JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

סרטן רדום ופעיל תא פנוטיפים מאופיינים באמצעות הדמיה שלב כמותית. מבחני התפשטות ההעברה, מורפולוגיה תאים משולבים, מנותח בשיטה פשוטה אחת.

Abstract

רכישת פנוטיפ האנגיוגנזה היא מרכיב חיוני של הבריחה מן הגידול תרדמה. למרות מספר הקלאסי במבחנה מבחני (למשל, הפצה, העברה ואחרים) ומודלים ויוו פותחו כדי לחקור ולהעמיד לאפיין פנוטיפים תא האנגיוגנזה, הלא-אנגיוגנזה, שיטות אלו הן זמן עבודה אינטנסיבית, ולעיתים קרובות דורשים ריאגנטים יקר, מכשירים, כמו גם מומחיות משמעותית. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו תקופה כמותיים הרומן הדמיה (ה-QPI) טכניקה לנהל את אפיוני בצילום מואץ ללא תיוג של תאים KHOS האנושי אוסטאוסרקומה האנגיוגנזה, הלא-אנגיוגנזה. פאנל של פרמטרים הסלולר, כולל תא, התפשטות, חיות וצורות, נמדדו באופן כמותי, נותחה באמצעות ה-QPI. מרומן זה ואף הגישה הכמותית מספקת הזדמנות ללמוד באופן רציף, לא פולשני תהליכים תאיים הרלוונטיים, התנהגויות, ואת מאפייני תאים סרטניים, סוגי תאים אחרים בצורה פשוטה משולב. הדו ח מתאר פרוטוקול הניסוי שלנו, כולל הכנה תא, ה-QPI רכישה של ניתוח נתונים.

Introduction

אחד המחסומים המוקדם התפתחות, התקדמות של גידול מוצק הוא הרכישה של פנוטיפ אנגיוגנזה, סימן היכר של סרטן. התקדמות זו כוללת מגוון רחב של תהליכים הביוכימי והמולקולרי1,2,3. אתגר טכני במחקר של שלב זה מפתח בהתקדמות הגידול היא היעדר כלים כדי לאפיין באופן רציף ולא באופן כמותי להבדיל בין פנוטיפים האנגיוגנזה, הלא-אנגיוגנזה של תאים סרטניים חיים בצורה בלתי לא משוחדת. מבחני מסורתי בשימוש כדי לחקור את התנהגויות הסלולר של תאים האנגיוגנזה ושאינם-אנגיוגנזה בדרך כלל דורשים ריאגנטים יקר וכלי נגינה, למשל, התפשטות/נדידת תאים מבחני4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 או משלימים ויוו הערכות4,5,6,8,15,16, וכן הדורשים מומחיות משמעותית לטיפול נמרץ צריכת זמן ודיני.

לאחרונה, שלב כמותיים הדמיה (ה-QPI) התפתחה טכניקה חדשנית המאפשרת הערכת זמן לשגות ללא תיוג מגוון רחב של התא מורפולוגיה והתנהגות פרמטרים17,18,19, 20 , 21 , 22. בניגוד קונבנציונאלי מיקרוסקופ אופטי, ה-QPI מכמתת וריאציות של המופע. ההתחלתי על ידי פיקסל פיקסל אחרי האור עובר דרך עצם אופטי, ומשחזרת הולוגרף עם המומר אופטי עובי ונפח, ובכך מאפשר הישיר ניתוח של תאים חיים, התכונות הבאות: הדמיה (1) כמותית, הדמיה (2) לא פולשנית, זמן לשגות, (3) ללא תווית ההדמיה וה הדמיה multi-parameter (4) בו זמנית. תכונות אלה להפוך את ה-QPI כלי רב עוצמה כדי להעריך ולהבין תהליכים פתולוגיים ברמה התאית.

במחקר שנערך לאחרונה, אנחנו מנוצל ה-QPI לאפיין באופן כמותי, להבדיל בין האנגיוגנזה KHOS-A ושאינם-אנגיוגנזה פנוטיפים KHOS-N של תאים אנושיים אוסטאוסרקומה בצורה שיטתית, תפוקה, שילוב של ניתוח של מורפולוגיה תאים, התפשטות, תנועתיות23. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, פאנל של התא מורפולוגי והתנהגות פרמטרים הושוו באופן כמותי בין תאים אנושיים אוסטאוסרקומה האנגיוגנזה, הלא-אנגיוגנזה וזוהו חמשת ההבדלים האופייני בין שני אלה פנוטיפים. גישה חדשנית זו מספקת פלטפורמה משולבת, כמותיים להערכת מגוון מאפיינים הסלולר רלוונטי מבחינה ביולוגית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי החולים ועדת בוסטון לילדים אבטחה מוסדיים.

1. תא הכנה

  1. מפשיר KHOS-A ו- N תאים
    1. לחמם תרבות בינוני, כלומר, של Dulbecco ששינה בינוני נשר בתוספת 10% עגל עוברית (vol/כרך) סרום (FBS) ו- 1% (vol/כרך) פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. קח את הבקבוקונים קריוגני של תאים ממיכל חנקן נוזלי, לטבול התחתון של הבקבוקונים לתוך מים חמים בתוך אמבט מים 37 ° C, לנער בעדינות את הבקבוקונים ההקפאה כדי להאיץ את תהליך שהביקושים. לשמור את המכסה של בקבוקונים קריוגני פנייה אל המים כדי למנוע זיהום. ברגע תאים הם הקרת, לעקר את המבחנה הקפאה על ידי ריסוס 70% אתנול פתרון. ותנגב את המבחנה.
    3. ב תא למינארי, מיד תשאף התליה תא מ המבחנה קריוגני, וכן להשעות בעדינות 10 מ"ל חימם תרבות בינוני (שמתואר 1.1.1). צנטריפוגה תא המתלים כ 200 x g למשך 5-7 דקות.
    4. Resuspend בגדר תא 10 מ"ל חימם תרבות בינונית ולאחר להעביר לתוך בקבוקון T75. בעדינות פיפטה מספר פעמים להשעות את התאים באופן אחיד בעזרת pipet 10-mL.
    5. להכניס את הבקבוק בתוך חממה 37 ° C עם 5% (vol/כרך) CO2 והאווירה humidified. מאפשרים לתאים לצרף במשך לפחות 12 שעות.
    6. תקופת דגירה תאים של-3-7 ימים עד 80-100% confluent. לשנות את המדיום תרבות כל 2-3 ימים.
  2. פיצול KHOS-A ו- N תאים
    1. הסר את המדיה תרבות הבקבוקון.
    2. לשטוף את התאים עם PBS סטרילי מ ל (1 x) ללא סידן ומגנזיום, כדי להסיר תאים שאינו חסיד או שבר.
    3. להוסיף 1 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA פתרון לתוך הבקבוק, מערבולת בקצרה את הבקבוק כדי להבטיח כי טריפסין-EDTA מפוזרת באופן שווה.
    4. דגירה את הבקבוקון של 2-3 דקות 37 ° C חממה או 3-5 דקות בטמפרטורת החדר. בדוק את התאים במיקרוסקופ בהגדלה x כ- 400 כדי לוודא כי התאים הם מעוגל למעלה ולא מנותק.
    5. ברגע התאים מנותקים, להוסיף 10 מ ל תרבות בינוני, בעדינות pipette המדיום לאורך מספר פעמים כדי לשבור את התא אגרגטים להשעיה תא בודד באמצעות pipet של 10 מ"ל.
    6. ספירת תאים באמצעות מונה התא. זרע התליה תא לתוך מבחנות חדשות T75 צפיפות של 2 × 106 תאים או יחס של 1:4.
    7. מאפשרים לתאים לגדול למפגש 80-100% לפני זריעה לניסוי. ה-QPI.
  3. זריעת KHOS-A ו- N תאים עבור ה-QPI
    1. זרעים KHOS-A ו- N תאים 6-ובכן צלחות על הצפיפות של 50,000-300,000 תאים/טוב מ ל תרבות בינונית לאחר ספירת עם מונה תא.
      הערה: צפיפות זריעה תלויה את קצב התפשטות התאים ולאחר תקופת הזמן דימות על מנת לקבל < 100% זרימה במהלך הדימות רכישה.
    2. דגירה תאים עבור פחות 12 שעות לאפשר קובץ מצורף.
    3. לשנות המדיום עם מדיה טריים לפני ביצוע ה-QPI.

2. ה-QPI רכישה

  1. כיסוי slip להגדיר
    1. לנקות את תלוש כיסוי על ידי שטיפה מספר פעמים עם מים יונים זורמים ולחטא עם 75% אתנול פתרון על ידי טבילה במשך 15 דקות להכניס תגית כיסוי תא סטרילי למינארי להתייבש.
    2. בזהירות המקום בתגית כיסוי לצלחת 6-טוב כדי למנוע בועות ברור. ודא כי התחתון של תגית הכיסוי הוא שקוע התקשורת תרבות (מינימום 5 מ"ל/טוב).
    3. מקם את הצלחת לתוך החממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ואווירה humidified) כדי equilibrate למשך 15 דקות לפחות. אם ערפל מתפתח על תגית לכסות, השתמש ספוגית כותנה סטרילי לנגב את זה נקי.
  2. הדמיה תאים עם מיקרוסקופ
    1. פתח את התוכנה כדי לאתחל את המערכת, כולל כיול עצמי של זמן החשיפה, דוגמת ניגוד הולוגרמה רעש. ודא כי הערכים מקובלים (מוצג בטווח ירוק או צהוב).
    2. מקם את הצלחת 6-ובכן לבמה של המיקרוסקופ ה-QPI.
    3. לחץ על "לחיות ללכוד" ובחר "ידני" ב- "תוכנה פוקוס." גס למקד את התמונות בשלב של תאים על-ידי כוונון המרחק עבודה במסגרת"מיקרוסקופ" כדי להשיג מתאר עבור תאים בתמונות שלב. לשנות באופן "אוטומטי" ב- "תוכנה פוקוס."
    4. לחץ על "ניסוי חדש" כדי ליצור התנסות חדשה. להתחיל עם המבחר של עמדות רכישת התמונה באמצעות העכבר או מקשי החצים על משטח מספריים. לחץ על "זכור" אחרי כל בחירה. בדרך כלל 3-5 מיקומים עבור כל דגימה ייבחרו.
    5. להגדיר את מרווחי הדמיה ואת פרק הזמן במקטע "Timelapse".
      הערה: על כדי לעקוב אחר תאים סרטניים בבירור, המרווחים צריך להיות קצר יותר מאשר 5 דק 48 שעות מוגדר כתקופת זמן עבור שילוב ה-QPI ניתוח.
    6. להתחיל את הניסוי על-ידי לחיצה על "ללכוד", אשר באופן אוטומטי להתרכז, לרכוש את התמונות בנקודות זמן הגדרה.

3. ניתוח נתונים

  1. ניתוח מורפולוגיה תא
    1. לחץ על "לזהות תאים". התאם את מספרי להגדרת "רקע סף" כך תא אזורים מופרדים היטב רעש רקע. התאם המספר להגדרה של "גודל האובייקט" כדי לוודא כי בכל תא יש גרעין אחד. לשמור על פרמטרים עקבית עבור דגימות זה צריך להיות יחסית, כאשר אלה עשויים להשפיע על המדידות השטח והנפח הסופי. לשנות באופן ידני תא מקטעי באמצעות "שינויים ידניים,", במידת הצורך.
    2. השתמש בפונקציה "לנתח נתונים" לתוכנה לנתח תאים. להתחיל ניתוח נתונים חדשים על ידי לחיצה על "ניתוח חדש." גרור תמונות נבחרות "מקור מסגרות" טאב ותא מורפולוגיה הפרמטרים כולל אזור תא (2מיקרומטר), עובי אופטי (מיקרומטר) ונפח (מיקרומטר3) עבור כל תא יחיד. לבחור פיזור מגרש היסטוגרמה מצב וייצוא נתונים או טבלאות או איורים.
  2. ניתוח התפשטות תא
    1. בחר תמונות לפחות 5 נקודות זמן שונות של עניין (למשלהראשונית, 12 שעות, 24 שעות ביממה, 36 h, 48 שעות). מספרי הטלפון הנייד הרשומה המסופקים על-ידי התוכנה.
    2. כדי להעריך את הזמן ההכפלה, להתוות את מספרי הטלפון הנייד לאחר נורמליזציה עם המספרים הראשונית ובכושר עם עקומות גדילה מעריכית.
  3. ניתוח תנועה תא
    1. השתמש בפונקציה "מעקב אחר תאים" בתוכנה. לחץ על "ניתוח חדש" כדי להפעיל ניתוח נתונים חדשים. גרור סדרה של תמונות עבור פרק זמן הנבחר (למשל, 4 שעות לאחר דגירה 24 שעות ביממה) אל הכרטיסיה "מקור מסגרות" לבחור באקראי 10-30 תאים על ידי לחיצה תאים תחת מצב בחירה "הוסף תאים". אל תכלול את התאים על הקצוות ואלה עוזב את שדה הראייה.
    2. בדוק את המעקב אחר בסדרה של תמונות. בכל מקרה שבו המערכת מאבד את תחושת תא או רצועות התא הלא נכון, כוונן באופן ידני את התא מעקב על-ידי לחיצה על "לזהות" כדי לזהות תאים או לחיצה על "שנה מיקום" תחת מצב "בחר" כדי לשנות את מיקום התא.
    3. לבחור מגרש רוז של התא מסלולים ב "מגרש תנועה" או מגרש עבור הפרמטרים האחרים, הקשורות לתנועה ב "מגרש תכונות," כגון תנועתיות מהירות (מיקרומטר/h), תנועתיות (מיקרומטר), העברה (מיקרומטר) והגירה הישירות. לייצא נתונים מטבלאות או דמויות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מציג אפיון מורפולוגיה תאים טיפוסיים. התמונות מוצגות שמעורבת (איור 1 א'-ב') ותמונות 2D (איור 1C-D). תא אופטי עוביים (מחושב מקדם שבירה, מרחק אופטי) הם לכמת באמצעות פרופיל או מדידה התא כולו. פיזור מתווה של האז...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה, אנו מתארים במבחנה, לא פולשנית, ללא תווית שיטה באמצעות ה-QPI לאפיין באופן כמותי את פנוטיפים האנגיוגנזה, הלא-אנגיוגנזה של תאים אנושיים אוסטאוסרקומה. מספר פרמטרים הסלולר יש נותחו בו זמנית בשיטה זו משולבים, תפוקה גבוהה, כולל אזור תא, עובי התא, נפח התאים, קצב התפשטות, הכפלת זמן ההעבר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

המחברים מאשר בתודה את התמיכה של הקרן לחקר סרטן השד ועל קרן מחקר רפואי מתקדם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
T75 flaskCorning, NY, USA353136
6-well plates Corning, NY, USA3506
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA11965092
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals, GA, USAS11550
Penicillin StreptomycinThermo Fisher Scientific, MA, USA15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA10010023
Beckman Z1 Coulter counterBeckman Coulter, IN, USAZ1 
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenM4Microscope
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenPHI 8020
HStudioM4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenHStudioM4Software

References

  1. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  2. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  3. Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
  4. Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
  5. Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
  6. Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
  7. Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
  8. Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
  9. Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
  10. Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
  11. Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
  12. Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001(2012).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395(2012).
  14. Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
  15. Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
  16. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
  17. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
  18. Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  19. Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
  20. Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369(2013).
  21. Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546(2014).
  22. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
  23. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
  24. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000(2014).
  25. Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
  26. Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
  27. Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676(2013).
  28. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976(2015).
  29. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257(2016).
  30. Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved