זיהוי של OTX1 ו- OTX2 כמו שני סמנים מולקולריים אפשריים עבור קרצינומה Sinonasal ואת חוש הריח נוירובלסטומה

Summary

גנים Homeobox גנים הם גנים תקינה קשורה לעיתים קרובות עם גידולים האורגניזמים למבוגרים. . חקרנו שלהם ביטוי השוואתית מאת immunohistochemical וניתוח בזמן אמת PCR, mucosae האף נורמלי, דלקתיות, sinonasal neoplasms על מנת להשתמש בהם בתור מטרות אפשריות האבחון והטיפול.

Abstract

OTX גנים homeobox (HB) הגנים באים לידי ביטוי במהלך מורפוגנזה עובריים ובמהלך ההתפתחות של האפיתל חוש הריח אורגניזמים למבוגרים. מוטציות המתרחשים הגנים האלה קשורים לעיתים קרובות tumorigenesis-אנוש. אין נתונים זמינים היום לגבי הקשר האפשרי בין גנים OTX לבין גידולים של חלל האף. מטרת עבודה זו היא להבין אם OTX1 ו- OTX2 יכול להיחשב סמנים מולקולריים להתפתחות גידולים באף. בחרנו אדנוקרצינומות אפיים ואת sinonasal לחקור את הביטוי של הגנים OTX1 ו- OTX2 דרך immunohistochemical וניתוחים PCR בזמן אמת. הן OTX1 והן OTX2 נעדרו כל הדגימות של sinonasal במעיים מסוג אדנוקרצינומה (ITACs). OTX1 mRNA זוהה רק ב- Non-מעיים מסוג אדנוקרצינומה (NITACs) בעוד OTX2 mRNA בא לידי ביטוי רק ב חוש הריח נוירובלסטומה (תוספות). הראו כי בביטוי הגן דיפרנציאלי עבור גנים הן OTX1 והן OTX2 עשוי להיות סמן מולקולרי שימושי כדי להבחין בין סוגים שונים של גידולים sinonasal.

Introduction

OTX HB גנים הם homologue חוליות של גנים orthodenticle דרוזופילה (otd) הם קידוד עבור גורמי שעתוק, אשר באים לידי ביטוי בדרך כלל במהלך מורפוגנזה עובריים, אך הם יכולים להתבטא גם בתוך האורגניזם למבוגרים עם פונקציות שונות . במהלך התפתחות עובריים הם שולטים המפרט של זהות תא תאית התמיינות, המיקום של axis¹ הגוף. משפחת OTX כולל הגנים OTX1 ו- OTX2 המציגים פונקציות שונות. OTX1 מעורב במוח ופיתוח איבר חישה. האורגניזם למבוגרים, זה מתבטא אברי החישה, הוא עיבד ברמות נמוכות. באונה הקדמי של בלוטת יותרת המוח²; זה גם ממלא תפקיד hematopoiesis, באות לידי ביטוי ב hematopoietic pluripotent וקדמון תאים³. OTX2 עוסקת בפיתוח של הראש rostral ואת מעשיה מתורגמים חלבונים כמו מורפוגן כי זה יוצר מדרג דרך אילו גנים אחרים מופעל או מודחקים בצורה-עתיים, ובכך לתרום תא התפשטות ובידול. בתוך האורגניזם למבוגרים, OTX2 נמצא באופן בלעדי מקלעת דמית העין מקלעת ובלוטת האיצטרובל⁴.

מוטציות בגנים OTX קשורים לעיתים קרובות המראה של פגמים מולדים, סומאטית או מטבוליות אנושי. רווח או הפסד מוטציות בגנים OTX יכולים לקדם את tumorigenesis אם הם לא יכולים לשלוט כראוי צמיחה ו/או בידול הסלולר⁵. לוקמיה, לימפומה גם כן כמו רבים גידולים מוצקים (למשל, medulloblastomas⁶, שאינה הודג'קין לימפומה אגרסיבית², השד קרצינומה⁷, סרטן המעי הגס⁸ו רטינובלסטומה⁹), ושוחררו ביטוי של גנים HB OTX הוא מתועד היטב¹⁰. בנוסף, מוטציות OTX2 הוכחו במקרים של anophthalmia ו- microphtalmia¹¹ בשל תפקיד מכריע עבור גן זה בבקרה על התפתחות העין.

בהקשר של neoplasms מוצק, גילוי סמני פנוטיפי המולקולריים הוא אתגר חשוב עבור אבחון, מיון, טיפול של מספר סוגים של הגידול¹¹, כולל כאלו שמוצאן חלל האף והסינוסים paranasal הסינוסים. למעשה, למרות זאת באזורים אלה לכבוש רק אנטומי רווח צנוע, אפיתל הרירית, בלוטות, רקמות רכות, עצם, סחוס או עצבית/neuroectodermal, תאים hematolymphoid וניתן לעיתים קרובות האתר עבור המקור של מורכב ושונה בהיסטולוגיה קבוצות של גידולים. סוגים שונים של neoplasms הכוללת מערכת sinonasal מציגים מגוון רחב של תכונות להתגבר על מה נראה בדרך כלל במערכת העיכול העליונה aerodigestive או אפילו במהלך רוב חלקי הגוף¹². Sinonasal ממאירות נדירים ולהציג שכיחות השנתי של תושבים כוללות ברחבי העולם, אז זה מונע מחקרים לגבי המסלולים המעורבים את tumorigenesis ובדיקות של אסטרטגיות טיפול אלטרנטיבי. למרות זאת, ההתקדמות הדמיה טכניקות, גישות ניתוח, הקרנות השתפרו ניהול קליני מסרטן sinonasal. יתר על כן, הפיתוח של שורות תאים, כמו גם מודלים בעלי חיים ושל סרטן פרופילים גנטיים מהווים כיום את הבסיס העתידי טיפולים נגד סרטן ממוקדים¹³. נכון להיום, ישנם דיווחים לא לגבי ביטוי OTX1 ו/או OTX2 neoplasms של חלל האף, הסינוסים paranasal, לוע האף. מאז בעבר הבחנו כי OTX1 ו- OTX2 מעורבים בסרטן השד⁷, תהינו אם הגנים האלה יכולים להיות נוכחים לא רק נורמלי רירית האף, אבל גם גידולים בתוך של חלל האף. כדי להשיג מטרה זו שאנו המתקבל המחלקה של פתולוגיה של "Ospedale di וטנים" בדגימות וארזה (varese) של רירית רגיל ו אדנוקרצינומה אפיים ואת sinonasal שנגבו משנת 1985 עד 2012, המסווגים על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO) סיווג של הראש, הצוואר גידולים. בחרנו לנתח אותם באמצעות ניתוחים בזמן אמת PCR ואימונוהיסטוכימיה, הערכנו ביטוי OTX1 ו- OTX2 כדי לקבוע אם הם יכולים להיחשב סמנים מולקולריים עבור סוגים אלה של גידולים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל המחקרים בוצעו לפי ההכרזה של הלסינקי (1975) עם כתב הסכמה מדעת, אושרה על ידי הוועדה האתית של האוניברסיטה של Insubria ב וארזה.

1. אוסף של הדגימות

1. לאסוף ולחלק כל הדגימות האנושי Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) לקבוצות שונות על פי סיווג WHO של הראש, הצוואר גידולים¹⁴.
   הערה: כאן השתמשנו בדגימות הבאות: רירית sinonasal נורמלי כפקד (10 דוגמאות); פפילומה הפוכה (IP, קוד ICD-O 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O קוד 8144/3, דגימות 32); NITAC (ICD-O קוד 8140/3, דגימות 12); בצורת בלוטה פיברוזיס קרצינומה (ACC, קוד ICD-O 8200/3); אדנומה pleomorphic (PA, קוד ICD-O 8941/3); על (ICD-O קוד 9522/3, דגימות 13); גרוע הבדיל קרצינומה נוירואנדוקרינים (PDNEC, קוד ICD-O 8041/3, דגימות 19); גידולים נוירואנדוקריניים (נטו, ICD-O קוד 8041/3).

2. נוגדנים

1. Deparaffinization, התייבשות של מקטעים
   1. מחממים את השקופיות לדוגמה בתנור ב 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, נתרענן-3 מיקרומטר עבה FFPE חלקים באמצעות סדרות אלכוהול למים.
   2. בקצרה לשטוף את השקופיות של קסילן למשך 10 דקות, חזור על שלב זה; לשטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב- 100% אלכוהול, חזור על שלב זה באמצעות אלכוהול 95%, 85% ו 75% באופן סדרתי. יש לשטוף את השקופיות עבור 5 דקות במים מזוקקים.
2. חסימת הפעילות אנדוגני
   1. לחסום את פעילות אנדוגני על-ידי הצבת את השקופיות ב- 3% מימית חמצן למשך 12 דקות.
3. אחזור אנטיגן
   1. לבצע אחזור אנטיגן על ידי טיפול עם 10 מ מ מאגר ציטראט (pH 6) למשך 10 דקות בטיפול מיקרוגל.
4. הדגירה עם נוגדן ראשוני
   1. לשטוף את הסעיפים במאגר TBS (pH 7.4), ולאחר מכן להוסיף פתרון חסימה למשך 10 דקות.
   2. לשטוף את הסעיפים במאגר TBS (pH 7.4), ולאחר מכן להוסיף 0.2% X טריטון.
   3. דגירה בין לילה ב 4 ° C עם עז נגד OTX2 נוגדנים מדולל מטריים.
5. הדגירה עם נוגדנים משניים
   1. דגירה הסעיפים לשעה בטמפרטורת החדר עם biotinylated הארנב עז נגד נוגדנים משניים מדולל 1:200 ואחריו ABC-peroxidase קומפלקס (ראה טבלאות של חומרים).
6. לפתח את immunoreaction
   1. לפתח את immunoreaction באמצעות 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride, counterstain הגרעינים עם Hematoxylin האריס.
7. הרכבה והדמיה
   1. מייבשים את המקטעים באמצעות חרמש אלכוהול-סרגל ולהבהיר אותן באמצעות חומר ניקוי ממוצא terpene (ראה טבלה של חומרים). להטביע מקטעים במדיום הרכבה, במקום הסעיפים על שקופית מיקרוסקופ, ולבחון הסעיפים באמצעות מיקרוסקופ אופטי.

3. RNA החילוץ ולא הפוכה-תמלול

1. החילוץ-RNA
   1. לחלץ RNA הסעיפים על-ידי ביצוע השלב הראשון של פרוטוקול immunoprecipitation (ראו סעיף 2.1) ולשמור את השקופיות במים מזוקקים. חפיפה הסעיפים מוכתם עם המקביל hematoxylin אאוזין צבעונית מקטעים כדי לזהות קטעים מעניינים.
   2. לבצע את החילוץ RNA באמצעות ערכת חילוץ RNA מסחרי עבור דגימות FFPE (ראה טבלה של חומרים) והוראות היצרן הבא.
2. הפוך-שעתוק RNA
   1. להשתמש ערכת מסחרי לתעתק. רטרו-RNA לתוך cDNA (ראה טבלה של חומרים) בעקבות הפרוטוקול. רטרו-לתעתק לפחות 1000 ננוגרם של RNA הכולל כדי לבצע ניתוח מספר.

4. בזמן אמת PCR וניתוח נתונים

1. PCR בזמן אמת
   1. לבצע ניתוחים PCR בזמן אמת כמותית (לרביעיית-PCR) עם טכנולוגיה מבוססת על בדיקה (ראה טבלה של חומרים) ו הצנטרפוגה תרמי של.
2. הכנת המיקס תגובת ה-PCR
   1. להכין את תערובת התגובה PCR באמצעות µL 12.5 של מיקס מאסטר המבוסס על בדיקה, רגשים 1.25 µL כל OTX1, OTX2 ו ACTB (ראה טבלה של חומרים), 50 ng של cDNA, ונטולת נוקלאז מים עד 25 µL של הנפח הכולל.
   2. לבצע את כל התגובות שהפקידים באמצעות הגן ACTB של הפקד אנדוגני לנרמל את רמות ביטוי גנים.
   3. Centrifuge את הצלחת ב x 1,109 g למשך 3 דקות ולאחסן את הצלחת מוגן מפני אור ב 4 ° C עד הניסוי.
3. הגדרת הצנטרפוגה תרמי
   1. סט הפרופיל הצנטרפוגה תרמי עם התחלה לוהטת הראשונית מחזור ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו- 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s ומעגל סופי ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.
4. ניתוחים ברמה של ביטוי גנים
   1. לנרמל את רמות ביטוי גנים באמצעות השיטה הסף (ΔCt) מחזור השוואתי באמצעות הגן ACTB של הפקד אנדוגני.
   2. הערכת רמות ביטוי גנים בשיטת 2^-ΔCt , להתוות את התוצאות.
5. ניתוחים סטטיסטיים
   1. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות הסטודנט t-Test, בהתחשב תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית עם 0.05 < p .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ברירית נורמלי הבחנו חזקה ואחידה תגובתיות גרעיני עבור גנים OTX האפיתל הנשימה-סוג pseudostratified ciliated והן submucosal הבלוטות התאים (איור 1 א'). מצאנו את הביטוי גרעיני עבור OTX1 כל NITACs דגימות (איור 1B), בעוד מעט או נעדר immunoreactivity הודגשה ב- ITACs (איור 1C

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקר זה מראה בפעם הראשונה זה, המבוסס על רמות ה-mRNA, הגנים HB OTX1 ו- OTX2 באים לידי ביטוי רירית sinonasal רגיל ו בלוטות submucosal, פוליפים דלקתיים, sinonasal Schneiderian papillomas ולאחר שונים של אפיתל, neuroectodermal neoplasms, לרבות קרצינומות קשקש, sinonasal-מעיים מסוג אדנוקרצינומה, גידולים מסוג בלוטת הרוק, neoplasms נוירואנדוקריניים הרח?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799