עקיבה Neuroanatomical רטרוגרדית של הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לזיהוי הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים לאחר מסירת intrapleural fluorophore מצומדת כולרה הרעלן יחידה משנית בטא. שתי טכניקות מושווים להחדיר את חלל הצדר: transdiaphragmatic לעומת גישות אקו.

Abstract

הסרעפת מוטורי לגלוקוז הם צוואר הרחם מוטורי לגלוקוז שמקורם C3 C6 רמות ב יונקים ביותר. תחזיות עצב להתכנס לתוך הסרעפת העצבים innervating הסרעפת בדרכי הנשימה. חוט השדרה פרוסות, הסרעפת מוטורי לגלוקוז אין אפשרות לזהות של אחרים מוטורי לגלוקוז על קריטריון מורפולוגי או ביוכימי. אנו מספקים את התיאור של נהלים להמחשת גופות תא הסרעפת נוירון מוטורי בעכברים, זריקות intrapleural הבאות של כולרה הרעלן יחידה משנית בטא (CTB) מצומדת כדי fluorophore. מעקב neuroanatomical פלורסנט הזה יש את היכולת שהסתבכת בצומת עצב-שריר הסרעפת, האקסונים הסרעפת מידך retrogradely ולהגיע הגופים תא הסרעפת. שתי גישות מתודולוגיים intrapleural CTB מסירה מושווים: transdiaphragmatic לעומת זריקות אקו. שתי הגישות מצליחים וגוררים מספר דומה של התווית על-ידי CTB הסרעפת מוטורי לגלוקוז. לסיכום, שיטות אלה ניתן להחיל באופן חזותי או לכמת את הסרעפת מוטורי לגלוקוז במחקרים ניסיוני שונים כגון אלה התמקדו המעגלים דיאפרגמה-הסרעפת.

Introduction

מטרת המחקר היא להציג שיטה אמינה כדי לזהות הסרעפת מוטורי לגלוקוז (PhMN) על העכבר בחוט השדרה חלקים. הזרקה של מכשיר מעקב neuroanatomical פלורסנט בחלל פלאורלי נבחרה שיטת המשלוח יגיע ההשתקפויות עצב-שריר הסרעפת אל הסרעפת, להשתמש בתחבורה רטרוגרדית לאורך האקסונים הסרעפת לתייג גופות תא הסרעפת. שתי טכניקות מסירה intrapleural מתוארים: transdiaphragmatic נגד אקו.

הסרעפת מוטורי לגלוקוז הם תאים ממסר בעמוד השדרה אשר אקסונים להתכנס לתוך הסרעפת העצבים, אשר בסופו של דבר innervate הסרעפת. אלה נמוך מוטורי לגלוקוז הכונן inspiratory ממרכזי נשימה bulbar וקבלת העברתו אל צמתי neuro-שרירים הסרעפת (NMJ). PhMN בנויות לתוך שתי עמודות מוטוריים, אחד עבור כל hemicord, פועל לאורך עמוד השדרה אמצע-צוואר הרחם. ברוב זני יונקים לרבות בני אדם, העמודות מנוע הסרעפת התפשט ברמות C3 C6^1,2,3. אנחנו ואחרים אישרו כי PhMN מרוכז ברמות C3-C5 עכבר ועכבר חוט השדרה^4,5,6,7,8. התפלגות הטופוגרפי של תאים הסרעפת אינו אקראי; מוטורי לגלוקוז innervating החלק בחיתוך של הסרעפת מופצים יותר בצפיפות בחלק הגולגולת של הסרעפת בתחזוקת (C3), בעוד מוטורי לגלוקוז innervating החלק crural הם יותר סימטרית (C5)⁹. יתר על כן, PhMN מקובצים בדרכים שונות בהחומר האפור קרן הגחון. בגובה C3, האשכולות של תאים הסרעפת לשקר רוחבית, ואז הם משמרת בכיוון ventrolateral נמצאים ventromedially ביותר סימטרית רמות^10,11.

בהינתן תפקידם חיוני במהלך השראה, זה חשיבות עליונה כדי לזהות במדויק PhMN בחוט השדרה בריא אך גם לעקוב אחר גורלם במהלך מצבים פתולוגיים, כמו מחלות ניווניות או פציעה טראומטית של חוט השדרה. מאחר PhMN לא נבדלים מורפולוגית אחרים צוואר הרחם מוטורי לגלוקוז, זיהוי של PhMN מסתמך על מסירת יישוב המשדרים neuroanatomical או ברמה של מרכזי הנשימה העיקרי⁸, או ב- NMJ הסרעפת⁷ או ב עצב הסרעפת⁴. רכיב המעקב הוא נלקח על ידי סיבי העצב ונשא עד הגופים תא הסרעפת בעמוד השדרה הצווארי, שם זה ניתן לאבחן באמצעות מערכות זיהוי ישיר או עקיף. ואחר כך נסיגה או anterograde המשדרים זמינים מסחרית עם מגוון רחב של conjugates. ראוי לציין, מעקב כל אחד ניחן לא, יכולות נמוך או גבוה לעקיבה סינפטית טרנס.

במחקר הנוכחי, בחרנו את יחידת משנה של בטא של הרעלן כולרה (CTB) functionalized עם אלקסה עבור חיל הים 555 (המכונה מעתה ואילך CTB-fluorophore) כתווית פלורסנט, ומאפשר פריט חזותי ישיר של PhMN על חלקים קפואים בחוט השדרה. CTB מתואר בדרך כלל מכשיר מעקב monosynaptic למרות נתוני הניסוי נוטים להראות עם המעבר transneuronal¹². CTB יש את היכולת לאגד את ganglioside GM1-קרום הפלזמה של הסוף עצב. CTB הוא הפנימו דרך clathrin תלוית או - עצמאית מנגנונים ו- traffics דרך הרשת הטרנס-גולג'י לתוך רשתית תוך-פלזמית^13,אופנה רטרוגרדית¹⁴. הפנמה של תחבורה רטרוגרדית נראה אסתמך על ה^15,שלד התא אקטין¹⁶ כמו גם על רשת microtubule¹⁷.

כדי להדגים את התועלת של CTB בתור מכשיר מעקב neuroanatomical רטרוגרדית תיוג דיאפרגמה-PhMN המעגלים, נמסרה CTB-fluorophore intrapleurally. CTB היה מנוהל באמצעות שתי שיטות: הראשון כולל פתיחה של הבטן זריקות transdiaphragmatic מרובים; השני, פחות פולשני, להשתמש זריקה אקו ייחודי. ארבעה ימים מאוחר יותר, שכותרתו fluorescently PhMNs היו לכמת בחוט השדרה הצווארי מן בריא והן מחיות (C4) נפגע spinally.

Protocol

פרוטוקול הניסוי נערך בהתאם להוראות מועצת הקהילות באירופה לניסוי בעל חיים (2010/63/האיחוד האירופי, 86/609/EEC ו- 87-848/EEC), אושרה על ידי החיה אתיקה הוועדה של אוניברסיטת נאמור (מוסר פרוייקט n ° 17-284 ). איור 1 מציג את שתי הגישות בהתאמה: transdiaphragmatic או זריקות אקו. השתמש עכברים C57bl/6J זכר (n = 18), בגילאי 3 עד 4 חודשים במחקר.

1. הכנת CTB פתרון

1. לזריקות transdiaphragmatic:
   1. להמיס את הכוח CTB במים סטריליים לריכוז 0.2% (w/v).
   2. טען µL 7.5 של CTB פתרון (0.2% w/v) ב סטרילי 10-µL-microsyringe עם מחט בקוטר 33 המצורפת (שיקוע בוטה או קצר) עבור כל עכבר.
2. להזרקה אקו:
   1. להמיס את הכוח CTB במים סטריליים לריכוז 0.1% (w/v).
   2. לטעון µL 20 של CTB פתרון (0.1% w/v) מזרק 500-µl-אינסולין סטרילי עם מחט 27-מד משופע עבור כל עכבר.
      הערה: הקפד להשתמש במים מזוקקים, סטרילי, כראוי להמיס את האבקה CTB. הפתרון ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש (לא להקפיא). את התמיסה שעלולים להיווצר לאחר כמה ימים. להביא את הפתרון לטמפרטורת החדר ומערבבים היטב בעזרת פיפטה לפני השימוש.

2. הכנה לפני זריקות Intrapleural

1. לחטא כלי ניתוח לפני הניתוח, באמצעות מעקר אוטוקלב או חרוזי זכוכית. להכין מעיל נקיים לעשות ניתוח, להיפטר כלים כירורגיים.
   הערה: כל חומר המשמש במהלך הליך כירורגי צריך להיות סטרילי. כלי זה לא ניתן לעקר כגון microsyringe שאמור להימחק עם חומר מחטא (chlorhexidine) או צריך להיות חד-פעמי בלבד. המנתח צריך לשטוף את הידיים שלו עם חומר מחטא (chlorhexidine סקראב) לפני תחילת הניתוח. המנתח צריך ללבוש כפפות סטריליות facemask, חלוק נקי.
2. שוקל חיה, ולפקח על המינון המתאים של הרדמה: הזרקה בקרום הבטן של הרדמה קוקטייל (למשל קטמין 100 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים 5 מ"ג/ק"ג).
3. לצבוט הבוהן ו/או לבדוק ההפסד של רפלקס palpebral כדי לקבוע אם העכבר הוא מורדם כראוי. להחיל משחה הוטרינר כדי להגן על הקרנית.
4. לגלח בקפידה את העור הגחון (עבור הליך transdiaphragmatic) או ימנית צדדית בית החזה העור (עבור הליך אקו), בעזרת קוצץ שיער חשמלי. מגלחת טוב ורחב מספיק כדי למנוע שיער מקבל לתוך שדה הניתוח.
5. להבטיח תנאים aseptic על-ידי יישום מקומי של 10% הפתרון יוד על האזור המגולח. להשתתף באתר כירורגית עם הפתרון יוד, וישתדלו לקרצף מהמרכז של האתר לעבר הפריפריה.
6. השתמש כרית homeothermic לאורך כל הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת גוף של החיה.

3. Intrapleural זריקות באמצעות גישה Transdiaphragmatic

1. . תשכבי על העכבר anesthetized במצב פרקדן על משטח חימום מקם כרית גזה מגולגלת מתחת לצוואר של החיה. העכבר למבוגרים, להשתמש בפתקים גזה מגולגלת 0.5 ס מ עובי. קלטת זו pad ללוח ניתוח כדי למנוע תנועה אם בכלל.
2. באמצעות להב אזמל, פצעים וחתכים בעור הגחון לאורך הקו האמצעי: בחתך של הסרעפת באזור הטבור תוך מתיחת עור רוחבית עם היד השנייה כדי להפוך את העור מתוח. אל תחיל לחץ רב מדי על הלהב כדי למנוע נזק איברים המשמש כבסיס.
3. בעזרת מספריים קטנות, ניתוק בקפידה את העור מפני שרירי הבטן סביב החתך. הליך זה יעזור לתפירת השרירים ואת העור בנפרד בסוף הניתוח.
4. לבצע בעזרת מספריים קטנות laparotomy. פתח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך בדש ברמה של הטבור. תחתכי את שרירי הבטן לאורך הקו הלבן ("linea alba") עד הסרעפת.
5. על מנת להמחיש את פני הבטן הסרעפת, משכי שרירי הבטן בעזרת רטרקטורים מסחריים או תוצרת בית.
   הערה: אלה רטרקטורים יכול להיעשות מתוך מהדקי נייר בגודל midi בצורת L-הוק¹⁹.
6. למתוח את שני הצדדים של פתיחת בטן, וכן הקלטת למטה דרק המעיל ספסל. למטב את ההארה של שדה הראייה כך פני הבטן הסרעפת היא לא יותר בתוך הצללים. המכשיר תאורה החזקים ביותר למטרה זו הוא מנורת LED עם קרני האור orientable.
7. באמצעות פינצטה רך ביד אחת, תרים את התוספתן xyphoid ולפתוח האונות לרוחב של הכבד (איור 2 א). בעזרת מספריים קטנות ביד אחרים, בזהירות לחתוך רצועה suspensory, ללא פגיעה בכיס המרה או הסרעפת (איור 2B).
8. באמצעות פינצטה רך ביד אחת, הרם את התוספתן xyphoid. לתפוס את המזרק המילטון וביד השנייה. יעד שלושה אתרים של הזרקת ב ריקמת לכסות את בחזה ובצלעות, בהתאמה, את האמצעי ואת האזורים crural (איור 3A, כניסה ב- 3B איור).
9. כמו העובי הסרעפת מ 0.37 מ בסביבה עכברים⁷, הכנס את המחט לא יותר מ 1 או 2 מ מ מעבר הגיליון הסרעפת כדי למנוע נזקים ריאות במהלך הנשימה. לספק µL 2.5 של CTB פתרון (0.2% w/v) דרך הסרעפת נכון בכל אתר (איור 4B). ייצוב של הסרעפת אינה נדרשת.
10. חזור על הליך זה עבור שלושת האתרים חולשת של הזרקה (איור 1 א'), ו contralaterally עבור תיוג דו צדדיים של הבריכה PhMN.
11. כדי לסגור את האתר פתיחת בטן, תפר שרירי הבטן עם resorbable 4-0 בתפר. שימוש תפרים קטעה במרווחים קבועים על ידי 3 מ מ. הידוק העור סגור עם קטעי 9.0 mm פצע. הדק סיכות כדי למנוע חיה חליצה סטייפלס. שטח סטייפלס כ 5 מ מ אחד מהשני. יתר להדק את הפריטים הפצע, כמו זה יכול להוביל לריפוי לקוי.
12. המזרק מיקרו לנקות עם מים מזוקקים למניעת סתימת. לאט לאט למשוך ולהוציא 2 - 3 פעמים. אל תצייר אוויר לתוך מזרק.

4. Intrapleural הזרקת בגישה אקו

הערה: שיטה זו השראה מן ההליך המתואר חולדות⁴ , הותאם העכבר.

1. . תשכבי העכבר השמאלי למקם חמצן לרוחב, על כרית החימום (איור 4A) anesthetized
2. לזהות את הצלעות השישית לשביעית תחת באזור המרפק על ידי מישוש ידני (איור 4B).
3. בעוד עוזרת מרחיב נכון קידמה - ו הינד-הגפיים (איור 5A), הכנס את המזרק אוריינטציה cranially, tangentially תחת השישי או הצלע השביעית, 3 מ מ עמוקה מהעור, עם שפוע למטה (איור 1B , איור 5B).
4. לרומם את המחט בעדינות כדי לאשר, על-ידי הרמת הצלעות למעלה, זה היא ממוצבת היטב לתוך חלל בית החזה (איור 5C, כניסות ב איור 1B).
5. ייצוב נושם תנועות החזה על ידי הפעלת לחץ קל עם שתי אצבעות על הקיר החזה.
6. בעוד אתה מחזיק את המזרק ביד אחרים, לספק 20 µL של CTB פתרון (0.1% w/v) זריקה אחת.

5. לאחר הניתוח טיפול

1. מיד לאחר הניתוח, להניח את העכבר במצב חימום הימנית על משטח homeothermic להתאוששות. זה מבטיח את רכיב המעקב למרוח אותו על הצד הימני של חלל פלאורלי, מאפשר ניטור הנשימה של בעלי החיים.
2. מחלקים 1 מ"ל של תמיסת סטרילית i.p. subcutaneously. לספק זריקות המשך טיפול אם החיה מופיע מיובש ו/או תשוש.
3. ניהול subcutaneously 0.1 מ"ג/ק"ג של הבופרנורפין, פעמיים ביום במשך יומיים שלאחר הניתוח הראשון, כדי למזער את כאב פוטנציאליים.
   הערה: מוסדות רבים ממליצים שיכוך כאבים עם מודאלים מרובים עבור הליכים פולשניים, כגון פתיחת בטן מתוארים כאן. הדבר עשוי לכלול שימוש תרופות אנטי דלקתיות לא סטרואידיות (NSAID) ו/או סוכן הרדמה מקומית באתר החתך. תרופות אלו מועברים בדרך כלל לפני החתך הראשוני כדי למזער את הכאב המכנית.
4. לפקח על חיות מדי יום עד המתת חסד.

תוצאות

עכברים C57bl/6J זכר (n = 18), בגילאי 3 עד 4 חודשים נכללו במחקר. ביום 0 של הניסוי, עכברים 8 עברה לחבורה C4 חד צדדית, ימנית צדדית, על-פי פרוטוקול שפורסמו^7,18. כמו שאם שגרת, עכברים 10 עברה של laminectomy על C4 בלי החבורה. יום 3, עכברים הוכנו על הזריקות intrapleural של CTB-fluoropho...

Discussion

ניתן להחיל את פרוטוקול המתוארים בזאת כל זן של עכברים בוגרים או כל פרדיגמה נסיונית שבה ניתן להעריך את תקינות המעגלים דיאפרגמה-PhMN. למשל, נוירודגנרטיביות (ALS) פגיעה בחוט השדרה הצווארי (cSCI) הם תנאים הקשורים PhMN הפסד, anterograde ניוון של אקסונים הסרעפת ואת הבאים פשרה בדרכי הנשימה. מודלים חייתיים של ALS ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm