טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Summary

אנו מתארים את התפתחות מודל מבוסס ספרואיד, תלת מימדי במבחנה זה מאפשר לנו לבדוק הסטנדרטי העכשווי של משטרי טיפול ניסיוני עבור הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים בשורות תאים, מכוון הערכת טיפול רגישות והתנגדות על ראשי תאים אנושיים דגימות בעתיד.

Abstract

אפשרויות הטיפול הנוכחי עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר (HNSCC) ואחראי מתקדם, חוזרים ונשנים לתחום הקרינה וגישות קרינה-כימותרפיה עם או בלי ניתוח. בעוד משטרי כימותרפיה פלטינה מבוססי כיום מייצגים את תקן זהב במונחים של יעילות, ניתנות ברוב המכריע של המקרים, משטרי כימותרפיה חדשה, כלומר חיסוני מתגלים. עם זאת, שיעורי ההיענות ואת מנגנוני ההתנגדות טיפול או משטר כימותרפיה קשים לחזות ולהישאר מובן דיו. וריאציות רחבה של טיפולים כימותרפיים, והקרנות מנגנוני ההתנגדות ידועים עד כה. מחקר זה מתאר את התפתחות assay מתוקננת, תפוקה גבוהה במבחנה כדי להעריך את התגובה של HNSCC תא קו על משטרי הטיפול השונים, ובתקווה בתאי העיקרי של חולים בודדים ככלי בעתיד לגידול אישית טיפול. וזמינותו נועד להיות משולב לתוך האלגוריתם תקן איכות שבשליטת לחולים HNSCC במרכז שלנו טיפול שלישוני; עם זאת, זה יהיה הנושא של מחקרים עתידיים. הישימות הטכנית נראה מבטיח עבור ראשי תאים מן הגידול ביופסיות מחולים בפועל. דגימות מועברים אל המעבדה. ביופסיות מכנית מופרדים שהופעלו על ידי עיכול אנזימטי. תאים ואז מתורבתים ב אדהזיה נמוך במיוחד תא תרבות בקבוקונים לקדם היווצרות ספונטנית, מתוקננת הדירים תלת מימדי, בצורת ספרואיד תא וקונצרנים. Spheroids מוכנים ואז ייחשפו הפרוטוקולים כימותרפיה-קרינה ופרוטוקולים חיסוני כנדרש. גודל הכדאיות ואת ספרואיד התא האחרון אינדיקטורים של טיפול הרגישות, ולכן יכול להיות נמשך בחשבון בעתיד כדי להעריך את התגובה לטיפול סביר המטופלים. מודל זה יכול להיות כלי רב ערך חסכוניים לקראת טיפול מותאם אישית עבור סרטן הראש והצוואר.

Introduction

הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC) הוא הסרטן השישי בשכיחותו ברחבי העולם עם שיעור העולה של הרירית הפפילומה האנושי (HPV) זיהום-הקשורים פתוגנזה, ליד רוב המקרים הנגרמת על ידי עודף ניקוטין ואלכוהול צריכת ^1,2. בעוד גידולים קטנים יותר ושלבים פולשנית מראש הם בדרך כלל מאוד לטפל בה היטב עם כריתה כירורגית, בדרך כלל בשילוב עם לנתיחה הלימפה הצווארי, טיפול HNSCC בשלב מתקדם, חוזרים ונשנים נותר מאתגר עקב הגידול אגרסיבי פלישה עם התפשטות גרורתית, עמידות בפני קרינה וכימותרפיה פרוטוקולים^3,4,5,6,7,8. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים השתנות גבוהה של פנוטיפ הסלולר, ואפיון תת לאומיים, תאים סרטניים המופץ החלה^9,10. האמונה קודמת של גידול מוצק, אחיד המוני היה צריך להיות מתוקן לאור מחקרים שנעשו לאחרונה בעבר שנים^11,12,13,14. לגישות עבור גידול אפיון וזיהוי של מוטציות מפתח יכול לזהות מספר גנים נראים להיות מזוהה עם עמידות לטיפול אך נשארים בגישה עלות עתירי. יתר על כן, הידע של גנוטיפ אינה מאפשרת בהכרח חיזוי אמין של פנוטיפ והתגובה לטיפול שלו.

היו כמה התקדמות בשיפור ההישרדות הכללית ללא מחלה של מחלה בשלב מתקדם, חוזרים ונשנים. ניקוטין - כמו גם וירוס-הקשורים קרצינומה, אפשרויות הטיפול הנוכחי מלבד ניתוח לתחום משטרי כימותרפיה מבוסס פלטינה של קרינת אגרסיבי. היו השלכות על שיעורי ההיענות שונה בין HPV שלילי וחיובי קרצינומה; עם זאת, זה עדיין לא תוביל לשינוי באופן כללי הנחיות טיפול. ההתנגדות לקראת הקרנות וכימותרפיה היא תופעה נפוצה בכל שלבי הגידול, קיימת עבור פלטינה מבוססי כימותרפיה כמו גם לגבי טיפול ממוקד (Anti-EGFR; קולטן גורם הגדילה באפידרמיס) לאחרונה המתעוררים עיכוב במחסום¹⁵. יעילות הקרנות וכימותרפיה לבוא בעלות גבוהה של תחלואה משמעותית המטופל מבחינת בבליעה, mucositis, יובש בפה, סיכון של ירידה של תפקוד כליות או לב בין היתר. ניחוש תרפיה תגובה מוקדמת ההחלטה של המושג טיפול כללי עבור כל מטופל בודדים נראה המטרה מכריע, למנוע טיפול מיותר מושגים, תופעות לוואי ועלויות.

אנחנו ביקשו להקים מודל כדי לבדוק את הרגישות טיפול הפרט החולה לכיוון הנוכחי תקן הכימותרפיה קרינה-זה יכול להיות משולב לתוך האלגוריתם רגיל ומבוקר על-ידי איכות הטיפול oncologic מנקודה טכנית עומד. המטרה רחוק היה להשתמש במודל ללא שימוש שורות תאים שהשתנו בכבדות בגילאי, כפי שהם מייצגים לקוי תאים סרטניים אנושיים בפועל ללא השתנות שלהם הטרוגניות כפי שאנו יודעים, תוך הקמת בפרוטוקול נעשתה בשורות תאים שונים. . להיות עצמאי רק שורות תאים זמינים מסחרית, לאחרונה בהצלחה יצרנו קו תא ביניים הנקרא "פיקה" מתאי HNSCC העיקרי של דגימות הגידול האנושי עם סמנים הסלולר שנשמרת על הקטעים שלה-משטח ומוגבל ¹⁶. שורת התאים פיקה זו צריך לשמש כהכנה הפיתוח של המודל על הכביש כדי ואז מאוחר יותר בעקבות ניסויים עם תאים סרטניים אנושיים טריים מן הגידול ביופסיות. הוכח כי תאים תאים תלת מימדי התרבויות מגיבים באופן שונה, יותר ויוו-כמו למינהל של תרופות סרטן מאלו גדל monolayers^{17,18,19,20 ,21}, בעיקר בזכות השימור של הנדידה בידול תת מאפיינים מסוימים תא קבוצות משנה^22,23,24. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול של מודל מבוסס ספרואיד, תלת מימדי של שורות תאים ביניים ולשלב העיקרי האנושי קרצינומה של תאים קשקשיים תאים ודרכים איך כזה מודל טיפול בסרטן הראש והצוואר מנתח, אונקולוג ( איור 1).

Protocol

כל המחקרים שמוצג בכתב היד, כלומר השימוש של דגימות הגידול אנושי, מוגנים תחת ותוך הסכמה עם החלטות קודמות של האוניברסיטה לרפואה של מיינץ (mainz) / האוניברסיטה של ועדת האתיקה מרכז רפואי מינכן. חולים נתנו הסכמה מדעת לפי הנחיות משפטיות לאומי להסכים השימוש המדעי של חומר ביולוגי עודף שהושגו במהלך הטיפול שלהם. המחקר בוצע בהתאם כל הנחיות מוסדיים, לאומיים ובינלאומיים לרווחת האדם.

1. לקיחת ביופסיה של הגידול הראש ו קרצינומה של תאים קשקשיים האק

1. לבצע הכללי (propofol ו/או sevoflurane, הסוכן מרגיע שרירים) או חדירה מקומי (2% ultracaine, אדרנלין) / משטח הרדמה (כדי להרדים) על כיסא הבדיקה לחדר ניתוח או אף אוזן גרון. לדמיין את המסה הגידול בחלקים חלל/הלוע/גרון/אחרים אוראלי של מערכת העיכול, מערכת הנשימה העליונה עם תקן הפעלה כלי נגינה, ובמידת הצורך, תחת המיקרוסקופ.
2. לקחת ביופסיה של הגידול טריים מן הפריפריה של הנגע סרטניים עם מכשירים בוטה או חיתוך. הימנע במרכז הנגע עקב נמק בשפע באזור זה. לשים את הרקמה שהושג במיכל סטרילי עם פתרון מול נתרן כלורי.
3. לאחר הביופסיה, לבצע hemostasis כנדרש, למשל., עם מכשיר דו קוטבית או monopolar קרישה תוך ניצול של חומרים vasoconstrictive.
4. להביא את הביופסיה הגידול נועד לשמש לניסויים התרבות התא ישירות אל מערכת מעבדה סמוכים. לשלוח אחרים ביופסיות הגידול הפתולוג כרגיל כדי לשלול סרטן.
5. ודא כי טכנאי מעבדה הוא מוכן לעבד את הדגימה ישירות.

2. עיבוד הדגימה הגידול

1. הנח את הדגימה הגידול על משטח מתאים וסטרילי, לחתוך אותו ביסודיות עם איזמל חד-פעמי סטרילי לחתיכות מעט ככל האפשר.
   התראה: ודא כי המצב של מחלות זיהומיות נישא בדם מתועדת הטכנאי תשומת לב של המוסדות תקן פרוטוקולים כדי למנוע מחט מקל או פציעה חיתוך עם פוטנציאל חומר המטופל הביולוגי ו פרוטוקולים לעקוב אחרי פציעה.
2. לאחר ההפרדה מכני מספיק של הרקמה העיקרית, לשים את הרקמה לתוך בקבוקון המכיל Collagenase אני / II דגירה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. ניפוי דרך מסננת תא 70 מיקרומטר בז ולשטוף את הבולם עם פתרון מאוזן מלח הנקס (HBSS).
3. לאחר ההפרדה המוצלחת, כביסה עוקבות, למקם את המתלים המכיל 1-2 × 10⁶ תאים לתוך T75 תא תרבות מבחנות (75 ס מ²) לגדול sub-confluency-5% CO₂ ו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שלב זה עשוי להימשך עד 10 ימים.
   1. שימוש תקין מיוחד תרבות בינוני המורכב הבאות: 125 מ של Dulbecco המתואמת של הנשרים בינוני (DMEM), 250 מ של תקין השלים בינונית (medium המלווים בהיקף של 500 מ"ל תקין SF בינוני, 15 מ ג של יותרת המוח שור תמצית (BPE), 2.5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין, 150 ng רקומביננטי אפיתל גדילה הגורם האנושי (EGF), 516 µL של 300 מ"מ CaCl₂, תמהיל מניות להיות מוכנים מראש), 125 מ של מיקס מזין F12, 10 מ ג של BPE (0.75 מ ל), 75 ng EGF האנושי רקומביננטי (2 µL) , 3.75 מ ל-200 מ מ L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (טבלה של חומרים).

3. זריעת את התאים נמוך במיוחד אדהזיה תא תרבות לוחות

1. לאשר תא הגידול במיקרוסקופ. לספור את התאים בתרבות (ראשי או תרבית תאים) ואת זרע תאי הגידול העיקרי 5,000 או 1,000-2,000 תאים של שורת התאים ביניים / בקו התא השני ב- 200-300 µL של המדיה (שלב 3.2.) לתוך צלחת אדהזיה נמוך במיוחד עם קעורה, לעגל תחתית (96-ובכן).
2. התרבות התאים ב- 5% CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס, בחלקים שווים DMEM ואת דרכי הנשימה תאים אפיתל בינוני (BEGM), סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן הכרחיות של 1%, 1%-גלוטמין (שלב 2.3.). אם שורות תאים משמשות, התקשורת על בסיס DMEM מספיקה.
   1. לבצע שינויים מדיה בכל יום אחר. שים לב לא לרוקן את ספרואיד עם פיפטה במהלך שינויים מדיה. תרבות של spheroids עד הרמה של צמיחה כמו descibed ב 3.3 הגיע (כ 7-10 ימים).
3. לאשר היווצרות ספונטנית ספרואיד תחת המיקרוסקופ על ידי מחפש תלת מימדי, בצורת ספרואיד תא וקונצרנים. הכללת הבארות לא סדיר ו/או היווצרות ספרואיד מרובים מלחקירה נוספת.
   הערה: Spheroids צריך להיות גלוי בעין בלתי מזוינת, גם להקל על עיבוד נוסף של שינויים מדיה כמפורט להלן.

4. חשיפת Spheroids לטיפול גידול רגילה או ניסיוני עם מודאלים מרובים

1. בחר את משטר הטיפול הרצוי. עיצוב קבוצות הבקרה גדול מספיק לאפשר השוואות של טיפולים spheroids שלא טופלו או spheroids מקבל רק טיפול חלקי משטרי, למשל. קרינה לבד. הגודל של קבוצות שליטה תלוי בעיצוב ניסיוני קבוצה, לא יכול להיות מוגדר באופן אוניברסלי.
2. להחליף את המדיה מדיה עם תוספים, משמעות מדיה עם chemotherapeutics ו/או נוגדנים חד-שבטיים בריכוזים הרצויים. להוסיף ציספלטין בכל הריכוזים של 2.5/5/10 מיקרומטר או 5-fluoruracil (5FU)-30 מיקרומטר.
   הערה: עבור תפוקה גבוהה ניסויים או מספר גדלים/גדול קבוצה גדולה של קבוצות, אחת יכולים להשתמש רובוט pipetting אוטומטית אנחנו מקימים עוד יותר בניסויים.
3. לחלופין, להקרין צלחות התרבות תאים עם spheroids ב 2 Gy בעזרת מתקן קרינה מתאים.
   התראה: לכבד את הפרוטוקולים של המוסד בדבר מניעת קרינה מזיקה חשיפה של העובדים. לעבוד רק עם טכנאים המיועד ולמדו בהתאם להנחיות הגנה מפני קרינה. אם רצונך בכך, להוסיף chemotherapeutics כמתואר תחת 4.2. לאחר מכן.
4. דגירה את התאים עבור 24 שעות בתנאים שתוארו תרבות (37 מעלות צלזיוס, שלב 3.2).
5. לאחר הדגירה, להמשיך את התרבות התא לפחות 6 ימים עם שינויים מדיה בכל יום אחר.

5. הערכה של גודל ספרואיד ומידת התפשטות הסלולר עבור Assay Read-out

1. למדוד ספרואיד גודל מבחינת האזור לאחר תמונה דיגיטלית לתיעוד ביום 6 (יום 10, יום 16) עם תוכנה גרפית (פרמטר 1).
2. לאחר צנטריפוגה ב g 520 x 2.5 דקות של הצלחת, הסר את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים עם כמות מספקת של 1-PBS וצנטריפוגה שהצלחת שוב כמתואר, ואחריו הסרת את תגובת שיקוע (PBS).
3. להוסיף 100 µL של התא אנזימטי ניתוק פתרון לכל מבחנה כדי לאפשר את spheroids להתמוסס. דגירה את הצלחת. בשביל 8 דקות ב 37 º C.
4. בדוק המסת מוצלח של ספרואיד מתחת למיקרוסקופ. להוסיף 100 µL של DMEM. Centrifuge הצלחת-520 x g עבור 2.5 מינימלית להסיר את תגובת שיקוע, להשעות את התאים µL 100 של DMEM.
5. ביצוע וזמינותו של התפשטות ערכי צבע מוחלטים זמינים מסחרית, דוגמה assay wst, מרץ-8 על כל בקבוקון לפי הוראות היצרן²⁵. קרא את וזמינותו בקורא assay (אליסה) מקושרים-אנזים immunosorbent (פרמטר 2).

תוצאות

הצלחנו לייצר reproducibly spheroids של תא בודד המתלים, תחילה שורות תאים שונים כולל קניינית פיקה תא השורה, מאוחר יותר מתאי סרטן אנושי ראשוני נגזר הגידול טריים ביופסיות כפי שמתואר Hagemann ואח . ²⁶. הערכנו שתי שיטות הוקמה לדור ספרואיד; השניים להיות התליה כביכול ירידה שיטה...

Discussion

הצלחנו ליצור פרוטוקול כדי ליצור spheroids לשחזור מתוך תא המתלים, עבור שתי שורות תאים, בניסויים ראשוניים, תאים סרטניים אנושיים העיקרי. אנו קודם העריך שתי השיטות שתוארו, זיהה את השיטה-אולה, שיטה שבו משמשים תרבות צלחות במשטחים אדהזיה נמוך במיוחד, כדי להיות בטוח יותר ואמין יותר לדור של spheroids תלת מימ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350