קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

Abstract

המעגל קוצב לב היממה האחראית פלטי פיזיולוגיים ורגשיים קצבית מתואמת עם רמזים סביבתיים, כגון מחזורי יום/לילה. השעון המולקולרי בתוך כל נוירון קוצב לב יוצר השעון הביולוגי בביטוי גנים, אשר מושתתות הפונקציות עצביים קצבית חיוני לפעולה של המעגל. חקירת המאפיינים של הפרט מולקולרית של מחלקות שונות של קוצב לב נוירונים ודן האינטראקציה שלהם עם אותות עצביים התשואות הבנה טובה יותר של המעגל היממה קוצב לב. כאן, אנו מציגים בגישה מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות פותח על מנת לנטר את שעון מולקולרי בנוירונים שעון מהמוח זחל דרוזופילה בתרבית. שיטה זו מאפשרת הקלטת הנמשך של חמשת המקצבים של מקודדים גנטית עיתונאים היממה פלורסנט ברזולוציה תא בודד. תוכנית התקנה זו יכול להיות משולב עם מניפולציות תרופתי לנתח באופן הדוק תגובה בזמן אמת של השעון המולקולרי תרכובות שונות. מעבר מקצבים השעון הביולוגי, שיטה זו תכליתי בשילוב עם טכניקות עוצמתיות דרוזופילה גנטי מציעה את האפשרות ללמוד מגוון תהליכים עצביים או המולקולריות ברקמת המוח בשידור חי.

Introduction

שעונים היממה לעזור אורגניזמים להסתגל לשינויים סביבתיים תקופתיים שנוצר על ידי 24 שעות הסיבוב של כדור הארץ. לולאות משוב תעתיק translational בזו ביסוד נפוץ המנגנון המולקולרי של היממה שעונים על פני מינים¹. המעגל היממה קוצב הלב מורכב המכיל שעון נוירונים משלב זמן-של-יום המידע הנמסר על ידי רמזים סביבתיים, כגון/כהה (LD) ומחזורי טמפרטורה, שיתכנן את מקצבי שפע של יומי פיזיולוגיים, תהליכים התנהגותיים^2,3. התיאום של מקצבים מולקולרית עם עצביים התשומות והתפוקות חשובה קריטית עבור הפעולה של מעגל היממה אך שרידים הבין באופן חלקי בלבד.

דרוזופילה, בליבה של השעון המולקולרי, heterodimer מחזור/שעון (CLK/CYC) מפעיל שעתוק של התקופה (לאדם), נצחית (tim). לכל וטים יוצרים קומפלקס והזן את הגרעין, שבו הם לעכב פעילות גנים ברמת השעתוק של CLK/CYC וכתוצאה מכך שעתוק משלהם. Post-transcriptional ו- post-translational לגרום לעיכובים שעתוק CLK/CYC-מתווכת בין דיכוי על ידי לכל / טים, המבטיח את הדור של בערך 24 שעות ביממה תנודות מולקולרית^1,3,4 . נוירונים כ-150 המכיל טופס אלה שעונים מולקולרית מעגל הבקרה להתנהגות היממה של מבוגר טסה⁵. כמה פשוטים אך פונקציונליים לחלוטין היממה מעגל חשמלי המורכב 3 קבוצות של נוירונים שעון - 5 נוירונים לרוחב הגחון (LNvs; 4 LNvs PDF-חיובי, LNv PDF-שלילי אחד, ראה להלן), 2 1s נוירון הגבי (DN1s) ו- 2 2s נוירון הגבי (DN2s) - נמצא הזחל המוח^6,7.

המעגל פשוט היממה זחל מציע מודל מצויין ללמוד את האינטראקציות בין תקשורת בין-עצביים של שעון מולקולרי. באמצעות הכתבת פלורסנט פיתח לכל-TDT, אשר מחקה את הרמות לכל חלבון ומיקומו subcellular, חיפשנו לאפיין את הדינמיקה של המכני מולקולרית ב שעון שונות תת-קבוצות נוירון במעגל היממה זחל ⁸. יתר על כן, לדעת תפקיד מפתח של neuropeptide פיזור פיגמנט הגורם (PDF) המיוצר על ידי LNvs 4 בוויסות מקצבים השעון הביולוגי-ברמה העצבית^9,10,11, רצינו לבדוק הישירות השפעת PDF על השעונים מולקולרית. לשם כך, פיתחנו שיטה כדי לפקח על ביטוי גנים היממה מקצבים במוח זחל explant על פני ימים מרובים על-ידי קונפוקלית זמן לשגות. הפרוטוקול הותאמה גם עבור מבחני תרופתי לבחון את ההשפעה של PDF או תרכובות אחרות ברמה של פי-TDT. לפיכך, ההסתגלות מורכב לנגישים התרבות explant המוח ליישום סמים, הגדלת רזולוציה טמפורלית, הדמיה עבור משך קצר יותר.

Ex-vivo תרבות של דרוזופילה מוחותיהם של שלבים התפתחותיים שונים היו שנקבעו קודם^{12,13,14,15,16,17 ,18}. והואיל פרוטוקולים אלה שימשו הדמיה תופעות ביולוגיות שונות, חלקם אינם תואמים דימות ברזולוציה תא בודד או אינם תומכים התרבות יותר מאשר מספר שעות. שיטות אלטרנטיביות לביצוע הדמיה חיים לטווח ארוך של היממה נוירונים בדרוזופילה כוללים ביולומינסנציה הדמיה מולקולרית מקצבים^19,20,21 קרינה פלואורסצנטית הדמיה של מחוון סידן עם^22,של מיקרוסקופ אור גיליון²³. למרות ביולומינסנציה הדמיה ניתן להשיג רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, מיקרוסקופ אור גיליון ניתן להתאמה עבור הדמיה ויוו , הם מוגבלים על הרזולוציה המרחבית, דורשים מערכות מיקרוסקופים מיוחדים.

השיטה המתוארת כאן המותאמים באופן חזותי אותות פלואורסצנט בתרבות כל המוח ברזולוציה תא בודד על פני ימים מרובים. שיטה זו נתיישב ופסיביות יכול להיות מותאם כדי התמונה תרבותי המוח לטוס למבוגרים ו לניסויים תרופתי ללמוד הרבה בעיות שונות מצאו דרוזופילה .

Protocol

1. הכנת מלאי פתרונות ברדס תרבות

1. להכין 400 מ של 1 x בינוני הפעיל שניידר (SAM) אופטימיזציה עבור ex-vivo תרבות של המוח זחל (שונה ההתייחסות^24,25) (טבלה 1). Aliquot ל מ ל ו- flash להקפיא במצב חנקן נוזלי (LN₂), לאחסן ב- 80 מעלות צלזיוס.
2. להכין 1 x Dissecting, תמיסת (DSS) על-ידי המדללת 10 x מניות פתרון (שונה ההתייחסות²⁶) (טבלה 2).
3. פיברינוגן aliquot 10 מ ג, חנות ב 4 ° C לשימוש בודד.
   התראה: שוקלים פיברינוגן תחת זרימה שכבתית, לבש כפפות, כפי שהוא מזיק.
4. להכין פתרון מניות תרומבין סאם (1500 NIH יחידה/mg) aliquot כדי 10 µL, פלאש להקפיא LN₂ , לשמור ב-80 מעלות צלזיוס.
   התראה: ללבוש כפפות בעת טיפול תרומבין כמו זה מזיק.
5. Aliquot מניות פתרון של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין. לשמור ב-20 ° C.
6. חותכים עיגולים של ממברנות טפלון (PTFE) (ראה טבלת חומרים) בגודל שמתאים בתוך צלחת תחתית זכוכית. יש לשטוף אותן ב- 70% EtOH ולאחר מכן כניסה בלוק dH₂O. Sterilize ויבש תחת זרימה שכבתית עם UV. להשאיר צלחת פטרי סטריליות. שימוש אחד.
   הערה: PTFE היא קרום נקבובי גמיש זה מאפשר חילוף הגזים ומונעת בינוני מתאדים במהלך ההקלטה לטווח ארוך.

2. זמן לשגות מיקרוסקופ ההתקנה

הערה: ההגדרה הבאה עבור מיקרוסקופ קונפוקלי סורק הפוכה טנדם (ראה טבלת חומרים) מצויד עם סורק תהודה (8,000 Hz). המערכת כוללת גלאי צילום-מכפיל מאוד רגיש, המונע יחד עם סורק תהודה של phototoxicity ו- photobleaching. טמפרטורה ולחות מבוקרות בתוך תא סביבתיים מיקרוסקופ זה (ראה טבלת חומרים) מכסה את רוב המיקרוסקופ.

1. במקום חדר לחות הבמה-העליון.
2. הפעל את בקרי טמפרטורה ולחות כדי equilibrate את התא מיקרוסקופ כדי 25 ° C ו- 80% לחות.
3. ביצוע ניסויים בחשכה קבוע (DD), מכסה תא סביבתיים מיקרוסקופ בד אטום (אלא אם כן התא מיקרוסקופ מורכב של חומר אטום).
4. אם משתמש מטרה טבילה במים, מיקום מתקן מיקרו טבילה מים מעל המטרה, תוכנית פרוטוקול עם התוכנה Autoimmersion המטרה בקר כדי לוותר על מים בקצב קבוע במהלך דימות זמן לשגות.
   הערה: טבילה במי מטרות יחד עם מתקן מים או עדשה אובייקטיבית יבשה של מומלצים עבור הדמיה חיים לטווח ארוך, כמו סוג אחר של טבילה בינוני להתייבש.
5. במקום בעל פטרי על הבמה, בתוך תא לחות.
6. להפעיל את התוכנה מיקרוסקופ ובחר את מצב סורק תהודה מתוך תיבת דיאלוג הראשון. בחר ב'אישור ' כדי לאתחל את הבמה כאשר תתבקש לעשות זאת. לכי אל הכרטיסיה ' תצורה ' תצורת החומרה כדי לעבור על הקווים הרלוונטיים לייזר.
7. לעבור ללשונית ידרשו לחלונית XY בחר מצב דו-כיווני ולהגדיר את התמונה רכישה פרמטרים.
   הערה: מתואר הדמיה ההגדרה המובאת כאן (איור 2, איור 3 וסרט 1) ממוטבת להתבונן ביטוי היממה של עיתונאים פלורסנט ספציפיים. הפרמטרים הבאים נבחרו מיטבית שלנו מפרט: 40 X מים טבילה אובייקטיבי, X 8 קו ממוצע עם רזולוציית התמונה × 512 512. עבור הדמיה ססגוניות, ייבוא תמונות רציפים נדרש כאשר אורך הגל פליטה של fluorophore אחד, אורך הגל עירור חפיפה אחר (כאן, אורכי הגל של החלבון הניאון צהוב (YFP) פליטה ו עגבניות עירור חפיפה). לבחור את מצב סדרתית "בין מחסנית" הוא הכי מהיר, התנועה של נוירונים השעון היא זניחה במהלך רכישת Z-במחסנית. מיקרוסקופ הגדרות צריכות להיות להתאים בהתאם מטרת ניסוי.

3. התקנה של המוח זחל Explant תרבות

הערה: כל התהליך מן דיסקציה להטבעת של המוח explants לוקח ~ 30 דקות.

1. הכנת ריאגנטים ברדס תרבות.
   1. להפשיר את aliquot של תרומבין ולשמור בטמפרטורת החדר עד השלב ההטבעה (שלב 3.3). שימוש אחד.
   2. הפשרת במהירות של aliquot של סאם ב 37 מעלות צלזיוס ולשמור בקירור לשימוש בודד.
   3. הוסף סם aliquot 10 מ ג של פיברינוגן כדי 10 מ"ג/מ"ל, קפיצי בעדינות ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות, במהלך השלב ההטבעה (שלב 3.3). שימוש אחד.
      הערה: לא דגירה של פיברינוגן פתרון יותר 2 h שזה יתחיל פולימריזציה.
   4. להפשיר aliquot של x 100 מניות פניצילין-סטרפטומיצין. להכין 2.5 מ של סם המכיל 1 x פניצילין-סטרפטומיצין (סאם/אנטיביוטיקה). לשמור בטמפרטורת החדר.
      הערה: חנות הנותרים x 100 מניות פניצילין-סטרפטומיצין ב 4 ° C עד חודש.
   5. להכין את aliquot של 500 µL מסם הנותרים. לשמור על הקרח.
   6. עבור הדמיה לטווח ארוך, למרוח משחה ואקום בלוק לחלק התחתון של המנה התחתון זכוכית (איור 1 א') פלסטיק ולחטא תחת זרימה שכבתית עם UV.
2. דיסקציה של חוט עצבי במערכת העצבים המרכזית ו הגחוני /.
   1. לנקות את המלקחיים ו- 2 x כלי חיתוך הזכוכית שלוש-. טוב עם 70% EtOH. יוצקים µL 400 של DSS לתוך בארות 4 ו- 400 µL של סאם היטב אחד. לשמור על הקרח.
   2. לקצוץ לטוס בינוני המכיל הזחלים ולבחור שאינם נודדים השלישית לחלל הזחלים (L3) עם מלקחיים. לשטוף אותם במרוכז בבארות 2 מלא DSS. שמור אותם הבאר השלישית DSS מלא בקרח זה anesthetizes את הזחלים.
      הערה: L3 נמשכת כ 2 ימים ב- 25 ° C. להתבונן המוח בתוך פרק זמן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בחרנו להשתמש שאינם נודדים הזחלים L3. קבוצות אחרות של השעון הנוירונים, כגון l-LNvs, DN3s, מתחילים להיווצר על נדודים L3 הבמה אבל הם לא בהכרח רכיבה על אופניים עדיין (נתונים לא מוצג). לכן, למרות שפעולה זו אפשרית על תמונת אופניים שעון נוירונים בשלב זה (נתונים לא מוצג), חשוב להבחין היטב הנוירונים פונקציונלי כבר שעון זחל מלפתח אלה לניתוח נתונים. Non-נודד L3 מופיעים כ- 4-4.5 ימים לאחר ביצה הנחת ב 25 º C. כדי להשתמש בפרוטוקול זה ללימוד השעון הביולוגי, לסנכרן (entrain) הרימות מתפתחות ב 12 h/12 h LD מחזורי 25 ° c 3 ימים לפני איסוף L3 הזחלים.
   3. לנתח את המוח זחל עם מלקחיים בסדר בתוך הבאר 4 מלא DSS, אשר לא נעשה שימוש עבור שטיפה הזחלים, באמצעות שיטה הפוכה²⁷.
      1. בקצרה, לחתוך הזחל לשתיים, ברכות לצבוט את הווים הפה עם זוג מלקחיים, סכם מבפנים ומבחוץ הקיר הגוף באמצעות זוג מלקחיים, ובכך חושף בפני המוח אחרים. חינם המוח על ידי חיתוך כל קנה הנשימה ואת העצבים לצרף אותו לשאר חלקי הגוף.
      2. תשאף המוח ב- 3 µL של DSS עם פיפטה 20 µL (מראש שטפה עם DSS), לוותר על הבאר מלא סם. חזור על התהליך עבור המוח עד 7.
         הערה: ניתוח צריכה להתבצע על משטח קר לשמור את הזחלים ומורדמת והמוח מקורר. לדוגמה, במקום המנה לנתיחה על בלוק קירור מחוברת משאבה לזרום מים מקורר-קרח. דיסקציה ההליך לוקח ~ 30 הוא לכל המוח. חשוב לשמור את הדיסקים דמותי העין/antennal המצורפת את המוח ואת חוט עצבי הגחון ללא פגע. קורעת את החלקים הבאים נזק למוח, להפחית את האיכות של התרבות. כמו כן, למנוע חשיפת המוח לאוויר. לפני כ רפה בעברית המוח הראשון, פיפטה למעלה ולמטה DSS המכילים חלקים של הזחלים גזור, כפי שהוא מונע את השכל נצמדים לקיר של הקצה.
3. הטבעה של המוח explants במטריצה תלת-ממד, הרכבה (~ 20 דקות).
   1. להטביע מוח ביתור הפתרון עובד פיברינוגן (פיברינוגן הריכוז הסופי ~3.3 מ"ג/מ"ל, µL 10.5 לכל המוח) כדלקמן:
   2. האחות µL 3.5 של סאם/אנטיביוטיקה (עם עושה שימוש בסעיף 3.2.3). האחות מוח גזור מן הקרע היטב לתוך קצה פיפטה אותו בלי dispensing המדיום סאם/אנטיביוטיקה בקצה.
   3. לוותר על המוח ועל המדיום על המכסה של צלחת פטרי סטריליות. מוסיפים עוד 3.5 µL של סאם/אנטיביוטיקה µL 3.5 של פיברינוגן חמים/סאם 10 מ"ג/מ"ל פתרון על המסירה המכיל את המוח. לערבב בעדינות את הפתרון סביב המוח על ידי pipetting עם טיפ פיפטה 20 µL.
      הערה: באמצעות פיפטה ולא מלקחיים בשלב זה מונע והדגיש את המוח.
   4. לקחת 2 µL של הפתרון עובד פיברינוגן מהמסירה ולהחיל אותו על coverslip של המנה התחתון זכוכית בצורת מעגל קטן. מוסיפים µL 0.8 של תרומבין ומערבבים מהר מאוד עם טיפ פיפטה. פיברינוגן מומר פיברין, יתחיל פולימריזציה.
   5. לקחת את המוח יושב של פיברינוגן עובד פתרון (שלב 3.3.1) בין זוג מלקחיים ומקם אותה על המטריקס פעם מטריצה לבן של פיברין הוא גלוי. אוריינט אל הצד הקדמי של המוח למטה (עבור הדמיה שעון נוירונים). לדחוף למטה קרוב ככל האפשר אל הזכוכית המכסה. Clot פיברין מורכב שכבות של פיברין. בחר שכבה אחת ומקפלים אותו מעל המוח בתנועות עדינות וקטנות ללא ניתוק של המטריקס.
      1. חזור על פי 2 עד פי 3 מחלקים שונים של קריש הדם כדי לייצב את המוח.
         הערה: בעת טיפול המוח עם מלקחיים, יש להיזהר לא לייבש אותו או לכפות אותו הלחץ הפיזי.
   6. הוסף 20 µL של סאם/אנטיביוטיקה על המוח מוטבע כדי להפסיק את הפעולה של תרומבין.
   7. חזור על הפעולות כדי לטעון את השכל הנותרים. . זה ניתן להטביע עד 5 עד 6 המוח על צלחת תחתית זכוכית.
   8. הדמיה חיה לטווח ארוך, הוסיפו 600 µL של סאם/אנטיביוטיקה בבאר הפנימי (החלק זכוכית). מקם חתוכות מראש PTFE קרום על גבי המדיום ולתקוע אותו לגריז ואקום חלה על חלק הפלסטיק התחתון (3.1.5) (איור 1 א').
   9. עבור מבחני תרופתי, למלא קערה עם 2 מ"ל של סאם/אנטיביוטיקה (איור 1B).
      הערה: חשוב מאוד למנוע אידוי של המדיום, osmolality של המדיום הוא קריטי הכדאיות של נוירונים. לכן, לניסויים הדמיה לטווח ארוך, יש צורך לאטום את המנה תרבות עם PTFE קרום. ואילו לניסויים לטווח קצר, איטום ממברנה אינה נדרשת עוד המנה הוא מלא עם 2 מ"ל של מדיום, בפיקוח תא humidified.

4. ייבוא תמונות בצילום מואץ

1. הצב את הצלחת התחתונה זכוכית בקופסת פטרי תא לחות הבמה-העליון.
2. עבור z-מחסנית לוח בכרטיסיה ידרשו ולהגדיר את השלבים z-סעיף מתוך התוכנה מיקרוסקופ (2 מיקרומטר × ~ 40 בניסויים שמוצג באיור 2 , איור 3ו 1 סרט). לקבוע את תחילת z-מחסנית המטוס המרוחק ביותר את coverslip ואת הקצה על פני השטח של explant המוח, קרוב coverslip. למרות המוח תנועות הם זניחים, להוסיף תוספת z-סעיפים ההתחלה ואת הסוף של הערימה-z.
3. ללכת לסמן ומצא ייבוא תמונות במקומות מרובים בחלונית והתקנה. עם מטרה X 40, 1 האונה במוח יכולה להילכד בתוך תצוגה של שדה
4. ללכת xyzt בחירה (z-מחסנית בצילום מואץ) ובחלונית מצב של רכישה. עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את הפרמטרים של מרווח זמן ותדירות הזמן המועדף.
   הערה: לרכוש תמונות בצילום מואץ בתדירות הרצויה. שימו לב כי הדמיה חיים לטווח ארוך (24-72 שעות) עם זמן לשגות מרווח זמן קצר יותר מאשר 2 h נוטה תוצאות בנוירונים אופניים פחות, כנראה משום שהיא מקטינה את הכדאיות של נוירונים. הנפח מרחיב כמו קצב רכישת התמונה עולה, מה שהופך ניתוח נתונים ואחסון מאתגרת יותר.

5. טיפול תרופתי של המוח Explants עם Short-term לחיות הדמיה

הערה: ההליך הבא מיועד בעיקרו של דבר זהה לזה הדמיה לטווח ארוך אך אינה דורשת PTFE קרום. למנוע חשיפת המוח כדי אור כחול כאשר החומר הכימי מתווסף אל התרבות, המיקרוסקופ יוצב בחדר חשוך עם אור אדום.

1. עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את מרווח הזמן הרצויה ומספר סריקה כדי להשיג את נתוני התוכנית הבסיסית לפני יישום סמים. הפעל סריקה.
2. לאחר התוכנית הבסיסית השלמת הסריקה, וכשמרימים את הראש סריקה של המערכת מיקרוסקופ. הסר את המכסה של בקר לחות הבמה-העליון, בזהירות להסיר את המכסה של המנה התחתון זכוכית מבלי להזיזו.
3. הסר את הכמות המתאימה של תרבות בינוני במידת הצורך. מוסיפים את הפתרון ניסיוני במדיום ומערבבים, בזהירות, בעדינות רבה, עם פיפטה פסטר סטרילי מבלי לגעת explants את המוח.
   הערה: עבור יישום אמבט של PDF, השתמש 2 מיקרומטר פתרון PDF מניות (ב 10% דימתיל סולפוקסיד).
4. החלף את המכסים את הצלחת התחתונה זכוכית תא לח, ואת הראש הסריקה. אם משתמש, למקם מחדש את הבד אטום שחור סביב התא מיקרוסקופ.
5. בדוק אם המוח נמצאים במיקום המקורי שלהן במצב סריקה בשידור חי. התאם במידת הצורך.
6. עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את מרווח הזמן הרצויה ומספר הסריקה. הפעל סריקה.
   הערה: כאן בדקנו תמונות בצילום מואץ רכשה כל שעה עבור עד 10 שעות.

תוצאות

כאן, אנו מראים את התוצאות נציג של ההקלטה לטווח ארוך של עיתונאי פלורסנט היממה ב- ex-vivo המוח זחל תרבות, ואת תוצאות הדמיה בשידור חי של PDF יישום אמבטיה על הכתב ביטוי.

Non-נודדים הזחלים L3 לבטא את שעון מולקולרי כתב לכל-TDT ואת UAS-mCD8::YFP מונע על ידי נ?...

Discussion

כאן אנחנו תיאר את שיטת עבור קרינה פלואורסצנטית לטווח ארוך זמן לשגות מיקרוסקופ של המוח זחל בתרבית. ההצלחה של ניסויים מסוג זה תלויה גורמים רבים, כגון הבריאות של התרבות, שיטת הנייח של המוח explant, עוצמת קרינה פלואורסצנטית יחס אות לרעש של הכתב, הזמני, רזולוציה מרחבית, ו נגישות explant. גורמים אלה יכול...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1000
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T0167
Succinic acid	Sigma-Aldrich	S9512
Fumaric acid	Sigma-Aldrich	F8509
α-Ketoglutaric acid	Sigma-Aldrich	K1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Fibrinogen from bovine plasma	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T9549	CAUTION: Health Hazard, use gloves
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	custom made
Vaccum grease	Sigma-Aldrich	18405
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes	fisherscientific	08-772A
Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm	Millipore	SCGPS05RE
Polytetrafluoroethylene (PTFE) film	Dupont	200A Teflon FEP Film
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RS
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLGV033RS
Three-well glass dissection dish	Any company
Fine forceps, size 5, Dumont	Fine Science Tools	11254-20
Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors	Leica microsystem CMS GmbH
Temperature control chamber	Life Imaging Services	The CUBE & BOX temperature control system, custom designed
Stage-top humidity controller	Life Imaging Services	custom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software	Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift plugin	ImageJ software
10x iterative deconvolution	AutoQuant and Imaris software