל כקובץ ברירת המחדל (TIFF/MetaSeries).
    5. פתח, לטעון את קובץ הווידאו שנשמר באמצעות תוכנת ImageJ. ב- ImageJ, לחץ על הכרטיסיה 'קובץ' ולחץ על 'שמור'. בחרו '.avi' מהתפריט הנפתח, להמיר את הקובץ כקובץ avi באמצעות ההמרה JPEG מוגדר 10 מסגרות לשנייה.
      הערה: ניתן להתאים את המהירות של הווידאו על ידי שינוי של המסגרות לשנייה.
    6. כדי לכמת biofilms, חזור על שלבים 7.2 7.3, 7.4.
    לבחור את התמונה האחרונה (מס ' 144) ולחץ על הלחצן 'טען כתמונות' כדי לטעון את התמונה. התמונה תפתח בחלון חדש. לחץ על לחצן '' סף תמונה ובחר 'כלול' סף. הזז את הסמן עד התאים biofilm צבועים באדום, אזורים עם אין תאים לא צבועים.
  • לחץ על לחצן 'יומן פתוח' כדי לבצע רישום מידות (הלחצן יציג רק בתחילה "יומן פתוח"; לאחר רישום הוא הפעיל הלחצן ישונה כדי ' F9: נתוני יומן רישום '). בחלון 'יומן נתונים פתוח' בחר 'חילופי מידע דינאמיים', לחץ על 'אישור'.
  • בחלון מודול ההדמיה, בחר את הכרטיסיה 'כלי ניתוח' ולחץ על 'הצג סטטיסטיקה אזור'. פעולה זו תפתח חלון חדש להצגת המידות מתוך התמונה. בחר 'כל התמונה' 'מידה' האפשרויות הזמינות ולחץ ' F9: נתוני יומן רישום.' קובץ excel עם כל המדידות יוצג. לאתר את הערכים עבור 'אזור' ואזור ' Thresholded', לחלק האחרון על ידי לשעבר כדי להשיג ערך מספרי עבור האזור שנכבש על ידי biofilm.
    הערה: 'אזור' עבור כל תמונה שהתקבל במהלך הניסוי הוא זהה, ולכן המדידה 'אזור Thresholded' יכול לשמש כדי להעריך את ההבדלים ביופילמים בין זנים פראי-סוג וללחצים מוטציה או להעריך את היעילות של התרופה שנבדקה על ביופילמים.

    • Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    תוצאות

    ביצענו microfluidic biofilm וזמינותו המתוארים כאן על ידי שימוש פראי-סוג של מתח אלביקנס ג בתנאים מדיה שני (RPMI-1640, עכביש מדיה), המתח פראי-סוג בנוכחות הסם פטריות ידוע שהוא גוסס B (16 µg/mL)-RPMI, שני זנים מוטציה בעבר דווח כי פגמים במבנה biofilm (Δbcr1/Δ וδ efg1/Δ) בתקשורת עכביש.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    Microfluidic להתאמה אישית biofilm וזמינותו המתוארים כאן מאפשר החזיית ביופילמים ב בזמן אמת ברמה תא בודד כאשר הם נחשפים זרימה שכבתית בריבית קבועה עם טמפרטורה קבועה. הוא מספק אמצעי רב עוצמה כדי ללמוד על התפתחות biofilms בפראי-סוג של מוטציה זנים, ההשפעות של הסוכן מיקרוביאלית טיפולים על biofilms בתנאים המחקים ?...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    קלריסה ג'יי Nobile הוא מייסד BioSynesis, inc., חברה פיתוח מעכבי ואבחון של biofilms אלביקנס ג .

    Acknowledgements

    אנו מודים לכל חברי המעבדה Nobile לדיונים מועיל על מבחני biofilm. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק R21 AI125801 (C.J.N.). D.L.R. נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מאוניברסיטת קליפורניה המכון מקסיקו, ארצות הברית (UC-MEXUS) ו y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Technologia (CONACYT).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    BioFlux 1000zFluxionAutomated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyneFluxion910-0047Microfluidic plate
    Montage SoftwareFluxionVersion 7.8.4.0Visualization analysis software
    ImageJ SoftwareNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast ExtractCriterionC7341
    Bacto PeptoneBD Biosciences211677
    Dextrose (D-Glucose)Fisher ScientificD163
    Potassium Phosphate MonobasicFisher ScientificP285-500
    RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
    MOPSSigma-AldrichM3183
    Nutrient BrothCriterionC6471
    Difco D-MannitolBD Biosciences217020
    AgarCriterionC5001
    Amphotericin BCorning30-003-CF
    Sterile Inoculating LoopsVWR30002-094
    Petri Dishes with Clear LidFisher ScientificFB0875712
    Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
    Lens PaperVWR52846-001
    Microplate and Cuvette SpectrophotometerBioTekEPOCH2TC
    Shaking IncubatorEppendorfM12820004

    References

    1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
    2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
    3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
    4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
    5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828(2010).
    6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
    7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
    8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
    9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
    10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
    11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
    12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
    13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
    14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
    15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
    16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
    17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
    18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
    19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130Biofilmmicrofluidicbiofilmbiofilmbiofilmbiofilm

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved