ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

Summary

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

Abstract

Microfluidic טכנולוגיה מתגבר על רבים מן המגבלות לשיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה. שלא כמו שיטות בצובר-תרבות, הוא מציע רזולוציית תא בודד והתבוננות ארוכה פעמים המתפרסות על-פני מאות דורות; בניגוד agarose המבוסס על דירת מיקרוסקופ, יש תנאי הגידול אחיד זה יכול להיות נשלט בחוזקה. כי זרימה רצופה של מדיום הגידול מבודד התאים במכשיר microfluidic של וריאציות לא צפוי בסביבה כימית מקומיות הנגרמת על ידי צמיחת תאים, חילוף החומרים, אותנטי שינויים בביטוי הגנים צמיחת תאים בתגובה גירויים מסוימים יכול להיות שנצפו בביטחון רב יותר. Bacillus subtilis משמש כאן כמו זן חיידקי דגם להפגין מכונה"אמא"-הקלד שיטה לניתוח הסלולר. אנו מראים כיצד לבנות לשרברב מכשיר microfluidic, לטעון אותו עם תאים, ליזום הדמיה מיקרוסקופיים ואני לחשוף תאים לגירוי על ידי מיתוג של מדיום הגידול אחד למשנהו. כתבת תגובה ללחץ משמש כדוגמה כדי לחשוף את סוג הנתונים שניתן להשיג על ידי שיטה זו. בקצרה גם נדון בהמשך יישומים של שיטה זו עבור סוגים אחרים של ניסויים, כגון ניתוח במחקרים על הנבגה חיידקי.

Introduction

אחד המאפיינים הבולטים ביותר של החיים על פני כדור הארץ הוא שלה חוסן נפשי גדול ומגוון. מטרה מרכזית של הביולוגיה המולקולרית היא להבין את ההיגיון שבו תאים להשתמש גנים, חלבונים כדי להגדיל את הצמיחה ואת כושר תחת מגוון רחב של תנאים סביבתיים. כדי להשיג מטרה זו, מדענים להיות מסוגל להתבונן בביטחון כמה תאים בודדים לגדול, לחלק ולבטא את הגנים שלהם תחת מערכת נתונה של תנאים, וציין כיצד התאים מגיבים לשינויים הבאים בסביבתם. עם זאת, מסורתיים שיטות אנליטיות במיקרוביולוגיה יש מגבלות טכניות המשפיעות על סוגי שאלות שיכול הליות ממוען. לדוגמה, בצובר מבוססת תרבות הניתוחים היה שימושי מאוד במשך השנים, אך הם מציעים רק הנתונים ברמת האוכלוסייה מטשטשים את משמעות וריאציות לתא או ההתנהגויות של אוכלוסיות משנה קטנים יותר של תאים במכלל האוכלוסייה. תא בודד ניתוחים של חיידקים החיים מבוסס על מיקרוסקופ אור לחשוף התנהגות תא בודד אבל גם מוגבלים מבחינה טכנית. חיידקים הם בדרך כלל ותשמרו על רפידות agarose שמכיל מדיום הגידול, אבל התא גדילה וחלוקה קהל התצוגה מיקרוסקופיים, מכלה את החומרים המזינים זמין לאחר כמה מחזורים תא, משמעותית להגביל את התצפית זמן^{1, 2}. יתר על כן, דלדול המקומי של חומרים מזינים, הצטברות בו-זמני של תוצרי לוואי מטבוליים עקב צמיחת תאים משתנים ללא הרף הסביבה הצמיחה המקומית תא בדרכים שקשה למדוד או לנבא. שינויים סביבתיים כאלה באמצעות רפידות agarose להוות אתגר ללימודים של מצב יציב התנהגויות או הסלולר התגובות שינויים ספציפיים צמיחה תנאי³.

טכנולוגיית Microfluidic, שבו מדיום נוזלי מוזרם באופן רציף באמצעות התקנים microfabricated, מציעה פתרון מגבלות הניסוי הקלאסי. מכשיר microfluidic יכול לשמור תאים בודדים במצב מתאים לחיות תאים במיקרוסקופ בזמן הזרימה של מדיום הגידול באופן קבוע מספק תאים עם חומרים מזינים טריים, ייעלם תוצרי לוואי מטבוליים ותאים עודף, ובכך יוצר גידול מאוד אחידה סביבה. בתנאים צמיחה מתמדת, התנהגויות התא יכול להיות שנצפו במנותק מן ההשפעה של גורמים סביבתיים, המתיר נוף ללא הפרעה של ההיגיון הפנימי של תאים. זרימת נוזל מונע מההתקן microfluidic הופך צפוף עם תאים, התבוננות שושלות תא בודד עבור עשרות או מאות דורות הופך להיות אפשרי^4,5. בזמנים כאלה התבוננות ארוכה היתר זיהוי התנהגויות אחרת לגילוי תאים לטווח ארוך או נדירים. לבסוף, ההרכב של המדיום זה הזורם דרך המכשיר יכול להשתנות בכל וויל, ומאפשר תאים שחלים באיזו תחילתה של הלחץ או מבוא או הסרה של תרכובת מסוימת.

מיקרופלואידיקה נהנתה כבר מספר יישומים חשובים. למשל, זה נעשה שימוש ברקמות, איברים או התקנים הגוף-על-שבב, שבה מספר סוגי תאים אנושיים הם תרבותי משותף כדי לדמות של ויוו תנאי⁶; לצורך המחקר של נמטודות בתנועת סביבות microstructured⁷; לבדוק אינטראקציות בין biofilms חיידקי (למשל, ⁸); כדי להפוך את עטיפת מניפולציה של כרכים קטנים של תאים או כימיקלים (למשל, ⁹). Microfluidic התקנים הפכו יותר ויותר פופולרי גם בתחום מיקרוביולוגיה (עבור ביקורות מצוינות, ראה ¹⁰ ו ^-11), במיוחד כמו הפיזי שלהם, תכונות הזרימה גם בהתאמה לנישות מיקרוביאלית טבעית¹². למשל, מיקרופלואידיקה לאחרונה ננקטה על ידי מיקרוביולוגים למטרות כאלה כמו דיוק מדידה תא גדילה וחלוקה^13,14,15, ניתוח תנועה הפתוגן¹⁶, ניטור quorum חישה¹⁷ ו מעברים פיזיולוגיים¹⁸, וספירת החלבונים¹⁹, בין דוגמאות רבות אחרות. השיטה המוצגת כאן היא תוכננה במיוחד עבור הניתוח של שושלות תא החיידק בודד יותר מאשר שילובים של זנים או מינים. המכשיר microfluidic המודגמות כאן מנצל וריאציה אחת של "אמא המכונה" עיצוב⁴, שבו תאים גדלים קובץ יחיד בתוך תעלה microfluidic עם קצה אחד סגור, קצה פתוח אחד; צמיחת תאים וחלוקה דוחף תאים רומא יוצא את הקצה הפתוח לתוך זרימת נוזלים. הבדיקות שלנו בדרך כלל מתמקדים רק התא "אמא" מוגבל בקצה הסגור של התעלה. אנו רואים בשיטה זו כמו קידום מעל הקודם אור מבוסס מיקרוסקופיה תא בודד בשיטות אנליטיות, כגון תא הנייח על רפידות agarose. בעוד B. subtilis משמש כמודל כאן, השיטה ישימה גם למינים אחרים חיידקי (Escherichia coli הוא מודל נפוץ נוסף; מינים מסוימים עם תאים שונים הגדלים או מורפולוגיות עשויים לדרוש הזיוף של מכשירים חדשים עם ממדים שונים). השימוש של כתבים פלורסנט כדי לסמן את התאים וכדי להמחיש שינויים בביטוי הגנים מחייב שימוש המינים גנטית צייתן; עם זאת, ניתוח של צמיחת תאים, מורפולוגיה אפשריים גם ללא סמנים פלורסנט.

בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל התהליך של בדיית המאסטר סיליקון באמצעות פוטוליתוגרפיה, אשר כבר מתואר בהרחבה במקום אחר⁵; ניתן בקלות מיקור חוץ של מתקני מיקרו-מלאכותית גם מאסטרים. היא כוללת המכייר של מכשיר PDMS מהמאסטר סיליקון מוקשח; מליטה להתקן חתיכת זכוכית מכסה; הרכבת microfluidic כניסת ואינסטלציה outlet, קמצוץ כולל שסתומים להתיר מיתוג בינונית; passivating המכשיר, הכנת תאים חיידקיים, טעינת המכשיר עם תאים חיידקיים; חיבור הצנרת להתקן, equilibrating התאים; טעינת המכשיר על גבי מיקרוסקופ פלורסצנטיות עבור הדמיה. כי ייבוא תמונות שונות רבות ועיבוד תוכנה ניתן להשתמש בכלים כדי להמחיש ולנתח נתונים שונים של עניין^4,5, תמונות לדוגמה מוצגים, אך שיטות לכידת התמונה לא נכללות פרוטוקול זה.

Protocol

1. PDMS התקן הליהוק

1. בסביבה ללא אבק, לערבב פולימר PDMS וסוכן ריפוי ביחס של 10:1, דגה תחת ואקום לפחות 10 דקות.
2. מיקום בסיס סיליקון (או עותק משוכפל אפוקסי או פוליאוריטן הימנו) על פיסת נייר אלומיניום רצופה בצלחת פטרי פוליסטירן. שופכים התערובת PDMS degassed האדון עד לעומק של 5 מ מ. דגה לצלחת פטרי במשך לפחות 10 דקות שימוש זרם עדין של אוויר לשבור בועות משטח.
   הערה: הממדים של המכשיר משני נדבכים בשימוש ניתנים הנלווה CAD קובץ⁵ (ראה 1 קובץ משלים). מאסטר משוכפל פלסטיק יכול לעוף חלקית במהלך degassing; אם הדבר יתרחש, לוחץ את העותק המשוכפל עם המוליך פלסטיק נקי.
3. תרופה PDMS לפחות שעה בתנור ב 60 מעלות צלזיוס, להתקרר לטמפרטורת החדר. הסר את רדיד אלומיניום המכיל את PDMS מאסטר, ריפא מ לצלחת פטרי. לקלף בזהירות רדיד האלומיניום מן הצד האחורי של תבנית הבסיס ולאחר מכן מקלפים בזהירות את PDMS של המאסטר.
   הערה: לחלופין, PDMS יכול להירפא בלילה בטמפרטורת החדר. השבריריות היחסי של מאסטר סיליקון-וופל אפשר להתגבר באמצעות דבק אפוקסי להתחבר לצמיתות את לחם הקודש כדי בגודל 1/16 אינץ-דיסק אלומיניום עבה באותו גודל כמו לחם הקודש.
4. כפי רקיק כוללים בדרך כלל מספר התקנים microfluidic עם מידות מעט שונות (ראה 1 קובץ משלים), חותכים במכשיר אחד כדי לשנות את גודל באמצעות אזמל נקייה, חדה.
   הערה: עבור שגרת עבודה B. subtilis , להשתמש בהתקנים עם תעלות תא 1.0-מיקרומטר-רחב, אשר מסומנות עם C או F בקובץ ה-CAD הנלווה.

2. מכשיר ניקוב ו מליטה

1. המקום חתיכה של office שקוף קלטת (ראה טבלה של חומרים) על הצד עם דוגמה של המכשיר כדי לשפר את התצוגה של התכונות בדוגמת. היציאות כניסת ולשקע מזוהים כאזורי מעגלית בקצוות מנוגדים של הערוצים fluidic גלוי (איור 1). כדי לשפר את הראות שלהם בעת ניקוב חורים המכשיר עבור כניסת ולשקע הפינים, לסמן את פתחי הכניסה ועודפים עם נקודות באמצעות סמן שקצהו פיין.
   הערה: כדי להבטיח כי כניסת ולשקע הפינים אינם צפופים, כל ערוץ זה אגרוף, החל הערוץ מתחת מציין אלפביתי עבור ההתקן.
2. הפוך את ההתקן PDMS כך הצד בדוגמת היא למטה, אגרוף דרך המכשיר הנקודות שסומנו באמצעות ניקוב של ביופסיה 0.75 מ מ; למחוק את punchings.
   הערה: המכשירים מנוקבים עם הצד בדוגמת למטה כי החור שנוצר על ידי מנגנון הניקוב ביופסיה היא בדרך כלל מעט הבהבה איפה המכה נכנס הפולימר. ניקוב המכשיר בכיוון ההפוך מבטיח כי החור בצד בדוגמת יש גבול חד.
3. שימוש של stereomicroscope, ודא כי חורים מנוקבים חפיפה עם האזורים כניסת ו עודפים של המכשיר. להשתמש עם פינצטה שקצהו הקנס כדי להסיר כל שברי שאינם שייכים PDMS מכל החורים מנוקב.
4. השתמש דבק להסרת אבק משני הצדדים של המכשיר ואת המקום לתוך צלחת פטרי פוליסטירן נקי. להכין 22 מ"מ x 40 מ"מ חיפוי זכוכית על-ידי להרטיב עם 100% אלכוהול איזופרופיל ומשפשף עם מגבון חדר נקי; יבש עם זרם אוויר נטול אבק או חנקן.
5. המקום הצד תכונה מנוקב של המכשיר PDMS יחד עם כיסוי זכוכית נקי לתוך פלזמה חמצן נקי.
   1. פלזמה-החטיף ההתקן עם ההגדרות הבאות: אבק, 70 mTorr; O לחץ₂ , 200 mTorr; משך זמן, 15 s; כוח, 30 W. מיד בתום תקופת הטיפול פלזמה, הסר את ההתקן ואת כיסוי זכוכית הפלזמה מנקה.
   2. להפוך את PDMS ומניחים אותו על המרכז של הזכוכית המכסה כך הצד בדוגמת אנשי קשר הזכוכית; ודא כי הערוצים האכלה (ריצה בין האזורים כניסת ולשקע) מיושרים עם הציר הארוך של הזכוכית המכסה. לחץ כלפי מטה בעדינות כדי לוודא את כלבי ים PDMS נגד הזכוכית.
6. אופים המכשיר שהורכב בתנור במשך לפחות שעה ב 60 מעלות צלזיוס. לאחר האפייה, לאמת ידנית PDMS מודבקת אל הזכוכית על ידי דחיפת בעדינות על פינה אחת של המכשיר.
   הערה: ברגע המכשיר מודבקת, זה אמור לשמש בתוך 24 שעות, הפולימר יהפוך יותר ויותר הידרופוביות עם הגדלת זמן לאחר טיפול פלזמה.

3. Microfluidic אינסטלציה הכנה

1. חתך אורכי של פולימר אבובים (הקוטר הפנימי (ID) 0.02 נקודות אינץ ', הקוטר החיצוני (OD) 0.06 inch) באורכים המתאימים כדי להגיע מהמשאבה מזרק למכשירים מיתוג (אם משתמשים), המכשיר כשהוא רכוב על המיקרוסקופ. חתך אורכי רבים כמו ישנם מסלולים microfluidic.
2. להרכיב Y צמתים עבור קמצוץ שסתומים (אם משתמשים) על ידי חיתוך וצירופם 2-ס מ אורך סיליקון גמיש אבובים (מזהה 0.03 נקודות אינץ, 0.065 אינץ OD) לחלקים העליונים של "Y", 1 ס"מ אורך צינורות סיליקון אנני התחתון של"Y".
3. לחתוך באורכים 10-ס מ (או המתאים) של פולימר אבובים; לחבר אותם בקצה אחד של הצומת בבורר על-ידי הוספת אותם 1 ס"מ סיליקון אבובים המקטעים בכל בארב התחתון של"Y". לחבר אותם בקצה השני כדי מחטים 21G שהוסרו מן מזרק פלסטיק מתאמים שלהם מכופף כ 90 ° כ 9 מ מ בקצה המחט.
4. להתחבר 21G מחטים בוטה קצה אחד המקטעים אבובים שיתקדם של מזרקים המנגנון מתג על-ידי הוספת את המחטים הצנרת. הכנס את הקצוות האחרים של כל אורך צינורות סיליקון אבובים המקטעים בכל כניסת לדיות צמתי Y.
   הערה: השימוש איזה מכשיר כדי להחזיק את קמצוץ שסתומים והצמתים במקום; זה יכול להיעשות בקלות מתוך תיבה עצה micropipette (איור דו-ממדי).
5. חתך אורכי של פולימר אבובים לשאת פסולת מהשפך של המכשיר כדי גביע פסולת. לחבר אותם בקצה אחד כדי מחטים 21G כפופות מוכן כמתואר לעיל. קלטת את הקצה השני של הצינורות לתוך גביע פסולת.
6. הכנת אמצעי אחסון המתאים של המדיה המכילה 0.1 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA) ולמלא את הגודל הרצוי ומספר מזרקים. להתחבר מזרקים BSA-טעון את המחטים 21G מוכן מצורף מזרקים אבובים, טען כניסת לתוך משאבות מזרק.
   הערה: לניסויים טיפוסי 5 ערוצים של המכשיר משמשים, כל אחד עם מזרק 20-mL. ניסוי שבו המדיום הוא החליף ידרוש 2 גדות 5 מזרקים. . הנה, המשאבה המכיל הבנק הראשון מכונה המשאבה שלב-1, המשאבה המכיל הגדה השנייה, עם המדיום שלאחר הבורר, נחשבת המשאבה שלב-2.
7. לטהר את האוויר מן הצנרת כניסת על-ידי הפעלת משאבות מזרק בספיקה גבוהה (> µL 500/min), בהתחלה על ידי המכוונת משאבות מזרק אנכית וטפיחות תארגן את הדברים כדי להביא בועות אוויר העליון. לאחר כבר מטוהר אוויר מ תארגן את הדברים, הנח את משאבת מזרק אופקית, בהדרגה הקש או קפיצי השורות פולימר תארגן את הדברים דרך מנגנון מתג כדי לסלק ולטהר בועות אוויר. חזור על תהליך זה עבור הגדה השנייה של מזרקים (אם החלפת מדיה).
8. לאחר בועות אוויר מנוקים, להגדיר את משאבת מזרק שלב-2 (כלומר, עם המדיום שישמש השני, לאחר הבורר) כדי µL 1.5/דקה, ואז להשהות את הזרימה. במקום קלסר קטן קליפים על המקטעים של צינורות גמישים על ענף צמתי Y המתאים בינוני השלב השני. להמשיך להפעיל את המשאבה שלב-1 מזרק בספיקה צנוע (למשל, µL 10/min) במשך לפחות 30 דקות לטהר את המדיום השני מ לאורך צינור כניסת הזרם של צומת Y.

4. תא תרבות הכנה

1. לגדול על preculture של המתח של עניין המדיום הרצוי בין לילה, לשלב נייח. המתח חיידקי צריך להכיל מוטציה זו שמעבדת את התאים משותק, כך התאים לא לשחות מחוץ הערוצים של המכשיר.
   הערה: פרוטוקול זה, המתח חיידקי הוא B. subtilis 3610 המכיל של מכשפההחלפת_A233V (מוטציה זו גורמת את שוטון להיות ישר ולא הסליל, מניעת תא תנועתיות), P_rsbV- mNeonGreen כתב של מתח התא, והכתבת שם מכוננת P_hyperspank- mNeptune (אדום) כדי לסמן את התאים. LB לנוקס בינוני משתמשים בפרוטוקול דוגמה. זנים אופייניים לניסויים מיקרופלואידיקה מכילים כתבים תעתיק פלורסנט אחת או יותר של חלבון פלואורסצנטי צורונים המיוצר, cytoplasmic להקל על זיהוי אוטומטי של תאים. פגמים צמיחה לא נצפו כאשר בינוני עשיר LB לנוקס היה בשימוש, אך הצמיחה B. subtilis תקשורתי מזערי עשוי להיות מעוכבים בתנאים microfluidic כי מופרש siderophores נשטפו על ידי זרימה בינונית. בנסיבות כאלה, הצמיחה עשויה להיות משוחזר על ידי התוספת של ציטראט נתרן וכלוריד הברזל ותחמוצת למדיום, כפי שדווח S7₅₀ בינוני¹¹.
2. בבוקר של הניסוי, לדלל תאי B. subtilis 1:50 לתוך בקבוקון 250-mL במבוכה המכיל 25 מ של מדיום הגידול. לגדל את התאים עבור 5-6 h לוחצים תרבות ב 37 ° C צפיפות אופטית של יותר מ- 1.
   הערה: תרבות תא עבות עדיפה כי נייחים-שלב B. subtilis תאים קטנים הינם פחות תא לעיתים קרובות שנמצאו שרשראות, דבר המקל על טעינת המכשיר. מינים חיידקים שונים עשויים לדרוש תנאים אחרים בינוני או צמיחה עבור טעינה אופטימלית.
3. באמצעות מזרק עם מסנן נקבוביות בגודל 5-מיקרומטר, לסנן כ-15 מיליליטר תרבית תאים לתוך צינור חרוטי 15-mL כדי להסיר שרשראות תא B. subtilis (זה לצורך e. coli , ייתכן שלא יהיה צורך עם מינים אחרים).
   הערה: תאים מעטים יחסית להסירם; פילטרט של צריכה להיות עכורים.
4. Centrifuge התרבות מסוננים 10 דקות ב g x 4,000 בטמפרטורת החדר. יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא בנוזל supernatant שאריות שנותרו בצינור, הוספת כ 500 µL בינוני טריים במידת הצורך להקל על pipetting התליה תא.

5. מכשיר הטעינה

1. הנח בעדינות ריק micropipette ג'ל העמסה דק טיפים (ראה טבלה של חומרים) לתוך החורים עודפים של המכשיר microfluidic.
2. באמצעות טיפים ג'ל העמסה דק micropipette P200, passivate את המכשיר על ידי הזרקת בינוני המכיל 1 מ ג/מ ל BSA לתוך החורים כניסת, התבוננות העצות החורים עודפים לעקוב אחר מילוי של הערוצים microfluidic (איור 2 א). דגירה המכשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 5 דקות.
   הערה: BSA משמשת כסוכן חסימה או פסיבציה זה יהיה לאגד השטח הידרופוביות של הפולימר PDMS, הגדלת hydrophilicity שלה וצמצום הכריכה של חלבונים אחרים או של תאים (דרך מולקולות על פני התא).
3. באמצעות טיפים ג'ל העמסה דק, טען אחד מהערוצים עם תאי resuspended (מתוך סעיף 4), באמצעות הטיפים בערוץ לשקע כדי לעקוב אחר ההתקדמות של התאים דרך המכשיר (איור 2B).
   הערה: טעינת בהנחייתם של הגדרת micropipette P200 את הנפח המרבי 200-µL שלה, ואז כ רפה בעברית כרית אוויר לפני כ רפה בעברית נפח קטן (בערך לחצי מנפח של מקטע דק של קצה פיפטה) של תאים. הנפח של תאים resuspended לא צריך להיות מדויק, כל אמצעי האחסון של המכשיר PDMS הוא קטן יחסית של micropipette. אנו יודעים על גבול עליון לצפיפות של תאי resuspended, כל עוד התליה תא יכול להיות pipetted לתוך המכשיר. תא גושים יכולים להיסתם המכשיר, יש להימנע pipetting יסודי ו/או מערבולת ערבוב.
4. הסר בעדינות את הטיפים ג'ל העמסה מכל החורים outlet, עובד אחד בכל פעם כדי למנוע נזק למכשיר.
5. Centrifuge את המתקן microcentrifuge ספסל-העליון במתאם הרוטור המתאים כ-6,000 g x 10 דקות (איור 2C).
   הערה: מתאם הרוטור אלומיניום במכונה מותאם אישית שנועדה להשתלב רוטור microcentrifuge (איור 2C) שימש; מודלים שונים צנטריפוגה עשוי לשמש עם מתאמים המתאימים הרוטור. התכונה החשובה של המתאם הוא שהיא מספקת כוח לרוחב לכיוון של קצות בתעלות התא, ובכך שכפית התאים ערוצי הצד הסגור.
6. ודא הטעינה מוצלח תחת המיקרוסקופ (איור 3) אך ללא הדבקות המכשיר המחזיק/הבמה שקופיות הוספת.
   הערה: ב פרוטוקול זה, 60 X, המטרה שמן-טבילה נה Ph3 1.4 משמש לאימות הן בשלב זה עבור הדמיה עוקבות.

6. התקן הרכבה, Equilibration והרכבה

1. בזהירות הר ההתקן טעון על הוספה הבמה על ידי מקליטה הזכוכית המכסה משני צדי PDMS לתחתית תותב הבמה (כלומר, להפוך את תותב שלב לפני שתצרף את המכשיר). היפוך הבמה הוספה-התקן הרכבה כך PDMS פונה ומניחים על משטח רך, כגון מחיקה ללא אבק (איור דו-ממדי).
2. להתאים את קצב הזרימה של המשאבה מזרק שלב-1 כדי µL לדקה 35 עובדים עם ליין אחד בכל פעם, להוסיף את המחט כניסת ולאחר מכן את המחט עודפים (קרי, רץ כשהספל פסולת; איור 2E).
3. לנגב את כל מדיום עודף עם מגבון לנקות אבק ללא ולבדוק באופן חזותי את ההתקן לאיתור נזילות. לבחון לאורך צינור עודפים על המראה של תאים עודף (מופיעה בדרך כלל פס עכורים) ולא של מניסקוס בינוני, אשר לאט להתקדם לקראת כשהספל פסולת.
4. היתר המכשיר לרוץ ב µL/דקה 35 כ 15-30 דקות, עד כל המסלולים מחוברים מחלישים לתוך כשהספל פסולת.
5. את משאבת מזרק שלב-1 מוגדר µL 1.5/min, להשהות את הזרימה. להביא את כל המתקן משאבת והתקן המיקרוסקופ (תהליך זה מסתייעת בזכות הצבתו על עגלה מתגלגל) והפעל מחדש את השלב-1 זרימה בינונית-µL לדקה 1.5 הר בקפידה את תותב הבמה עם המכשיר על גבי מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה, באמצעות הקלטת לפי הצורך כדי לנתב את כניסת ו עודפים אבובים.
6. לאתר למיקום על המכשיר עבור הדמיה ולהתחיל הדמיה כרצונכם. שימו לב כי תאים מצריכים בדרך כלל כמה שעות (כ- 10 דורות) כדי להגיע מצב יציב מעריכי-שלב הצמיחה, תחילת ייבוא תמונות עשוי להתעכב ככל הרצוי כך הדמיה מתחילה לאחר תקופת equilibration.
   הערה: מצב יציב צמיחת תאים שנערך בשלב מעריכי צריך ניתנת לאימות כמקורית במהלך ניתוח תמונות עוקבות מעקב חלוקת התא פעמים ולהבטיח שהם הגיעו ערך מינימלי קבוע.

7. מיתוג בינוני

1. בין כדורים רצופים של הדמיה, השהה את הזרימה של המשאבה מזרק שלב-1. להיפרם בקפידה את הקליפים בינדר מ שהסיליקון שלב-2 אבובים, עובר כל אחד לאורך צינור סיליקון על ענף שלב-1 לצומת Y. נפעיל הזרימה של השלב-2 מזרק משאבה (אשר הוגדר µL 1.5/min בשלב 3.8) ולהמשיך הדמיה.
   הערה: ב- 1.5 מיקרומטר/דקה באורך 10 ס מ של פולימר אבובים במורד הזרם של צמתי Y, המדיום שלב השני מגיע המכשיר כ- 50 דקות. הפעם על המכשיר יכול מדעית להיבדק באמצעות מדיה המכילים חלקיקים מעקב פלורסנט.

תוצאות

תא הראשונית מוצלחת טעינה, כפי מוערך על ידי מיקרוסקופ ניגודיות שלב לפני שתצרף את הצנרת microfluidic למכשיר, ייחשב כבעל כל או כמעט כל ערוצי הצד microfluidic המכיל תאים חיידקיים, אחד או יותר ( איור 3 א). טעינה אופטימלית יראה תאים אחדים בכל אחד מהערוצים, אך ערוצי ימלא בכל זא?...

Discussion

פרוטוקול זה מיקרופלואידיקה הוא גמיש כי רבים מן השלבים ניתן לשנות כדי למטב את השימוש עם מינים מסוימים או זן או למטרה מסוימת. ואכן, ב פרוטוקול זה עשינו שינויים המקורי "האם מכונה" קונספט⁴ כדי למטב את השימוש עם B. subtilis. לעתים קרובות, התעלות שבו מרותקים התאים מהווה תכונה שכבה אחת,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	(240)4019862	This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch	World Precision Instruments	504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass	VWR	48393 172
Plasma Etch PE-50	Plasma Etch Inc.	PE-50	Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06"	Saint-Gobain PPL Corp.	AAD04103	For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD	HelixMark Standard Silicone Tubing	60-795-05	For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G	Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200)	Molecular BioProducts	2155	For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane	Pall Life Sciences	4560	For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1"	McMaster-Carr	75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene	Nordson Medical	Y210-6005	The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon		This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox	Sigma-Aldrich	L3022
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1	wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven	VWR	414005-106	for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit	3M	2216 B/A	may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width	3M		to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800N	listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	To clean cover glass
Syring pump, 6 channel	New Era Pump Systems Inc.	NE-1600
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	a brand of dust-free wipes