Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

Summary

קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Abstract

עלבונות pathophysiological רבים יכולים לגרום נזק קרום התא, כאשר משולב עם פגמים מולדים תיקון קרום התא או תקינות, עלול לגרום למחלות. להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס סביב תיקון קרום התא, לפיכך, הוא מטרה חשובה להתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות הרומן המחלות הקשורות dynamics קרום התא לא מתפקדת. מחקרים רבים בתוך חוץ גופית ו ויוו להבנת קרום התא חתימת בהקשרים שונים של המחלה לנצל אבלציה לייזר שני הפוטונים כסטנדרט לקביעת תוצאות תפקודי בעקבות ניסיוני טיפולים. ב הזה assay, קרום התא הם נתון ופצעו עם לייזר שני הפוטונים, הגורמת קרום התא ועד לשתל הפלורסנט לחדור לתא. ניתן לנטר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך התא ואז לכמת את היכולת של התא לאטום מחדש את עצמו. ישנן מספר שיטות חלופיות להערכת קרום התא בתגובה לפציעה, כמו גם וריאציה נהדרת הלייזר שני הפוטונים ופצעו את הגישה עצמה, לכן, מודל אחד, מאוחד של התא ופצעו ישרת לטובה כדי להקטין וריאציה בין אלה מתודולוגיות. במאמר זה, אנו מכינים לייזר שני הפוטונים פשוטה ופצעו את פרוטוקול להערכת קרום התא תיקון במבחנה בשני בריא וב פיברובלסט החולה dysferlinopathy תאים transfected עם או בלי פלסמיד dysferlin באורך מלא.

Introduction

קרום התא של התאים האיקריוטים מורכב שכבה כפולה של פוספוליפידים משובץ-חלבון אשר מגדיר את סביבת חוץ-על/תאי "אינטרה" של התא היא חיונית לשמירה על הישרדות הומאוסטזיס ותא הסלולר. קרום התא פציעות הנובעות עלבונות כימי או מכני הם דבר שבשגרה בסוגים בתרבית של תאים שונים, לרבות שלד, שריר הלב, הקיבה והריאות תאים^1,2,3,4. בנוסף פציעות הסוגר יומי תפקיד פיזיולוגי, קרום התא יכול גם להיות נפגע על ידי עלבונות סביבתיים רעלים חיידקי, פגיעה reperfusion איסכמי⁵. כישלון כדי לחתום מחדש יתבקע קרום התא מוביל תזרים ללא פיקוח של חוץ-תאית Ca^{2 +}- יחד עם רכיבים אחרים חוץ-תאית רעיל - לתוך התא, מפעילה cascades האות במורד הזרם, אשר עלולה לגרום במהירות בתא מוות^1,4,5,6.

עד כה, היו מספר דגמים המוצע לתיקון ממברנה בתאים. אולי ניתן להפעיל מנגנוני תיקון שונים תלוי בגודל אופי העלתה קרום. כך למשל, הוא הציע כי קרום התא עשויים לנצל זרימת לרוחב או חלבון סתימת לתקן שיבושים קטנים (< 1 ננומטר). המודל פיוז'ן לרוחב מציעה כי קרום יתבקע במהירות לתיקון דרך גיוס לרוחב של המכילות dysferlin ממברנה⁷, ואילו החלבון סתימת דגם מרמז כי נקבים קטנים הם לתיקון דרך הצטברויות של חלבון (בעיקר annexins) ⁸. לעומת זאת, לעורר נגעים ממברנה גדולות Ca^{2 +}-שלפוחית התלויים, בתיווך dysferlin פיוז'ן ועל היווצרות טלאי תיקון. במודל טלאי תיקון, Ca^{2 +} הזרימה המהירה לתוך התא מפעילה הגיוס של חלבונים מרובים (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ו EDH חלבונים) אשר ליצור מתחם או "תיקון", יחד עם שילוב של שלפוחית תאיים או lysosomes באתר של הממברנה גורם נזק^4,9,10,11,12. חשוב לשים לב כי מודלים אלה אינם בהכרח סותרים, אולי לעבוד ביחד כדי להקל על תיקון קרום. כשל לחתום כראוי נזק קרום התא משויך מספר מצבי מחלה, כולל ניוון שרירים (dysferlinopathy - כולל מיושי מיופתיה, חגורת הגפיים-ניוון שרירים מסוג IIB, מיופתיה דיסטלי עם תחילת הטיביאלי הקדמי) ¹³, קרדיומיופתיה¹⁴ו- Chediak-היגאשי תסמונת (CHS)¹⁵.

נתון זה שלמות קרום התא המתאים וחתימה מחזות תפקיד כה חשוב על בריאות ומחלה, הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המולקולריים הבסיסית של תיקון קרום התא יהיה מועיל בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות. לכן,, יש להחזיק טכניקות ניסיוני המתאים כדי לפקח על קינטיקה, להעריך את היכולת של תיקון קרום התא. מספר במבחנה שיטות לסימולציה תיקון קרום עוצבו. אסטרטגיה אחת כרוכה פגיעה מכנית, אשר ניתן להקל באמצעות תא גירוד עם תער/להב פיפטה/כירורגי או על ידי גלגול חרוזי זכוכית על תאי ה-¹⁶. עם זאת, סוג זה של פציעה מכני יוצר נגעים גדולים ויוצרת רמה גבוהה של וריאציה תא לפציעה, הן בתוך והן בין תרבויות.

שיטה נוספת של יצירת פצעים ממברנה היא אבלציה לייזר על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים. בניגוד לייזר מסורתיות מיקרוסקופיה קונפוקלית מעסיקה עירור פוטון יחיד, הלייזר שני הפוטונים משתמשת בו זמנית שני פוטונים ארוך באורך הגל, אנרגיה נמוכה כדי להקל את עירור של אלקטרון בעל אנרגיה גבוהה¹⁷. תהליך ליניארי זה יוצר עירור אך ורק בתוך המטוס מוקד וגם לא לאורך כל הנתיב אור¹⁷ (איור 1). זה מופחת עירור העוצמה מסייעת למזער את נזקי כאשר הדמיה תאים חיים^18,19. חוקרים ולכן מסוגלים לייצר נגעים מדויקת קרום התא וחתימה צג ממברנה בזמן אמת באמצעות צבעי פלורסנט ו התבוננות שינויים בעוצמת פלורסצנטיות כמו קרום התא יתבקע ולאחר מכן החתימות מחדש.

בגישה זו נעשה שימוש שוב ושוב ללמוד ממברנה ופצעו בתוך חוץ גופית ו ויוו וסוגי בתא מספר^20,21. לדוגמה, ממברנה לתקן פגמים fibroblasts, myotubes נגזר dysferlinopathy חולים היו העריך באמצעות טכניקה זו,^22,23. כמו כן, סיבי שריר בודד מבודד עכברים שימשו כדי לפקח על תיקון תיקון היווצרות^13,24,25. התנועה של חלבונים מתויגות fluorescently יכול גם להיות שנצפו במהלך תיקון קרום סיבי השריר יחידה⁹. יתר על כן, התהליך של תיקון sarcolemmal בעקבות שני הפוטונים לייזר ופצעו בדג זברה העוברים נראים גם בזמן אמת אין ויוו²⁶.

במאמר זה, אנו מכינים מתודולוגיה להערכת הדינמיקה תיקון קרום התא של fibroblasts באמצעות לייזר שני הפוטונים ופצעו, למרות מתודולוגיה זו שניתן להחיל על סוגי תאים שונים לצורך לכימות קרום פלזמה חתימת יכולת במבחנה. בשיטה זו, תאים מודגרת עם FM4-64, צבע lipophilic, התא אטום אשר במהירות שזוהר כמו זה נקשר באופן שלילי טעונה פוספוליפידים בתוך הציטופלסמה עם כניסתו לתא דרך ממברנה הנגע (איור 2& 3)-כימות של זריחה צבע סמוכים הנגע ממברנה מאפשר ניטור הזמן שלוקח את קרום התא לחתום מחדש את עצמו. לצורך המחשה השירות של שיטה זו, אנו משתמשים dysferlinopathy החולה fibroblasts transfected עם פלסמידים מצומדת-GFP באורך מלא dysferlin (DYSF) כדי להעריך את החילוץ של תיקון קרום התא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

תאי פיברובלסט האנושי השתמשו במחקר זה נעשה שימוש באישור ועדת האתיקה האנושית של הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים באוניברסיטת אלברטה.

1. תרביות תאים תאים עם פלסמיד DYSF באורך מלא

1. התרבות תאי פיברובלסט בבקבוקון T225 המכיל 40 מ של צמיחה מדיה - בינוני נשר שונה (DMEM) של 36 מ"ל Dulbecco, 4 מיליליטר סרום שור עוברית (FBS) ו 20 µL של פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) - ב חממה₂ CO ב 37 º C.
   הערה: התאים צריכים להיות בתרבית עד כ 70-80% confluency, אסור להפוך confluent לחלוטין.
2. כדי להתכונן זריעת תאי, לשטוף את התאים 40 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) פעמיים ולאחר מכן הוסף 5 מ של 0.05% טריפסין כדי לנתק את התאים. להחזיר התאים 37 ° C CO₂ מגשים, דגירה התאים במשך 5 דקות.
   1. כאשר התאים מנותק לחלוטין, להוסיף 40 מ"ל של צמיחה מדיה כדי לעצור את התגובה טריפסין.
   2. לספור את התאים באמצעות hemocytometer או תא אחר ספירת ההתקנים.
3. זרע 2 מ"ל של תאים-עונה 1 פרק 10⁵ תאים למ"ל 35 מ מ מצופה קולגן זכוכית-התחתון מנות. דגירה בין לילה בתאים חממה₂ CO ב 37 º C.
   הערה: תאים צריך להיות כ- 50-60% confluent למחרת.
4. מסיר את המדיה צמיחה ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של הפרעות-סרום התקשורת (מדיה צמיחה בלי FBS).
5. Transfect התאים עם פלסמיד באורך מלא dysferlin באמצעות lipotransfection.
   1. להכין µL 150 של הפרעות-סרום מדיה צינור 1.5 mL (שפופרת אחת עבור כל מנה להיות transfected).
   2. להוסיף 3 µL של תרביות תאים ריאגנט כל שפופרת 1.5 mL המכיל הפרעות-סרום מדיה. דגירה זה לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. בשפופרת mL 1.5 נפרדת, מוסיפים µL 175 של מדיה הפרעות-סרום µg 3.5 של פלסמיד ה-DNA.
      הערה: להכפיל את הכמויות הנ עבור כל מנה נוספת להיות transfected.
   4. לשלב 150 µL של המדיה המכילה פלסמיד DNA לתוך צינור עם 150 µL הפרעות-סרום ומדיה ריאגנט תרביות תאים. תקופת דגירה זה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. פזר באופן שווה 300 µL של התקשורת עם ריאגנט פלסמיד, תרביות תאים על-פני המנה. דגירה הכלים במשך 24 שעות ביממה ב חממה₂ CO ב 37 º C.
6. החלף את המדיה צמיחה טריים המדיה המכילה סרום, תקופת דגירה זה של h 24 נוספים ב חממה₂ CO ב 37 º C.

2. הכנה של תאים assay ופצעו שני הפוטונים

1. להסיר כלי התקשורת על-ידי pipetting, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode טריים המכילים µL 1 של 2.5 מ מ FM צבע 4-64.
   הערה: הריכוז הסופי של FM 4-64 צבען הוא 2.5 מיקרומטר.
2. אם הערכה של תיקון קרום בסביבה מדולדל סידן רצוי, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של PBS המכיל 1 מ מ EGTA.
   הערה: כפי PBS יגרמו התאים לנתק לאורך זמן, וזמינותו wounding צריך להשלים מהר ככל האפשר.

3. שני הפוטונים לייזר assay ופצעו

1. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה והתוכנה התוכנית המשויכת אליו, ליצור מטרה מיקרומטר 0.2 µm x 2 והנח אותו בקצה של קרום התא כך קו המטרה חופף הוא בניצב לכיוון קרום התא (איור 2).
2. משתמשים בלייזר הנה 543-nm לרגש FM לצבוע אות ולקבוע טווח זיהוי עבור 600-760 ננומטר. השתמש לייזר ארגון 488 ננומטר לרגש GFP אות (איור 4) ולקבוע טווח זיהוי עבור 500-550 ננומטר.
   1. צור סידרה זמן 5 דקות של סריקות תמונה רציפה, הדמיה תאים כל 5 s.
   2. ליצירת פצע ממברנה, אקונומיקה התאים באמצעות לייזר שני הפוטונים מוגדר כ- 820-nm, באמצעות 15% לייזר כוח עם 10 חזרות, אקונומיקה תאים 25 s לאחר תחילת סדרת הזמן.
3. כדי לכמת FM 4-64 לצבוע פלורסצנטיות, להשתמש בתוכנה לצייר אזור מיקרומטר מיקרומטר x 6 6 עניין (ROI) ואת למקם אותו סמוך אל המיקום wounding, בתוך התא (איור 3).
   הערה: להימנע דגימה תחומי פיקסל oversaturation באמצעות הפונקציה "טווח מחוון" בתוכנה - ביישום זה, הפיקסלים האדומים מייצגים פיקסלים רווי. לייצא ערכים פלורסצנטיות גולמיים לתוך גיליון אלקטרוני אלקטרונית של לשם ניתוח סטטיסטי.
4. לחשב פלורסצנטיות יחסי ערכים עבור כל נקודת זמן על-ידי חיסור הערך רקע (זריחה אומר ערך של timepoints לפני ממברנה ופצעו) ואת חלוקת העלייה נטו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הערך ב- t = 0 (איור 5, 6) .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Fibroblasts אנושי בריא fibroblasts החולה dysferlinopathy שאינם מטופלים, החולה fibroblasts transfected עם פלסמיד המכיל רצף באורך מלא dysferlin היו נתונים שני הפוטונים לייזר ופצעו להעריך ממברנה חתימת יכולת בזמן אמת. פיברובלסטים אנושי בריא מוצגים רמות נמוכות של הפעלת פלורסצנטיות FM 4-64 בעקבות לייזר ופצעו. שא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שני הפוטונים לייזר פציעתו של קרום התא הוא טכניקה מדויק ופסיביות להערכת את הדינמיקה של קרום חתימה מחדש בתוך חוץ גופית. במאמר זה, אנו המתואר פרוטוקול לקביעת קרום התא חתימת יכולת בתאי החולה dysferlinopathy באמצעות הלייזר שני הפוטונים ופצעו וזמינותו. התוצאות שלנו להראות כי dysferlinopathy החולה תאים פ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media	Thermo Fisher	31985070
Transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Dye	Invitrogen	T13320
Tyrode’s Salts Solution	Sigma-Aldrich	T2397
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	NA
Chameleon Two-photon laser	Coherent	NA