במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

Summary

שתי שיטות מוצגים כאן כדי לקבוע פונקציה מכשול המעי. מטר אפיתל (וולט/אוהם) משמש עבור מדידות של ההתנגדות החשמלית transepithelial של epithelia בתרבית ישירות בבארות תרביות רקמה. בעכברים, שיטת gavage FITC-לתוספי משמשת כדי לקבוע את חדירות המעי ויוו.

Abstract

המכשול מעיים מגן נגד מיקרואורגניזם פתוגניים, הרעלן מיקרוביאלי. תפקידה מוסדר על ידי צומת חזק חדירות ושלמות תאי אפיתל, שיבוש של הפונקציה מכשול המעי תורמת התקדמות המחלה במערכת העיכול ומערכתית. שתי שיטות פשוטות מתוארים כאן כדי למדוד את החדירות של אפיתל המעי. במבחנה, קאקו-2BBe תאים הם מצופים בבארות תרביות רקמה כמו טפט ואת ההתנגדות החשמלית של transepithelial (TER) נמדד על ידי מד אפיתל (וולט/אוהם). שיטה זו שהתחפש בשל פעולה ידידותי למשתמש הדיר. אין ויוו, עכברים הם gavaged עם 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי, ריכוז FITC-לתוספי נמדדים סרום שנאספו דגימות עכברים כדי לקבוע את החדירות אפיתל. Gavage אוראלי מספק מנה מדויקת, ולכן היא השיטה המועדפת כדי למדוד את חדירות המעי ויוו. יחדיו, שתי שיטות אלו יכולים למדוד את החדירות של אפיתל המעי בתוך חוץ גופית ו ויוו, ומכאן לשמש כדי לחקור את הקשר בין מחלות ותפקוד מכשול.

Introduction

תאים אפיתל המעי אחראים לא רק על ספיגת חומרים מזינים, אך גם טופס מכשול חשוב כדי להתגונן מפני מיקרואורגניזמים פתוגניים ורעלים מיקרוביאלי. פונקציה זו מכשול המעי מוסדר על ידי צומת חזק חדירות ותא אפיתל שלמות^1,2,3, תפקוד לקוי של הפונקציה מחסום האפיתל מזוהה עם מעי דלקתיות המחלה (מחלת המעי הדלקתי). הטבעת actomyosin perijunctional (PAMR) שוכנת בתוך התא הוא קשר הדוק ורציף צמתי צר. ההתכווצות של PAMR, אשר מווסת על ידי הרשת אור צולבות הקישור חוטים שרירן (MLC), חיוני לוויסות של צומת חזק חדירות^{4,5,6,7,8, 9,10}. הגידול נקרוזה מקדם (TNF) הוא מרכזי מכשול המעי אובדן אפיתל המעי upregulating קולטני MLC קינאז (מיק) ביטוי וגרימת הפנמה occludin^11,12,13.

יונים כגון Na⁺ ו- Cl^– תוכלו לחצות את החלל paracellular על ידי מסלול נקבובית או דליפה¹⁴. האפיתל "דולף", שינויים ב- TER משקפים בעיקר צומת חזק שינו חדירות. טר המדידה היא גישה אלקטרופיזיולוגיות נפוץ לכמת צמוד לצומת פרמאביליות, בעיקר ל נה⁺ ו- Cl^-, מבוסס על התנגדות של תא monolayers. סוגי תאים שונים, כולל תאים אפיתל המעי, תאי אפיתל ריאתי של תאי אנדותל כלי הדם, דווחו למדידות טר. היתרונות של שיטה זו הם כי TER המידות הם בלתי פולשני, ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תאים חיים בזמן אמת. בנוסף, טר מדידה טכניקה שימושית עבור מחקרים רעילות התרופה¹⁵.

קאקו-2BBe תאים הם תאים אנושיים אפיתל המעי הגס אדנוקרצינומה עם מבנה ותפקוד הדומה הבדיל קטן בתאי אפיתל המעי: לדוגמה, תאים אלה יש microvilli ואנזימים הקשורים עם מברשת קטנה מעיים הגבול. לכן, monolayers קאקו-2BBe בתרבית מנוצלים כמודל במבחנה לבדיקת תפקוד המחסום.

בעכברים, דרך אחת ללמוד paracellular מעיים חדירות היא על ידי מדידת היכולת של FITC-לתוספי שיוקמו לומן לדם. לפיכך, חדירות המעי יכול להיות מוערך על ידי gavaging FITC-לתוספי ישירות לתוך ומדידה של זריחה בתוך הדם של עכברים. הפרוטוקול הבא מתאר שתי שיטות פשוטות כדי להעריך את חדירות אפיתל המעי גם במבחנה וגם בתוך vivo.

Protocol

מחקר זה אושרה על ידי טיפול בעלי חיים, שימוש בפרוטוקול של קיימברידג-סודה גנומית מרכז משאבים (פקה-סו), אוניברסיטת שבחיים.

1. ציפוי ותחזוקה של קאקו-2bbe על ממברנות פוליקרבונט נקבובי

1. לגדל תאים בבקבוקון T75 עם מדיה (DMEM המכיל 10% FBS). מבחנות צריך להיות מוזן באופן קבוע, בהתאם צפיפות התאים.
   הערה: עבור ציפוי אופטימלית, התאים צריכים לחלק במהירות, בעלי צורה שטוחה "הביצה", המציינת כי תאים הם בשלב הצמיחה.
2. לאחר תאים 80% confluent, לקחת את הבקבוק מתוך החממה ולהסיר את המדיה. לשטוף כל המדיה שיורית עם 1-2 מ של PBS סטרילי (ללא Ca^{2 +}). Pipet 1.5 mL טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק ובעדינות סלע את הבקבוקון; אז, במקום את הבקבוקון בחממה 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בלי נדנדה.
3. בעוד התאים הם trypsinizing, המקום מוסיף המכיל ממברנות פוליקרבונט נקבובי (גודל הנקבוביות, מיקרומטר 0.4; פני השטח, 0.33 ס מ²; ראה טבלה של חומרים) לוחות 24-. טוב. הוסף 1.0 מ"ל של תרבות התקשורת בבית הבליעה הבזליים (הרווח התחתונה של הקרום).
4. Pipet מ של מדיה לתוך הבקבוק ואת נמרצות pipet התאים כנגד הצד + בקבוקי שתייה צידניות 5 - 10 פעמים כדי להשיג רופף, בודדים תאים או 2-3 תא מתגבש.
5. צלחת 0.166 מ של תאים (להשגת יחס דילול של 1:8) אל החדר הפסגה (הרווח העליון של הקרום). דגירה ב 37 ° C עד 3 שבועות.
   1. להאכיל תאים שלוש פעמים מדי שבוע על ידי בקפידה כ רפה בעברית המדיה מן התא הבזליים של כל טוב באמצעות משאבה ללחץ. בעדינות לטפטף 1 מ"ל של מדיה לתוך התא הפסגה של כל הוספה.

2. השימוש אפיתל מטר (וולט/אוהם) למדידת טר

הערה: לאחר כשלושה שבועות של תרבות על ממברנות פוליקרבונט, קאקו-2BBe תאים הם מוכן למדידה טר.

1. ללימודים ציטוקינים, יום אחד לפני המדידה, החלף את המדיה הבזליים המדיה המכילה 10 ננוגרם למ"ל של IFNγ. ביום של הניסוי, החלף את המדיה HBSS המכילים 2.5 או 7.5 ננוגרם למ"ל של TNF.
   הערה: טיפול IFNγ מגביר ביטוי הקולטן TNF 2 (TNFR2)¹⁶.
2. כדי לתקן את המונה, הכנס האלקטרודה תיקון לתוך יציאת קלט ובחרו מצב "אוהם". התאם את הבורג R שם תואר עם מברג עד מד מציג קריאה של 1,000 Ω.
3. לעקר את האלקטרודות על-ידי הצבתם אתנול 70% למשך 15-30 דקות ולאחר מכן אפשר אותם לאוויר יבש עבור שטיפה ס' 15 האלקטרודה בתקשורת תרבות תא ניסיוני.
4. מאתחל את המחשב, ובחרו את מצב "אוהם". בזהירות המקום את הקצוות רב הגשרים אלקטרודה לתוך תא הבזליים, את הקצוות קצר אל החדר הפסגה. ודא כי האלקטרודות יותר לגעת בקרקעית של המנה, תוך שמירה על האלקטרודות קצר מתחת לפני השטח של התקשורת אבל מעל את הכיסויים תרביות רקמה. שמור האלקטרודות אנכי.
5. למדוד את ההתנגדות של התוספות מדגם ומוסיף ריק (קרי, שהתרבות מוסיף ללא תאים אבל עם HBSS)-0, 1, 2, 3, 4 שעות לאחר הטיפול ציטוקין. להקליט את ההתנגדות.
6. כדי להשיג עקביות על-פני צלחת שונה תבניות, לחשב התוצר של ההתנגדות ואת אזור ממברנה יעיל:
   
   עבור מוסיף 24-. ובכן, זהו אזור ממברנה יעיל 0.33 ס מ².

3. מודל מאתר לתוספי סולפט נתרן (DSS)-induced קוליטיס

1. להוסיף DSS מים בלוק ריכוז סופי של 3.5% (wt/כרך).
2. לנהל 3.5% DSS לעכברים C57BL/6 זכר בן שבוע 8 עבור סכום כולל של 7 ימים. לתת שתייה רגילים ללא DSS בקרת עכברים.
   1. לעבור את המים המכילים DSS שתייה רגילים לאחר יום 7.
3. שוקל עכברים ולהעריך קליניים עשרות העכבר כל כל יום. לנרמל את משקל הגוף של כל בעכבר כדי משקל הגוף הראשונית שלו. ציונים מוגדרים בהתאם לחומרת המחלה ע י ארבעה פרמטרים: צניחה של פי הטבעת (0-2), צואה עקביות (0-2), דימום (0-2), פעילות (0-2)⁵. לסכם את התוצאות של פרמטרים אלה בשביל ניקוד קליניים הסופי.
4. כדי לנתח את המצב histopathological של רקמת המעי הגס, המתת חסד עכברים באמצעות הזרקת בקרום הבטן (i.p.) 1.2% (vol/כרך) Avertin (0.6 מ"ל/10 גרם משקל) 7 ימים טיפול פוסט-DSS. כדי להכין מלאי של 100% avertin, מערבבים 10 גרם של 2,2,2-tribromoethanol עם 10 מ ל אלכוהול טרט-ניטריט.  לאחסן בחושך ב 4 º C. כדי להשתמש, לדלל מניות 100% ל-2% במים.
5. לבודד את המעי הגס ואת המעי האטום, למדוד את האורך של המעי הגס⁵.
6. חותכים פלחי 0.5 ס מ מן המעי הדיסטלי תיקון צינור בז 15 מ"ל, המכיל 10 מ"ל של 10% פורמלין בן לילה. לשטוף את הרקמות קבוע עם אתנול מדורגת (75, 95 ו- 100%), קסילן. להטביע את הרקמות פרפין וחותכים סעיפים 6 מ מ עבור hematoxylin & אאוזין מכתים⁸.

4. מודדים את החדירות מחסום האפיתל DSS-induced קוליטיס בעכברים

1. למדוד את החדירות מכשול 7 ימים לאחר תחילת ניהול DSS.
2. ביום של וזמינותו, מהיר עכברים במשך 3 שעות.
3. אוטוקלב gavage מחט כדי להבטיח עקרות, ואז gavage עכברים עם µL 150 80 מ"ג/מ"ל 4 kDa FITC-לתוספי במים סטריליים, ולשמור את לתוספי-FITC שאינן בשימוש כדי למדוד את העקומה רגיל אחרי אוסף סרום. שוקלים העכברים לחישוב חדירות.
   הערה: הפתרון FITC-לתוספי צריכה להיעשות במים.
4. בעזרת זוג מספריים, קליפ קטע 1 ס מ של הזנב, לאסוף 100 µL של דם מן הזנב לתוך צינורות איסוף סרום. לסובב את הדם שנאספו ב 10,000 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לדלל את הנסיוב 1:4 במים. כדי להפוך לסטנדרט לעקומה, לדלל שאינם בשימוש FITC-לתוספי עם מים ליד 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000, 1:10, 000, 1:30, 000, 1: 100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000 ו- 1:3, 000, 000. להוסיף 100 µL/טוב של הסרום והדוגמאות עיקול רגיל 96-ובכן לוחות.
6. קרא את זריחה בקורא צלחת עם פליטה עירור/528 485. לחשב את הערכים חדירות בהתבסס על העקומה סטנדרטי, להכפיל ב- 4 לתיקון הדילול.
7. לחלק את הריכוז של FITC-לתוספי לפי המשקל לנרמל את הערכים (זה עוזר לנרמל את ההבדל בין FITC-לתוספי משלוח אם עכברים חולים. ואני איבדתי משקל).

תוצאות

בתרבות, קאקו-2BBe התאים ינבכ טפט, להבדיל לאט לתוך בוגרת enterocytes ספיגת ידע שיש גבולות מברשת. ב פרוטוקול זה, קאקו-2BBe תאים מצופים עם צפיפות גבוהה על ממברנות פוליקרבונט, והגיע תאים 100% confluency יום אחד לאחר זריעה. עם זאת, תאים הם מובחן בשלב זה: להבחין באופן מלא את התאים, התקשורת השתנתה כ...

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. קאקו-2BBe (מברשת הגבול-לבטא) תאים משמשים תמיד למדידה טר, שנבחרו מתוך שורת תאים קאקו-2 עבור ביטוי של חלבונים מברשת-הגבול. קאקו-2BBe התאים להיות פנוטיפ ספיגת ידע סיסי כאשר הבדיל לחלוטין (לאחר כשלושה שבועות של תרבות פוסט-הנהרות)¹⁷. זה הכרחי כדי למנוע זי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G gavage needle	VWR	20068-608
4 kDa FITC-dextran	Sigma	46944
Avertin	Sigma	T48402
Black 96-well plates for fluorescence	Fisher	14-245-197A
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Caco-2BBe cells	ATCC	CRL-2102
Dextran sulphate sodium	MP Biomedicals	2160110
DMED with high glucose and sodium pyruvate	Hyclone	SH30243.01B
Epithelial (Volt/Ohm) Meter	Millicell-ERS	MERS00002
Ethanol	Sinopharm ChemicalReagent	10009218
Falcon tube (15 mL)	Corning	430791
FBS	Gibco	10437-028
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
Fluorometer	Biotek	Synergy 2
HBSS			138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose
IFNg	PeproTech	315-05-20
Modular Tissue Embedding Center	Leica	EG1150H
Serum collection tubes	Sarstedt	41.1378.005
T75 flask	corning	430641
TNF	PeproTech	315-01A
Parraffin	Sigma	A6330-1CS
Polycarbonate membranes (Transwell)	Costar	3413
Pressure pump	AUTOSCIENCE	AP-9925
Rotary Microtomy	Leica	RM2235
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Xylene	Sinopharm ChemicalReagent	10023418