כרומטין יליד Immunoprecipitation באמצעות המוח מאתר הגידול Neurospheres

Summary

מנגנוני epigenetic משתנים לעתים קרובות ב glioma. כרומטין immunoprecipitation יכול לשמש כדי לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים ב glioma הנובעות משינויים שינויים היסטון המסדירה שעתוק גנים ומבנה כרומטין. פרוטוקול זה מתאר כרומטין יליד immunoprecipitation על המוח מאתר הגידול neurospheres.

Abstract

שינויים epigenetic עשוי להיות מעורב של התפתחות והתקדמות של glioma. שינויים מתילציה וכן acetylation של היזמים ואזורים הרגולציה של oncogenes, מדכאי הגידול יכול להוביל שינויים בביטוי הגנים, יש תפקיד חשוב בפתוגנזה של גידולים במוח. כרומטין מקורי immunoprecipitation (ChIP) היא טכניקה פופולרית המאפשרת זיהוי שינויים או חלבונים אחרים הלחוצים ל- DNA. בניגוד לשבב צולבים, יליד שבב, התאים לא מטופלים עם פורמלין לקשר covalently חלבון ל- DNA. זה יתרון כי לפעמים crosslinking עלולה לתקן את החלבונים בלבד transiently אינטראקציה עם ה-DNA, אין משמעות תפקודית הכונה. בנוסף, בדרך כלל גדלים נוגדנים נגד פפטידים מבולבל. לכן, ירידה לפרטים נוגדן מתגברת בשבב מקורית. עם זאת, חשוב לזכור כי השבב יליד ישימה רק ללמוד שינויים היסטוניים או חלבונים אחרים בחוזקה לאגד את הדנ א. פרוטוקול זה מתאר את immunoprecipitation כרומטין מקורית על המוח מאתר הגידול neurospheres.

Introduction

אירועים epigenetic שכיחים ב gliomas, סביר לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה הגידול. אכן, ילדים glioma בדרגה גבוהה, מוטציות בגנים קידוד היסטון גרסאות H3.3 ו- H3.1 מתרחשים לעתים קרובות¹. מוטציות משפיעות על שינויים היסטון ויש השלכות epigenetic הגדולות^2,3. הנער המתבגר לקשת למבוגרים, חוזרים ונשנים מוטציות בגן isocitrate דהידרוגנאז 1/2 (IDH1/2), מוטציה אשר מעכב α-ק ג היסטון תלויים ו- DNA דה-methylasaes, שינויים גנטיים של הרגולטורים כרומטין אחרים כגון ATRX ו- DAXX מתרחשים ⁴. לכן, יש חשיבות קריטית כדי ללמוד איך מוטציות המשפיעות על הרגולטורים epigenetic לשנות הכרומטין ושינויים רגולטוריים היסטון, אשר, בתורו, יש השפעה דרמטית של transcriptome של תאי הגידול.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) הוא כלי רב עוצמה המשמש כדי להעריך את ההשפעה של שינויים epigenetic הגנום^6,5,, או⁷. בצ'יפ מקורי, כרומטין מתעכלת עם נוקלאז micrococcal (MNase), immunoprecipitated באמצעות נוגדן שהועלו כנגד החלבון של עניין, ולאחר מכן הדנ א הוא מטוהרים מורכבים כרומטין⁶immunoprecipitated. התאים אינם מתוקנים במהלך ההליך אז טכניקה זו ישימה רק לצורך המחקר של חלבונים המקיימים אינטראקציה באופן הדוק עם דנ א⁶. העדר cross-linking עזרי נוגדן ירידה לפרטים מאז נוגדנים גדלים בדרך כלל נגד פפטידים או חלבונים מבולבל⁷. בנוסף, מכיוון שאין שום צעד cross-linking, זה מפחית את הסיכוי של תיקון אינטראקציות חלבון-אן ארעי, כי הם לא ספציפית ותקינה לא^7,8. שבב יכול לשמש כדי לזהות את העשרת של היסטון שינויים באזור גנומית מסוים. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול עבור ביצוע צ'יפ מקורי ב- neurospheres (NS) המופקים גנטית מהונדסים העכבר מודלים של glioma.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.

1. דור של גידול במוח NS ו culturing תנאים.

1. להכין בינוני תאי גזע עצביים (המל ל) עם תוספת ששינה נשר בינוני/F12B27 (1 x) של Dulbecco, תוספת N2 (1 x) ו של ריאגנט מיקרוביאלית. תוספת לבטחון לאומי בינוני ביום של שימוש עם האדם רקומביננטי צמיחה אנדותל (EGF), basic-פיברובלסט גורם גידול (FGF)-ריכוז סופי של 20 ng/mL בכל.
2. זירוז הגידול במוח העכבר באמצעות מערכת transposon היפהפייה הנרדמת בהם פלסמידים קידוד oncogenes או shRNA מיקוד הגידול מדכאי מוזרק לתוך החדרים הצדדיים של neonates ליצירת גידולים במוח ספונטנית⁹. בחר עכבר עם גידול גדול, אשר אושר עם ביולומינסנציה הדמיה.
   הערה: מידע מפורט יותר אודות המבנה ישן היופי Transposon ומערכת פלסמיד בשימוש ניתן למצוא ב- Calinescu. et al. ⁹.
   1. לשיקוף העכברים, להזריק 100 µL של 30 מ"ג/מ"ל luciferin פתרון intraperitoneally באמצעות מחט מד 26.
   2. 5 דקות לאחר ההזרקה של luciferin, עזים ומתנגד החיה באמצעות חדר הרדמה עם זרימת חמצן/איזופלוריין מוגדר כ- 2% איזופלוריין.
   3. מתי החיות הם מרדימים (בדרך כלל 2-3 דקות), מקום החיות בבית הבליעה ביולומינסנציה עם חמצן איזופלוריין מוגדר כ- 2% איזופלוריין. אם בעלי החיים תחת הרדמה יותר מ 5 דקות, השתמש משחה אופטלמולוגיות למניעת יובש תוך תחת הרדמה.
   4. תמונה העכברים באמצעות יישום ויוו אופטי הדמיה המערכת עם הפרמטרים הבאים: חשיפה אוטומטית, binning גדול, צמצם f = 1. הפרמטר לשקול את זה גידול גדול הוא ביולומינסנציה > 10⁶ פוטונים/s/ס מ²/sr.
3. המתת חסד את העכבר עם מנת יתר של שאיפה איזופלוריין הרדמה בחדר סגור, בדוק על ידי צביטה הבוהן כי החיה. הוא מורדם, לערוף את העכבר.
4. לחלץ את המוח, לנתח את זה. כפי שתואר לעיל ב-. Calinescu et al. ⁹.
5. מקם את המוח 10 ס מ פטרי. אם הגידול המושרה מבטאת את החלבון הניאון, שימוש פלורסנט לנתח מיקרוסקופ להגדיר את הערוץ המתאים פלורסנט, 0.3 X הגדלה, לזהות אחרת מסת הגידול על ידי ההבדלים רקמה צבע ומרקם. להשתמש באזמל ומלקחיים כדי להפריד את רקמת הגידול מהמוח נורמלי.
6. מינצ הגידול לחתיכות קטנות בצלחת פטרי. מקום הגידול ביתור צינור 1.5 מ עם 300 µL של המדיום לבטחון לאומי.
7. השתמש כבעלי צניפה פלסטיק חד פעמיות מתאימה לקירות של שפופרת חרוט microcentrifuge כדי homogenize בעדינות את הגידול. להוסיף 1 מ"ל של מדיום ניתוק התא, דגירה המדגם למשך 5 דקות ב 37 º C.
   הערה: השימוש כבעלי עלולה להרוג כמה תאים. אם הקורא רוצה למקסם את הכדאיות תא, השימוש כבעלי יכול להיות מושמט.
8. לעבור התליה תא מ שלב 1.7 דרך מסננת תא מיקרומטר 70 ולשטוף את מסננת עם 25 מ של המועצה לבטחון לאומי בינוני.
9. Centrifuge את המתלים ב g x 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, decant את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה לתוך 6 מ של המועצה לבטחון לאומי בינוני.
10. צלחת התליה תא הגידול מהשלב 1.9 לתוך בקבוקון תרבות T-25, תרבות זה ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה עם אווירה של 95% אוויר ו-5% CO₂. בדרך כלל לאחר 3 ימים, יהיו תערובת של כמה תאים מתים, מודבקת תאים ותאים קצת ויוצרים NS אשר לצוף, המדיום.
11. העברת התליה תא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, לאסוף רק התאים ששוקעים בתחתית באמצעות micropipette, צלחת אותם מחדש לתוך בקבוקון תרביות רקמה T-75.
12. לשמור על התאים-צפיפות גבוהה יחסית (1-3 X 10⁶ תאים T-25). המעבר את התאים כאשר הם confluent.
    הערה: Confluency נקבע לפי גודל הספירות. שחור מרכזי של כדורים גדולים אומר כי שם הם תאים מתים במרכז ולא מציינים כי התאים צריכים להיות passaged מיד.
13. הוסף את גורמי גדילה (EGF ו- basic-FGF; 20 ng/mL כל) כל שלושה ימים. לשנות את המדיום כאשר התאים אינם confluent וכתום בהיר את תורות בינוני.
14. כדי לשנות את המדיום, לאסוף את המדיום הישן centrifuge זה ב g x 300 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ו מחדש להשעות בגדר תא במדיום לבטחון לאומי בתוספת EGF ו- FGF-ריכוז שצוין בשלב 1.1.
    הערה: אם הכדורים נמצאים באמצע-confluency גבוהה, אך לא מוכנים להיות passaged (בגודל כדור הוא קטן עם מיקרומטר < 100 קוטר), אז בגדר ניתן לחלק את שתי המבחנות.
15. כדי המעבר את התאים, centrifuge את התאים ב g x 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, decant את תגובת שיקוע, דגירה התאים במדיום ניתוק התא עבור 5 דקות ב 37 º C.
    1. הוסף 5 מ של תמיסת מלח מאוזנת לבינונית ניתוק שתדללו ' centrifuge זה ב g x 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. Decant את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 18 מ של המועצה לבטחון לאומי בינוני, לחלק את המתלים באותה מידה שלוש מבחנות T-25.
16. כדי להקפיא את aliquots של תאים, התאים כמו שלב 1.15 מביצועם, להקפיא את התאים aliquots 1 מ"ל של 90% נסיוב שור עוברית עם 10% דימתיל סולפוקסיד. לאט לאט לקרר את התאים על ידי הצבת את התאים על קרח למשך 10 דקות, ואז להשאיר את התאים-20 ° C למשך 30 דקות, ו- 80 ° C עבור יום אחד. למחרת, להעביר את התאים מיכל אחסון בחנקן נוזלי.

2. יליד שבב

1. הכנה כרומטין
   1. לאחר ביצוע מלאי של NS נגזר, תרבות NS ב T-75 ב- 15 מ"ל של המועצה לבטחון לאומי בינוני-37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה עם אווירה של אוויר 95% ו- 5% CO₂ עד NS הופכים confluent. לוח T-75 confluent אחד תניב 3-5 X 10⁶ תאים.
   2. כאשר התאים הופכים confluent, צנטריפוגה NS-300 גרם x במשך 5 דקות, decant את תגובת שיקוע והוסף 1 מיליליטר דיסוציאציה תא בינוני. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק הוסף 5 מ של מדיום ולספור את התאים באמצעות hemocytometer¹⁰.
      הערה: עונה 1 פרק 10⁶ תאים נדרשים לכל תגובה immunoprecipitation (IP). שים לב נסיוב החיסון מראש או שליטה IgG חייב גם להיות כלולים¹¹.
   3. Centrifuge את NS בצינור microcentrifuge 1.5 mL אחד ב g 300 x במשך 5 דקות, decant את תגובת שיקוע מחדש להשעות NS גלולה עם 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת, להעביר את המתלים חלבון נמוכה איגוד 1.5 mL microcentrifuge צינורות.
   4. NS צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות, decant את תגובת שיקוע ו מחדש להשעות בגדר תא ב- 95 µL עיכול מאגר (50 מ מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 מ"מ CaCl₂, 0.2% פוליאתילן גליקול octylphenyl) לכל עונה 1 פרק 10⁶ תאים בתוספת פרוטאז מעכב קוקטייל-ריכוז גבוה (1: 100). מיד pipet התאים למעלה ולמטה כדי למנוע clumping, הימנע מיצירת בועות.
   5. Resuspend MNase גליצרול 50% כדי להפוך פתרון 1 מ"ג/מ"ל (1.15 יחידות/µL, המאוחסנים ב-20 ° C) יטופלו כמו "1 x" מניות. להפוך "0.1 x" מניות על-ידי ביצוע לדילול 1:9 השני עם 50% גליצרול (למשל., 900 µL של אקס 1 MNase ו- µL 100 של 50% גליצרול) ואחסן אותו ב-20 ° C.
   6. µL מיקס 5 של "0.1 x" MNase ו- 145 µL עיכול המאגר. שמור את האנזים על קרח כל הזמנים. להוסיף 5 µL של MNase מדולל במאגר העיכול לכל עונה 1 פרק 10⁶ תאים. קפיצי הצינור כדי מערבבים ומניחים את הצינור בבלוק 37 ° C עבור בדיוק 12 מינימלית תהליך הדגימות אחד בכל פעם כדי להבטיח מועד מדויק דגירה של 12 דקות.
   7. להוסיף 10 µL של 10 x MNase לעצור את המאגר (110 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 55 מ"מ EDTA) לכל עונה 1 פרק 10⁶ תאים. דוגמאות חייב להישמר בקירור, מנקודה זו ואילך.
   8. להוסיף µL 110 "מאגר x RIPA 2" (280 ממ NaCl, octylphenyl כ- 1.8% פוליאתילן גליקול, 0.2% נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות), 0.2% נה-deoxycholate, 5 מ מ אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (EGTA); מאוחסן ב 4 ° C) בתוספת מעכב פרוטאז קוקטייל-ריכוז גבוה (מטריים) לכל עונה 1 פרק 10⁶ תאים. קפיצי צינור כדי לערבב.
   9. Centrifuge צינורות למשך 15 דקות microfuge ב 4 ° C, g x. 1700 להעביר את תגובת שיקוע mL 1.5 קבוע חדש microcentrifuge צינורות (צינורות microcentrifuge מחייב חלבון נמוכה הם כבר לא נחוץ) ולאחסן אותם על קרח. להתעלם בגדר.
2. Immunoprecipitation (IP)
   1. מערבבים חלבון A לבין חלבון G beads מגנטי על יחס 1:1. עבור כל IP, להכין µL 25 של חרוזים.
   2. לשטוף את החרוזים על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר ריפה (10 מ מ טריס pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, 140 מ"מ NaCl, 1% פוליאתילן octylphenyl גליקול, 0.1% מרחביות, 0.1% נה-deoxycholate; מאוחסן ב 4 ° C) בתוספת מעכבי פרוטאז-ריכוז נמוך (1:1000).
   3. השתמש מגנט כדי לאפשר חרוזים להפריד בין הפתרון כביסה decant הפתרון כביסה (כ- 1 דקות). בצע את שלב לשטוף פעמיים.
   4. מחדש להשעות את החרוזים לאמצעי האחסון המקורי באמצעות מאגר ריפה בתוספת מעכבי פרוטאז (1:1000).
   5. אם נחוץ, שתדללו כרומטין באמצעות מאגר ריפה בתוספת מעכבי פרוטאז (1:1000) כך כל IP יש נפח של 100-200 µL. שומרים 10% של אמצעי האחסון המשמש לכל ה-IP של כרומטין הקלט.
      הערה: לדוגמה, אם 200 µL משמשים לכל IP, µL 20 של כרומטין מדולל צריך להיות שמורות עבור הקלט. סה"כ ארבעה IPs, נפח כרומטין הכולל צריך להיות מדולל כדי 820 µL.
   6. הכינו את הקלט. להוסיף 100 µL טה מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 1 מ מ EDTA) בתוספת proteinase K (0.5 mg/mL) לקלט, דגירה הקלט ב 55 ° C עבור 1 h.
      הערה: ניתן לבצע צעדים 2.2.6-2.2.7 יחד עם שלבים 2.3.4 ו 2.4.1.
   7. לטהר את הקלט באמצעות ערכת טיהור PCR ההוראות של היצרן, elute ב µL 50 • תנאי המאגר שסופק בערכה.
   8. למדוד את הריכוז של הקלט באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume ולהקליט את התוצאות במחברת. ריק עם מאגר • תנאי של קיט.
      הערה: ב- neurospheres העכבר, השתמשנו כ 6 µg של ה-DNA עבור כל ה-IP.
   9. לרוץ קלט על 1% ג'ל או לטעון µL 1 על Bioanalyzer ה-DNA באמצעות הגדרות רגילות. אחסן את השארית לשימוש כקלט ביישומים במורד הזרם.
   10. להוסיף 10 µL של שטף חלבון A & G beads מגנטי עבור כל ה-IP ואת תקופת דגירה IP של h 1-4 מעלות צלזיוס.
       הערה: לדוגמה, להוסיף 30 µL של חלבון A & G beads מגנטי עבור שלוש כתובות ה-Ip.
   11. מניחים את הדוגמאות על מגנט ולאפשר חרוזים להפריד. לחלק כרומטין על ידי העברת הסכום שנקבע בעבר לתוך צינור 1.5 mL החדש.
   12. מוסיפים הנוגדן, לעטוף את כמוסות עם פרפין פלסטיק הסרט כדי למנוע התאיידות. דגירה הדגימות בן לילה ב 4 ° C עם סיבוב על סל ד 20.
       הערה: ריכוז צריך להיקבע מדעית בעקבות המלצות היצרן.
   13. למחרת, ספין הצינורות באמצעות צנטריפוגה מיני בטמפרטורת החדר, 2000 x g, עבור 10 s. לאחר מכן להוסיף 10 µL של חרוזים כל IP, תקופת דגירה IP של h 3-4 ° C עם סיבוב על סל ד 20.
3. IP שוטף ועיכול חלבון
   1. להוסיף 150 µL מאגר ריפה בתוספת מעכבי פרוטאז-ריכוז נמוך (1:1000) ל- IP כל דגירה IP ב 4 ° C עם סיבוב ב rpm 20 עבור 5 דק המקום המדגם על דוכן מגנטי ומאפשרים את החרוזים מגנטי להפריד. השתמש pipet כדי להסיר את תגובת שיקוע. חזור על זה שוטף חמש tep.
   2. להוסיף 150 µL LiCl מאגר (250 מ מ LiCl, 10 מ מ טריס pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, 0.5% NP-40, 0.5% נה-deoxycholate; חנות ב 4 ° C) בתוספת מעכבי פרוטאז-ריכוז נמוך (1:1000) ל- IP כל, דגירה IP ב 4 ° C עם סיבוב ב rpm 20 עבור 5 דק המקום המדגם מגנטי לעמוד ' ואפשר beads מגנטי להפריד. השתמש pipet כדי להסיר את תגובת שיקוע.
   3. להוסיף 150 µL של טה קר (לא מעכבי פרוטאז) דגירה המדגם ב 4 ° C עם סיבוב ב rpm 20 עבור 5 דק המקום המדגם על דוכן מגנטי ומאפשרים beads מגנטי להפריד. השתמש pipet כדי להסיר את תגובת שיקוע.
   4. לאחר השלב הסופי כביסה, מחדש להשעות את הדגימה ב 100 µL טה מאגר בתוספת proteinase K (0.5 mg/mL), דגירה המדגם ב 55 ° C עבור 1 h.
4. טיהור DNA ו- PCR בזמן אמת כמותיים שבב (qPCR)
   1. לטהר immunoprecipitated הדנ א באמצעות ערכת טיהור PCR. לאחר תוספת של מאגר דנ א איגוד הערכה כדי כל דגימה, הנח את השפופרת על מגנט והמתן עד beads מגנטי צבירה, ואז להעביר את תגובת שיקוע על העמודה ' ניקוי '. בצע הוראות היצרן, elute ב µL 50 • תנאי המאגר שסופק בערכה.
   2. כדי לבדוק אם ה-IP הוא מוצלח, לבצע את qPCR. באופן אידיאלי, תחל צריך להיות מיועד לאזורים בקרה חיובית ושלילית.
      הערה: לדוגמה, עבור IP הופיעה עם H3K4me3 ו- H3K27me3, הדוגמאות הבאות צריכה לפעול על qPCR: H3K4me3, H3K27me3 ואג ChIP הדנ א, קלט דנ א, ו אין תבנית פקד (NTC) באמצעות תחל עבור אזורים כדי להיות מועשר H3K4me3 (בקרת חיובי), אזורים כדי להיות מועשר H3K4me3 (שלילית שליטה); כמו כן, עבור H3K27me3.
   3. בצע פרוטוקולים סטנדרטיים לבצע qPCR¹². בקצרה, לבצע qPCR באמצעות SYBR מיקס מאסטר ירוק, 0.5 µL של 10 מיקרומטר עבודה ריכוז כל פריימר ואחורה µL 2 של צ'יפ או קלט את הדנ א. קרא צלחות באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת. פריימר רצפים ניתנים בטבלה מס ' 2. הרצפים פריימר Gapdh מהואנג ואח. היו בשימוש¹³.
   4. ניתוח נתונים שבב יחסי הקלט, קרי, אחוז קלט שיטה (% IP)¹⁴. לחשב את אחוז קלט באמצעות הנוסחאות הבאות:
      מותאם קלט = ct רשע (קלט)-כניסה₂(DF)
      איפה DF הגורם דילול של הקלט המוצא,
      DF = הנפח הכולל של IP / נפח של קלט
      % IP = 100 × 2 ^ (מנוכה קלט - Ct (IP))
      איפה Ct היא הגורם הסף.

תוצאות

ייצוג סכמטי של הגידול NS שנוצר בגלל גידול במוח תאים סרטניים במוח איפה Katushka חיובי מוצג באיור1. איור 2 היא ייצוג סכמטי של הטכניקה שבב כולו. איור 3 מראה התוצאות נציג של כרומטין של גידול במוח NS מתעכל עם MNase למשך 12 דקות, מניב רוב מונ?...

Discussion

פרוטוקול המובאת כאן יאפשר למשתמש לבצע צ'יפ מקורי-NS נגזר גידולים במוח מהונדסים גנטית. בניגוד cross-linking שבב, פרוטוקול זה מוגבל לצורך המחקר של חלבונים המשייכים בחוזקה דנ א⁶. ניתן לשנות את מספר התאים להשתמש לפי הצורך, וניתן לשנותם הפרוטוקול. השתמשנו עונה 1 פרק 10⁶ תאי ה-IP, עם זאת, י...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerated	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612	qPCR reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor
Glycerol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
H3K4me3	Abcam	Ab8580
H3K27me3	Millipore	07-449
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	inhalation anesthetic
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Low binding microtubes	Corning Costar	CLS3207	low protein binding microcentrifuge tube
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normal Rabbit IgG	Millipore	12-372
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot and store at -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	for dissection of tumor
Sodium Chloride	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sodium Dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Standard Mini Centrifuge	Fisherbrand	12-006-901	standard mini centrifuge
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	flourescent dissecting microscope
ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block	Applied Biosystems	4453535
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W