JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

Abstract

נדידת תאים הוא היבט חובה עבור ריפוי הפצע. יצירה מלאכותית פצעים בדגמים בעלי חיים למחקר לעיתים קרובות תוצאות בפרוצדורות ניסיוני יקר ומסובך, בעוד פוטנציאלי חסר דיוק. In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק הפלטפורמה המתאימה עבור חוקר ההתנהגות נודדות תא ריפוי הפצע, את ההשפעה של טיפולים על תאים אלה. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת בתנאים שאינם-confluent; עם זאת, גישה זו אולי לא מזכירים ריפוי בתנאים טבעיים הפצע. לשבש את תקינות אפיתל באמצעים מכניים יוצר מודל מציאותי, אך עשוי לעכב את היישום של טכניקות מולקולריות. כתוצאה מכך, טכניקות במיקרוסקופ מבוסס הם אופטימליים ללימוד נדידת תאים אפיתל במבחנה. כאן אנחנו מפרטים שתי שיטות ספציפיות, וזמינותו גירוד פצע מלאכותי, וזמינותו קבלה העברה מלאכותית, תועמד נתונים כמותיים ואיכותניים, בהתאמה, על הביצועים הנדידה של תאים אפיתל.

Introduction

נדידת תאים דרוש לריפוי הפצע, כפי שהוא אחראי על הסגר הסופי של הפער אפיתל ושיקום של פני השטח שיבשו1. ביצוע פצעים מלאכותי בבעלי חיים מאפשר להקים את ההעתק של תהליך מורכב זה ליד בתנאים פיזיולוגיים2. עם זאת, גישה זו לעתים קרובות התוצאות נהלים ניסיוני יקר ומסובך, שעשוי להיות חסרי דיוק לחקר תהליכים ברורים, בשל אופיו המורכב של תהליך ריפוי פצע.

In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק אלטרנטיבה מועיל חייתיים לחקור את התפקיד כי תאים אלה לשחק ב ריפוי הפצע ואת ההשפעות של טיפול להתנהגות הנדידה התא. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת על ידי טכניקות מולקולריות באמצעות התרבויות הלא-confluent3,4,5,6; עם זאת, שיבוש שלמות אפיתל בדרך כלל מושגת על ידי חתכים מכני טוב. בתרבות תא, זה מרמז כי עלול להיות חשוף זניח מספר התאים הפער הפצע, הם מייצגים מדגם קטן מדי עבור שיטות בביולוגיה מולקולרית. עם זאת, נגעים אלה ניתן יהיה ללמוד את קנה המידה מיקרוסקופיים, מנצל המאפיינים נודדות מולדת של שורות תאים אפיתל מסוימים, כגון התא מינק ריאות אפיתל (Mv1Lu) או את התא באופן ספונטני מונצחים אנושי תקין (HaCaT) קווים.

כאן אנחנו תיאר שיטה מיקרוסקופ מתאימה לקבל נתונים כמותיים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד בהקשר של3,-4,-7,-8ריפוי הפצע. יתר על כן, אנו מציגים נוספים בשיטות שאינן מועילות ללמוד שינויים מורפולוגיים המולקולריים איכותית המתרחשים monolayers אפיתל במהלך ההעברה. בסך הכל, שיטות אלה מספקים מסגרת ללמוד dynamics והן שינויים מורפולוגיים מעורב עם תאים אפיתל התנהגות בתגובה טיפולים במהלך ריפוי הפצע.

Protocol

1. מלאכותי הפצע Assay מאפס עבור מחקרים כמותיים

  1. הכנת טפט תא
    1. עובד תחת תנאים סטריליים, זרע ולגדול Mv1Lu או HaCaT תאים אפיתל מבחנות תרבות באמצעות בתוספת-סרום בינוני. רענן בינוני פעם כל 24-48 שעות. לאחר תאים להגיע למפגש 80%, ניתוק תאים באמצעות של השיטה המתאימה, כלומר, trypsinization9.
      הערה: Mv1Lu HaCaT שורות תאים אפיתל מתורבתים באמצעות EMEM ו- DEMEM תרבות בינוני, בהתאמה, בתוספת 2 מ מגלוטמין ו מודגרות ב 37 ° C עם אווירה מבוקרת של 5% CO2. כל קו תא חייב להיות לבדיקה ביסודיות כדי לקבוע ריכוז התא ואת התזמון הנדרש כדי להגיע confluency מלא. בדרך כלל עבור תאים Mv1Lu או HaCaT, 2-4 x 104 או 4-6 x תאים4 10/טוב, בהתאמה, הם נזרע בבקבוקון תרבות2 175 ס' ' מ, ב- 80% הנהרות מניב עד 35 x 106 Mv1Lu או עונה 1 פרק 107 HaCaT תאים.
    2. בצלחת או תרבות טוב 12 או 24-ובכן, זרע היטב כל 2 מ"ל של תאים. רענן בינוני לאחר כל ה 24-48 מספרי הטלפון הנייד ודא גבוה מספיק כדי להגיע למפגש 100% לאחר 2-3 ימים.
    3. אחרי התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיום בתוספת-סרום, לשטוף פעמיים עם בינונית ללא סרום טריים. לשמור תאים ללא סרום בינוני במשך 24 שעות לפני גירוד.
      הערה: תאים Mv1Lu או HaCaT אין דרישות מיוחדות המצע; עם זאת, עבור שורות תאים רגישים ניתוק באופן ספונטני בתנאים ללא סרום, ציפוי מראש של המשטח צלחת תרבות באמצעות פתרון פולי-L-ליזין יש לשקול10.
  2. טפט מגרד
    1. עובד בסביבה סטרילית, לגרד את טפט תרבות על-ידי בחוזקה גרירת הקצה הצר של µL 20 או 200 עצה micropipette עקר µL, בהתאם הרוחב הרצוי מאפס. שמור על הקצה בניצב למשטח תרבות להגדיל את הפער הומוגניות.
      1. מקם את הצלחות התרבות על-גבי משטח כהה לעקוב בבירור את טפט תא. במידת הצורך, לבצע שתי שריטות בניצב (בצורת צלב) על כל טוב ללמוד עד 4 תחומי ההעברה.
    2. רחץ מנותקת תאים על-ידי הסרת בעדינות תרבות בינונית, הוספת בעדינות בינוני טריים ללא סרום. חזור על שתי פעמים, או עד ביותר כעיגולים בצבע תאים הוסרו.
  3. הליך ניסיוני ואיסוף נתונים
    1. לקחת עד 4 תמונות ההפניה טיפול טרום שבמרכזה הפער גירוד כל טוב להשתמש במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוך שילוב מצלמת CCD. בחר תחומי עניין על ידי יישור הקצה של מיקרוסקופ שדה לצומת הסמוך של שריטות.
      הערה: בדרך כלל, תמונות נרכשים באמצעות הגדלה של 10 x וגודל התמונה 1,280 x 1,024 פיקסלים. בחירת אזורים ריבית כפי שתואר לעיל מסייע עבור איתור קל ונוח ואימות של עד 4 מידות לכל טוב.
    2. לאחר כל התמונות נרכשים, לייעד בארות הטיפול; חילופי המדיום ב הבארות בינונית טרייה הכולל טיפולים שנבחרו.
      הערה: לחלופין, כימיקלים או תרכובות אל תפריעי הומוגניות תרבות בינוני, טיפולים ניתן לקבל חיסון ישירות לתוך המדיום תרבות.
    3. דגירה לצלחת שרוט (37 ° C עם אווירה מבוקרת המכילה 5% CO2) עד התנאים תחת תצפית יד 90% פער מאפס הסגר. הימנע הסגר מלא.
      הערה: סגירת הפער הכולל יבטל אוסף התמונות שלאחר הטיפול התייחסות לתחומים שאינם לזיהוי, אין אפשרות להקים את ההפניה זמן עד לסגירת הפער. במקרה של תאים Mv1Lu או HaCaT, 16-19 h נדרשים להגיע למפגש 90%.
    4. לעצור את נדידת תאים על-ידי תיקון התאים; בעדינות להחליף המדיום תרבות ניסיוני 1 מ"ל של פורמלין 4% ב- PBS. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.
    5. לשטוף את התאים כדי להסיר עודפי פורמלין; בעדינות להחליף את הפתרון ב הבארות PBS טריים. חזור על פחות פעמיים.
      הערה: בשלב זה, לאחר איטום, צלחות שניתן לאחסן ב 4 ° C ללא הגבלת זמן.
    6. קח תמונות הפניה שלאחר הטיפול של כל טוב מאזורי ההפניה המקורית כבשו לאחר גירוד. השתמש באותו הציוד (מיקרוסקופ הפוכה ניגודיות שלב אופטי שילוב מצלמת CCD) התאמת הגדרות תמונה (הגדלה ו רזולוציה דיגיטלי/צפיפות).
      הערה: עבור תאים נודדים בנפרד, ממלא את הפער ללא תלות היווצרות של חזית קוהרנטית (למשל, תאים אנושיים של סרטן השד של מד א-MB-231), התמונות כמובן זמן עשוי לאפשר את החישוב של מהירויות העברה תא בודד.
  4. ניתוח תמונות, כימות של ההעברה
    1. באמצעות עיבוד תוכנה (לדוגמה, ImageJ) תמונה, להגדיר הפער מאפס הגבולות ולקבוע על פני פער מידות עד ארבע תמונות טיפול קדם. לרשום את הנתונים כמו "טיפול קדם הפער השטח" (PREGAP). חזור על הפעולות אותן לתמונות שלאחר הטיפול. לרשום את הנתונים כמו "gap שלאחר הטיפול השטח" (POSTGAP).
      1. פתחו את התמונה נרשם באמצעות ImageJ. בתפריט 'תמונה', להגדיר סוג תמונה 8 סיביות. בתפריט "תהליך", פתח את תפריט המשנה "מסננים" ו להחיל סינון "סטיה".
      2. תפריט 'תמונה', הזן "להתאים" את תפריט המשנה ואת סף הגדרת שחור-לבן (B & W), ודא "רקע כהה" לא נבחרה. בתפריט "תהליך", ללכת המשנה "בינארי" ובחר "מלא חורים".
      3. בתפריט "לנתח", בחרו "לקבוע מידות", להפעיל את "אזור". ואז לצייר את האזור מדיד בעקבות קו המתאר הקצה נודדים ובכך-שתוחם את הפער.
      4. בתפריט "לנתח", בחר "לנתח חלקיקים" והקלטה של "שטח" ערכים עבור השטח אזור מצוירות.
    2. להציג את ערכי השטח הכולל PREGAP ו- POSTGAP בגיליון לכמת ההעברה מוחלטת עבור כל ערכה של דוגמאות בודדות כהפרש של פער מידות משטח: − PREGAP POSTGAP [יחידות שרירותי]. בנוסף, לנרמל מוחלט העברת הנתונים של כל תנאי כדי לשלוט דגימות: (לטעום / לשלוט) * 100 [%].
      הערה: עבור תאים נודדים בנפרד, ממלא את הפער ללא תלות היווצרות של חזית קוהרנטית, (למשל, תאים אנושיים של סרטן השד של מד א-MB-231), ההעברה מוחלט יכול להיות מחושב על ידי ספירת תאים פולשים מרכזי להתפשט גם ב הפקד או דגימות שטופלו.
    3. מגרש כימות פלטי (ראה איור 1). לבצע ניתוח סטטיסטי במידת הצורך.
שקול מבחן t של סטודנט בעת השוואת שני תנאים או השונות לבדיקת מספר גדול יותר של מצבים.

2. מלאכותי ההעברה Assay קבלה ללימודי טופוגרפיים

  1. הכנת טפט תא
    1. עבודה בתנאים סטריליים, מקום שכבה אחת של סטיריליים coverslips סיבוב צלחות ריקות תרבות עד פני השטח של הלוח מכוסה לגמרי.
      הערה: עד 12 ו- 33 coverslips להתאים 5 ס מ וצלחות בקוטר 10 ס מ, בהתאמה.
    2. על הצלחת תרבות בעדינות זרע אמצעי אחסון נאותים של תאים על ריכוז המאפשר זרימה 100% לאחר 2-3 ימים. לוודא ש-coverslip לא חופף coverslips שכנים ולמנוע coverslips צף על ידי הפעלת לחץ עדין עם טיפ micropipette סטרילי. רענן המדיום כל 24-48 שעות.
      הערה: בכל שורה תא חייב להיות לבדיקה ביסודיות כדי לקבוע ריכוז התא ואת התזמון הנדרש כדי להגיע confluency מלא. בדרך כלל עבור תאים Mv1Lu או HaCaT, 2-3 x 106 או 2.5-4 x 106 תאים/10 ס מ קוטר צלחת, בהתאמה, הם נזרע. עבור לוחות קטנים יותר, מספרי הטלפון הנייד חייב זה מדע פשוט.
    3. לאחר התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיום בתוספת-סרום והחלף בינונית ללא סרום טריים. שמור את התאים ללא סרום בינונית במשך 24 שעות לפני הפציעה מלאכותיים מתבצע.
      הערה: תאים Mv1Lu או HaCaT אין דרישות מיוחדות המצע; עם זאת, עבור שורות תאים רגישים של ניתוק באופן ספונטני בתנאים ללא סרום, ציפוי מראש של המשטח תרבות באמצעות פתרון פולי-L-ליזין יש לשקול10.
  2. טפט ופצעו
    1. באמצעות פינצטה סטרילי, להעביר בעדינות coverslip צלחת 10 ס מ נקי המכיל בינונית ללא סרום טריים. למנוע פגיעה של טפט על-ידי החזקת את coverslip בפריפריה עם פינצטה. הימנע לחץ רב מדי אשר עלולה לגרום coverslip שבירה.
    2. ליצור פצעים מלאכותי על-ידי גרירת תער סטיריליים בקו רוחבי של מרכז coverslips. גרור 3-4 מ מ מאחור וושוב, על מנת להסיר לחלוטין את רצועת טפט המרכזית. ודא שאין שאריות תאים נשאר צמוד לקצוות פצועים.
      הערה: על קוטר 12-מ מ מסביב coverslip, החתך מתבצע בדלפק אמצע של coverslip. הקפד להשאיר פס של תאים מול החזית הראשית גדול מספיק (לפחות 2 מ מ רחב) כדי למנוע הטיה של coverslip בשלבים הבאים.
    3. העבר את הפצועים coverslips תאים פונה כלפי מעלה, למדיום נקי 6-ובכן צלחת המכיל לפחות 2 מ"ל טריים ללא סרום. מתאים ל-4 פצועים coverslips/טוב.
    4. בעדינות לשטוף פעמיים שימוש במוצרים טריים ללא סרום בינוני כדי להסיר תאים מנותקת.
  3. ניתוח ניסיוני ודגימה
    1. בעדינות חילופי המדיום ב הבארות בינונית טרייה הכולל טיפולים שנבחרו.
      הערה: לחלופין, כימיקלים או תרכובות אל תפריעי הומוגניות תרבות בינוני, טיפולים ניתן לקבל חיסון ישירות לתוך המדיום תרבות. . המשך בזהירות כדי למנוע כל ניתוק התא פוטנציאליים.
    2. לשמור את הצלחת בתוך חממה התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) העיתוי ניסיוני הרצוי.
    3. לעצור את נדידת תאים על-ידי תיקון התאים; בעדינות להחליף המדיום תרבות ניסיוני 1 מ"ל של פורמלין 4% ב- PBS. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.
      הערה: זמן הקורס ניסויים, להסיר את הדגימות לצלחת תרבות ותקן אותן בצלחת נפרדת כדי להימנע האדים פורמלין להשפיע על התנאים ניסיוני אחרים, שוטף.
    4. לשטוף את התאים כדי להסיר עודפי פורמלין; בעדינות להחליף את הפתרון ב הבארות PBS טריים. חזור על פחות פעמיים.
      הערה: בשלב זה, לאחר איטום, צלחות שניתן לאחסן ב 4 ° C ללא הגבלת זמן.
  4. Immunofluorescence (אם) וניתוח טופולוגי
    1. לבצע אם מכתים, הדמיה על coverslips בודדים כפי שתואר במקומות אחרים3,4,11.
      1. Permeabilize 10 דקות במועט coverslips בפתרון טריטון X-100 0.3% ב- PBS.
      2. בלוק למשך 30 דקות באמצעות חסימת הפתרון הבאים: 0.3% אלבומין שור; סרום שור עוברית 10%; חלב רזה 5%; 0.3 פתרון טריטון X-100% ב- PBS.
        הערה: חסימת פתרון ללא החלב ניתן להכין מראש, המאוחסנים ב-20 ° C.
      3. תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר בתוך תא לחה, עם נוגדן ראשוני מדולל בפתרון חסימה ללא חלב. מקם את coverslips הפוך בפתרון נוגדן 15 µL כדי להבטיח חלוקה נכונה.
        הערה: דילול עבודה נוגדן משתנה, תלוי הנוגדן בשימוש. כך למשל, נוגדן anti-c-יוני ארנב דורש לדילול 1/100.
      4. רחץ שלוש פעמים על ידי שילוב של coverslips בפתרון טריטון X-100 0.1% בתוך ב- PBS.
      5. דגירה על coverslips ב נוגדנים משניים מדולל במאגר חלב נטול החוסמים למשך 30 דקות.
        הערה: דילול עבודה נוגדן משתנה, תלוי הנוגדן בשימוש. לדוגמה, העז-נגד-הארנב (488) מחייב לדילול 1/400 רזולוציה מיטבית. ריאגנטים תיוג אחרים כגון phalloidin ו- Hoechst 33258 ניתן להוסיף למאגר הדגירה בשלב זה.
      6. רחץ שלוש פעמים על ידי שילוב של coverslips בפתרון טריטון X-100 0.1% ב- PBS.
      7. הר coverslips על ההפוכות ב- 10 µL הרכבה מדיה טיפה (למשל, Vectashield) מניחים על שקופית מיקרוסקופ. להשאיר את השקופיות בחשיכה בטמפרטורת החדר למשך הלילה עבור הרכבה בינונית התקשות. לאחר מכן, לאחסן ב 4 ° C בחושך ללא הגבלת זמן.
    2. להשיג epifluorescence או מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות של שינויים מבניים המתרחשים בקצה הקדמי נודדים.
      הערה: מחקרים טופולוגי יכול להתבצע על ידי ריצוף תמונות מהחזית העברת טפט הפנימי. מחקרים כמותיים למחצה אפשריים על ידי ניתוח תוכנה המבוססת על עוצמות קרינה פלואורסצנטית מקומיים.

תוצאות

הפצע מלאכותי Assay מאפס עבור מחקרים כמותיים: הערכת גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) קידום של ההעברה:

EGF היא משרן ידועים של התפשטות תאים אפיתל, הגירה, ובכך פקד חיובי לכימות תנועת הגירה קידום. Monolayers תא Mv1Lu, HaCaT שימשו מבחני מאפס הפצע, טיפול קדם תמונות התקב?...

Discussion

על העור או קרום רירי השיבושים, הפונקציה מכשול משוחזר על ידי הפעולות של סוגי תאים רבים, לרבות fibroblasts תאים אפיתל ואת המערכת החיסונית. בצמדים, תאים אלו עוברים מתחם פרוצס מעורבים אפופטוזיס, התפשטות, בידול, חשוב, פיברובלסט ואפיתל תא ההעברה, אשר הוא מנגנון האולטימטיבי האחראי על שיקום של הרקמה שיב?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

אנחנו רוצים לתת תודות לחברים ישנים יותר של המעבדה המסייעים לשפר, לשכלל את הטכניקות האלו למצבו בפועל: ד ר סיליה מרטינז-Mora; ד ר אנה Mrowiec, ד ר קטלינה רואיז-Cañada, ד"ר אנטוניה אלקאראז-גארסיה.... . אנחנו חבים החולים Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca לתמיכה בחריפות את הפיתוח של טכניקות אלה. גם אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III, Fondo דה Investigaciones Sanitarias. תוכנית Estatal אני + D + אני ואת אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי-Subdirección גנרל דה Evaluación y מטאליסט de la Investigación (מענק מס: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos פדר "Una בדרך זו דה ש אירופה". אנו מודים גם למד דה מורסיה, IMIB-Arrixaca ו- FFIS עבור מנהלי תמיכה וסיוע. לבסוף, אנחנו רוצים לתת תודה ד ר איזבל Martínez-Argudo, את Facultad עצמה Ambientales y Bioquímica, קמפוס Tecnológico de la Fábrica דה ארמאס, למד קסטיליה לה מנצ'ה, טולדו על תמיכתם סוג של ויתור מרצון מיוחדת וההתערבות והמעבדה ביוטכנולוגיה לעשות אפשרי החלק מצולם של מאמר זה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FranceL0102-500Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)LonzaBE12 -662FOptional 10 % FBS supplement
L-GlutamineLonzaBE17-605EUse at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USADE17603A
Trypsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT4049Dilute as appropriate
Poly-L-LysineSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)Gibco by Life Technologies14200-067Dilute to 1x
24-well culture platesBD FALCON//SARSTED734-0020
6-well culture platesSARSTEDT83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAE9644Used 10 ng/mL
Round cover glassMENZEL-GLÄSERMENZCB00120RA020SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743Martor (through VWR)MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tipsVWR732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tipsVWR732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscopeMotic SpainMoticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscopeZEISS Microimaging, GermanyLSM 510 META
10 cm Culture dishBD FALCON353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibodySanta Cruz Biotechnologysc-1694Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488InvitrogenA11008Used 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA14530Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)InvitrogenA12381Used 1:100
Bovine Serum AlbuminSanta Cruz BiotechnologySC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT9284
Skim milkBD DIFCO232100
ImageJNational Institutes of Health, USARelease 1.50i
Zen LSM 510 image processing softwareZEISS Microimaging, GermanyRelease 5.0 SP 1.1

References

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
  3. Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
  4. Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
  5. Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
  6. Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
  7. Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
  8. Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
  9. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
  10. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
  11. Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
  12. Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
  13. Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
  14. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  15. Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
  16. Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
  17. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  18. Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
  19. Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
  20. Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
  21. Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
  22. Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
  23. Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
  24. Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131keratinocytes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved