דם מבוסס מבחן איתור ROS1 ואת RET פיוז'ן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי

Summary

זיהוי של מחזורי חומצה ריבונוקלאית (קרנה) מהדם נמצא צורך בתוכנית האבחון הקליני. כאן נתאר שיטות המאפיינות את קרנה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי רגיש וספציפי. הבדיקות בדרישות עיצוב לאתר גרסאות פיוז'ן בתוך 72 שעות.

Abstract

פיתחנו שיטות הרומן בידוד ואפיון של נגזר הגידול במחזור חומצה ריבונוקלאית (קרנה) לביופסיה נוזלי מבוסס-דם. זיהוי חזקים קרנה התאוששה דם מייצג פתרון צורך קריטי בתוכנית האבחון הקליני. הבדיקה מתחילה עם האוסף של דם לתוך צינורות איסוף דם המכילים חומרים משמרים זה לייצב את קרנה. ללא תא, exosomal, ו- RNA טסיות-הקשורים מנותקת פלזמה במערכת זו הבדיקה. קרנה היא הפוכה עיבד ל- DNA משלימים (cDNA) מוגבר באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (dPCR). דוגמאות מוערכים הן את סמן יעד, כמו גם גן הבקרה. בדיקת אימות כלל מגבלה של זיהוי, דיוק חוסן מחקרים עם דגימות אנליטית. השיטה פותחה בעקבות מחקרים אלו reproducibly לזהות מספר גרסאות פיוז'ן ROS1 (C-Ros proto-oncogene גרסאות 1; 8), RET (לסידור מחדש במהלך תרביות תאים proto-oncogene; 8 גרסאות). זרימת העבודה לדוגמה עיבוד מוטבה כך ניתן להפיק תוצאות הבדיקה באופן עקבי בתוך 72 שעות מיום קבלת מדגם.

Introduction

עד 25% של סרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) חולים אולי לא יש זמינות לבדיקה בעת ביצוע אבחון מספיק רקמות. אפילו במקרים בהם רקמה זמין, זה לא מספיק כמות או איכות לביצוע המומלצים בדיקות מולקולריות^1,2. במקרים שבהם יש מספיק רקמה של ביופסיה עבור פרופיל מולקולרית, חולים שיש לחכות מספר שבועות או יותר לקבלת תוצאות, או להתחיל טיפול ללא תוצאות מולקולרית^3,4. עם זאת, קריטי כי אבחון מולקולרי אינפורמטיבי יהיו זמינים בהתחשב כניסתו של אפשרויות טיפול ממוקד עבור חולים שאובחנו עם NSCLC. בדיקה של מחזורי ללא תא הדנ א (cfDNA) ביופסיה נוזלי הוא פתרון לאתגרים של רקמה מסורתית בדיקות^4,5,6. אפשרויות הבדיקה הנוכחית מוטציות שבידיך NSCLC באמצעות cfDNA ו זרימת עבודה המבוסס על dPCR דומה ' לדור תוצאה מהירה, כוללים את קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) sensitizing מוטציות ΔE746-A750, L858R, EGFR ההתנגדות מוטציה T790M , גרסאות קראס proto-oncogene (קראס), B-Raf proto-oncogene (BRAF) משתנה V600E. אמנם לא כמו בהרחבה אומצו על-ידי השדה במחזור הגידול-derived RNA שליח (mRNA) מבודד ביופסיה נוזלי יכול גם לספק מידע קליני חשוב^7,8,9. יש קודם לכן פיתחה ואנו דיווחו על שיטות זיהוי מרובבת קווצי עור Microtubule הקשורים חלבון כמו 4-אנפלסטית לימפומה קולטן טירוזין קינאז (EML4-ALK) פיוז'ן וריאנטים פלזמה דם¹⁰. במחקר זה, אנחנו האריכו שיטות אלה לכלול יעדים RNA מרובבת מסדר גבוה עבור ROS1 ורט, המכסה שמונה גרסאות פיוז'ן בתוך כל assay. המטרה הייתה לפתח טכניקה מהירה, רגיש, ספציפית, לשחזור איתור אלה גרסאות פיוז'ן של הפלזמה של חולים שאובחנו בעבר עם NSCLC.

תהליך הבדיקה מאותחלת במשרד של רופא בעזרת RNA ייצוב צינורות איסוף דם¹¹. צינורות אלה מכילים משמרים כמו גם מעכבי RNase תא. הדגימות עדיפות שנשלחה ונישלח מרכזי המכללה של קאפ פתולוגים אמריקאי מוכר/קלינית מעבדה שיפור התיקונים (CLIA)-מעבדה מוסמכת (קליני מעבדתי) לעיבוד על-ידי כוח אדם מוכשר. ברגע שהתקבלו על-ידי מעבדה קלינית, כל שלב של עיבוד מתנהל תחת נהלי שאושרו (SOP). דם מלא הוא centrifuged לשחזר את הפלזמה, אשר משמש לאחר מכן כדי לבודד במחזור ה-RNA זה הוא או חופשי בדם או בתוך לבצע moieties, כגון exosomes וטסיות^7,8,9. כדי לבודד RNA של תאים אלה, בחרנו את המערכת להתאוששות RNA המבוסס על השוואות של מספר שיטות החילוץ. הרנ א מבודד הוא מרוכז, הפוכה עיבד כדי cDNA. מספר אנזימים רוורס טרנסקריפטאז, גנים ספציפיים תחל הוערכו בזמן אופטימיזציה של שיטת סינתזה cDNA להגדיל את ROS1 ואת רט היעד התעתיק ההמרה¹⁰. . זה קריטי עבור שפע נמוך במחזור תעתיקים, כגון גרסאות פיוז'ן נגזר הגידול. בסופו של דבר, אנחנו אופטימיזציה ריכוזים פריימר ולאחר בדיקה dPCR כדי לאפשר זיהוי מרובבת של גרסאות פיוז'ן רט או ROS1, הגן בקרה, glucuronidase-β (GUSB). אנחנו ואז לשלב את התנאים הטובים ביותר מכל המחקרים אופטימיזציה פרוטוקול נעול הסופי לפני ביצוע האימות אנליטית המחקרים שתוארו בדו ח זה. פרוטוקול זה ותוצאות אלה מספקים את הבסיס עבור זרימת עבודה מהיר ורגיש איתור שגרתית גרסאות פיוז'ן נדיר במחזור.

Protocol

היצרנים ההנחיות עבור ריאגנטים המפורטות להלן, אלא אם כן שתואר אחרת. מבחני ה-PCR הם מוצרים זמינים מסחרית תוכננה לאתר fusions ROS1 ו רט.

1. עבודה עם ה-RNA כהכנה שעתוק במהופך (RT)-dPCR: מעבדה מומלצות

1. ליצור סביבה נטולת RNase בעת עבודה עם ה-RNA.
   1. השתמש תרסיסים זמינים מסחרית שנועד להשבית RNases מזהמים.
   2. שימוש מוסמך RNase ללא ריאגנטים, טיפים, וצינורות. השתמש בעצות מכשול עבור ערכות-בדיקות ביוץ למניעת החדרת RNases או זיהום צולב של דגימות.
2. תמיד ללבוש מעיל מעבדה כדי למנוע נפילה בין בגדים לתוך דגימת חלקיקים. לייעד את המעיל מעבדה ספציפי לשימוש עם עיבוד RNA.
3. ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום הדגימה מ RNases בעור. משתנים לעתים קרובות כפפות.
   הערה: נניח מעבדה משטחים מזוהמים עם RNase מאז הם חשופים לסביבה. כפפות לפנות העור, השיער, ידיות, ידיות מקפיא, עטים/סמנים, וכו ' הם ההנחה תהיה כבר לא נטולת RNase.
4. Decontaminate פיפטורים, benchtops, צנטריפוגות ומשטחי עבודה אחרים עם ספריי איון RNase לכהן להשתמש.
5. במידת האפשר, לשמור על ערכה של ציוד לשימוש עם ה-RNA בלבד.
6. למזער שיבושים של זרימת האוויר באזורים מעבדה בעת עבודה עם דגימות RNA כדי למנוע חלקיקים מנפילה לתוך דוגמאות או מזהם את משטח העבודה.
7. חנות טהור RNA ב-80 הלעפה תרוטרפמט.
8. הימנע ההקפאה-thaws מרובים של דגימות ה-RNA, כמו זה יכול לגרום השפלה.

2. דור של חומר ה-RNA האנליטי עבור הפקדים חיובי

1. עיצוב באמצעות DNA סינטטיים לאור רצפי mRNA גרסאות פיוז'ן של ריבית¹⁰.
   1. פיוז'ן נתון משתנה, בחר מרצף פיוז'ן mRNA הכוללת את אתר פיוז'ן בתוספת אורך מספיק איגוף מכל צד כדי לכסות את אמפליקון PCR.
   2. בחר רצפי בין 50-250 nt כדי לחקות את הגודל של מחזורי RNA שנלכדה באמצעות פלסמה מועשרת טסיות.
   3. הוספת רצף יזם T7 (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') 5' בסוף הרצף היעד.
2. סדר רצפים סינתטיים כמו חומצה deoxyribonucleic נטושים כפול (DNA) קטעים.
3. לשקם דנ א סינתטי במאגר טריס-EDTA (TE) כדי ריכוז סופי של 10 ng/µL.
4. להמיר 60 דנ א סינתטי ng באמצעות במבחנה שעתוק RNA.
5. לטהר תעתיקים RNA באמצעות ריאגנט מבוססות-פנול/guanidine¹².
   1. כוללים DNase אני, נטולת RNase כדי להסיר תבנית שרידי דנ א.
6. למדוד ריכוז מטוהרים במבחנה RNA באמצעות fluorometer זמינים מסחרית עם צבעי RNA ספציפיים ותקנים. ודא שהרנ א נמצא בטווח מקובל בסטנדרטים שבחרת. דילול עשוי להידרש.
7. לאשר תמלול מוצלחת על ידי אלקטרופורזה בג'ל באמצעות ג'ל agarose 2% מעורבב עם הכתם ג'ל RNA ומגוון גבוה בסולם הרנ א כולל 50-250 nt גודל.
   1. עומס 500 ננוגרם של כל במבחנה -RNA על גבי ג'ל.
   2. הפעל את הג'ל של 5 V/ס מ.
   3. דמיינו להקות יחיד באמצעות תאורה, ולתעד את התוצאות.
   4. אשר תעתיק הצפוי גודל עבור כל אחד גרסאות פיוז'ן (מבוסס על עיצוב בשלב 2.1.2).
8. לאשר זיהוי של כל במבחנה רנ א על ידי שימוש assay PCR הספציפי משתנה בהתאמה RT-dPCR (ראה שלבים 5-8 של פרוטוקול זה).
9. אופציונלי: להכין תערובת equimolar של במבחנה RNA המכיל כל אחד על גרסאות פיוז'ן, הגן שליטה GUSB.
10. אם מתבצע שלב 2.9: לאשר את זיהוי של כל אחד גרסאות פיוז'ן כלול את התערובת שליטה על-ידי dPCR באמצעות מבחני ה-PCR הספציפי משתנה (ראה שלבים 5-8 של פרוטוקול זה).
11. לקבוע ריכוז קלט הרצוי עבור פקדים חיובי אנליטית על-ידי בדיקת ריכוזים ועד 0.25 2.5 fg¹⁰. לבחור ריכוז בהתבסס על פלט מספר העותק המבוקש.
12. בעקבות אישור, להכין 10 µL aliquots לשימוש יחיד של RNA אנליטית לשימוש בקרה חיובית (שלב 4.4), חנות ב-80 הלעפה תרוטרפמט.

3. תורם דגימות

1. איסוף דגימות דם כל אדם 10 מ ל 10 מ ל דם אוסף צינורות (BCT) המכיל כחומר משמר RNA נטול תאים.
   הערה: כל התורמים האנושי יהיה מחקר שימוש ומאשר לא תורם ספציפי או פרטים מזהים יהיה להיות שנאספו בשימוש במהלך הבדיקה.
2. תהליך דגימות דם בתוך מסגרת הזמן שצוין על-ידי היצרן BCT.
3. במאגר לפלסמה אנושית רגילה ניתן לרכוש ממקור מסחרי לשימוש בתוך הפקד חיובי אנליטית. להכין לשימוש יחיד, aliquots 1 מ"ל של במאגר לפלסמה אנושית רגילה, חנות ב-80 הלעפה תרוטרפמט לשימוש עם הפקד חיובי (שלב 4.4).

4. שחזור של מחזורי RNA של פלזמה

הערה: חשוב לעבוד במהירות במהלך הליך זה.

1. צנטריפוגה צינורות דם מלא-200 g x עבור 20 דקות.
2. לאסוף עד 4 מ"ל של פלזמה דם centrifuged אוסף שפופרת באמצעות פיפטה סרולוגית. יש להיזהר לא להפריע או תשאף השכבה המעיל באפי.
3. לבודד במחזור RNA באמצעות ערכת זמינים מסחרית כי יכול ללכוד exosomes, טסיות דם, ללא תא RNA של פלזמה. לבודד RNA מהדגימה בקרה חיובית לצד כל אצווה.
4. להכין את הפקד חיובי כל אצווה של דגימות קליניות כדלקמן:
   1. הפשרת 1 מ"ל איחדו נורמלי לפלסמה אנושית aliquot (שלב 3.3).
   2. הפשרת 10 µL אנליטית RNA aliquot (שלב 2.12).
   3. להכין בקרה חיובית על-ידי הוספת 10 µL אנליטית RNA לתוך הדגימה לפלסמה אנושית רגילה, ברגע אתנול נוספה פלזמה lysate.
5. Elute דגימות מים נטולי נוקלאז µL 100. פנה מיד עם RNA להתנקות וריכוז.
   1. דוגמאות עשויים להיות מאוחסנים על קרח רטוב, מכוסה, במשך שעה אחת.
6. להתרכז RNA בשיטת עמודה מבוסס, elute ב µL 9 RNase ללא מים.
   1. מיד להמשיך בשלב 5, או לשמור דגימות על קרח רטוב במשך שעה אחת.

5. הפוך את שעתוק RNA ל cDNA

1. המר מרוכז מדגם ה-RNA במחזור cDNA באמצעות ערכת התגובה שעתוק במהופך זמינים מסחרית, לרבות תחל אקראי (ראה טבלה 1 עבור רכיבים).
   הערה: גנים ספציפיים תחל אופציונלי, ניתן לעצב עבור המבחן משתנים. תחל מעוצבים בהתבסס על המטרה רצף ה-RNA. השתמש פיוז'ן רצפים משתנה מ- 2.1 צעד.
   1. כוללים לדוגמה שליטה אין רוורס טרנסקריפטאז ודגימת שליטה אין RNA (ראה טבלה 1).
2. לבודד cDNA מתגובה שעתוק במהופך באמצעות עמודה ספין זמינים מסחרית של רכז הדנ א.
   הערה: שלב זה מאפשר הסרה של אנזימים, תחל deoxynucleotide חינם triphosphates (dNTPs).
3. השתמש cDNA מיד ב- PCR תגובות או לאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט.

6. PCR דיגיטלי

הערה: זו PCR היא ספציפית droplet PCR דיגיטלי (ראה טבלה של חומרים).

1. PCR מערבבים אמצעי זהירות.
   1. ללבוש כפפות מעילו ואת nitrile המעבדה חד פעמיות.
   2. שימוש PCR מערבבים ריאגנטים באזור הכנה ריאגנט ייעודי. לא מסתדר עם cDNA באזור הכנה ריאגנט בלבד.
   3. מכסים הגששים תוך כדי עבודה כדי להגן עליהם מפני אור. אור מופרז יכול צילום להלבין את הפלורסנט מחובר המכשיר.
   4. תחבורה תערובות, מכוסה, מוגן מפני אור, לתוך אזור קדם הגברה נפרדת לפני cDNA שיתווספו.
   5. להוסיף cDNA להיבדק כדי לערבב PCR בשכונה נקי PCR ממוקם באזור קדם הגברה.
2. היכונו PCR mixes נפח התגובה האחרונה של 20 µL על פי בטבלה 2.
3. להפיץ PCR mixes + cDNA ללוחות ה-PCR.
   הערה: שימוש במיתאר צלחת כמו מומלץ לקחת מדריך.
4. מכסים את הצלחת באמצעות סילר לאיטום של צלחת נשלף.
5. צנטריפוגה צלחות בקצרה לאסוף דגימות בתחתית הבארות.
6. תערובת על צלחת שאכר על קביעת ערך נמוך מ-10 s.
7. צנטריפוגה צלחות בקצרה כדי לאסוף דגימת בתחתית הבאר.
8. הסר את לוחית סילר לאיטום. לבצע יצירת droplet עבור ה-PCR-cDNA לערבב עם גם מערכת דור droplet ידנית או אוטומטית.
   1. לדור droplet ידנית, העברה מיקס PCR µL 20 דוגמת בארות על הדיו הדור ' droplet '. הוסף µL 70 של שמן דור droplet. מכסים עם גומי אטם והעברת מחסנית לגנרטור droplet ידנית ליזום דור droplet. בעקבות יצירת droplet, להעביר טיפות צלחת PCR טריים באמצעות טיפים מומלצים על ידי היצרן. האחות, לחלק את טיפות לאט, מעל 5 עד 6 s כל אחד, בלי לגעת הפתיחה של קצה droplet מחסנית או צלחת.
   2. לדור droplet אוטומטיות, חותם את הצלחת עם כשסרט האטימה, העברת הגנרטור droplet. להבטיח כל העצות, מחסניות, צלחות במקום לפני תחילת יצירת droplet.
9. בעקבות droplet בדור העברה של טיפות על צלחת PCR טריים, חותם עם סילר לאיטום צלחת עם רדיד אלומיניום, לוחות המחזור התרמי תוך שימוש בהגדרות בטבלה3.
10. לאחר הצנטרפוגה תרמי בניהול הושלמה, לקרוא את הצלחת שימוש בקורא droplet. ליצור פריסה צלחת עבור תוכנת קורא שמזהה את המיקום של פקדים, דגימות, וכדומה, עומס לתוך תוכנת להתחיל לקרוא.

7. נתוני ניתוח, סקירה של דור של תוצאות

1. לנתח את הצלחת לקרוא את התוצאות באמצעות תוכנה זמינים מסחרית.
2. נווטו לתפריט Analyze כדי להציג מתווה דו מימדי משרעת (2D).
3. להעריך את האיכות הכוללת של הנתונים על-ידי בדיקת הנתונים droplet.
   1. הערכת הנתונים עבור מספרים הכוללת אירוע מקובל שימוש בתפריט Events. אם ישנם אירועים פחות מ 10,000 לכל היטב, בקפידה להעריך את הנתונים עבור בעיות נוספות.
   2. בדוק נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית סוטה amplitudes. הבדלים משמעותיים משרעת והבדלים ריכוז בין דגימות שכפל מצביעים על טיפול עניים או ערבוב של דגימות.
   3. ליצור הערות של droplet אשכולות עם דפוסים ספריי על ציר 45 מעלות, הרומז על מצבה העגום של טיפות באיכות ירודה או דגימות בעייתי.
   4. בדוק קודם בקרה חיובית, לא רוורס טרנסקריפטאז (לא RT) ונתוני בקרה RNA לא (NRC). בחר כל שליטה דוגמאות ולבחון אשכול איכות על ידי מגרש 2D. על סף תקין, הפרדה ברורה בין אשכולות droplet בלאו הכי.
4. עבור כל משתנה assay, להגדיר את הסף מבוסס על שליטה בארות.
   1. ספי קבע על מגרשים 2D באמצעות הכלי הכוונת כדי להפריד בין האוכלוסייה droplet כפול שלילי מן האוכלוסייה ג'ין שליטה (המסומנת phosphoramidite 5'-hexachloro-fluorescein-CE בדיקה), ציר ה-y, אוכלוסיית הגן variant, אם להציג ( עם תוויות fluorescein amidite או 6-carboxyfluorescein בדיקה), ציר ה-x.
   2. סכום עותקים מכל קידוח שכפל דגימה בודדת.
   3. מבטאים את תוצאות הבדיקה כמו מספר העותקים variant זוהה.
      הערה: כדי לקבוע את ערך הסף אנליטית שהתקשרת דגימה חיובית או שלילית, להפעיל רגיל מדגם תורם בריא קבע (לפחות 10 דוגמאות בודדות) בתהליך גיבוש ולהקים החיתוך מעל כל אות רקע לזיהוי בשביל המוטציה של ריבית. בנוסף, להקים את מספר העותקים ג'ין שליטה נדרש לקרוא תוצאה חיובית או שלילית. ניתוק ג'ין זה שליטה מתפקד בקרת איכות (QC) כדי להעריך את כמות ואיכות כל מדגם ה-RNA שמעובד פנימי.

8. אימות של תנאי ריאקציה RT-dPCR באמצעות שורות תאים (אופציונלי)

1. כדי לוודא זיהוי של גרסאות פיוז'ן, השתמש שורות תאים זמינים מסחרית לבטא את פיוז'ן ROS1 או רט mRNA של עניין. פעל כדלקמן:
   1. Homogenize קפואה תאים בפתרון מבוסס-guanidinium פירוק ישירות ממצב למצב קפואים. מפשיר אפילו קצרה לפני המגון יכול לגרום RNA השפלה ואובדן.
   2. לבודד RNA תוך שימוש בעמודות ספין סיליקה-הממברנה מיועד RNA.
   3. למדוד את הריכוז של דגימות RNA באמצעות fluorometer עם ריאגנטים ספציפיים RNA ותקנים.
   4. לדלל RNA מבודד לתוך רקע של RNA פראי-סוג פלזמה או ממקור מסחרי אחר.
2. לבצע צעדים מן הפוך שעתוק של רנ א cDNA, PCR דיגיטלי, ניתוח נתונים, סקירה, דור של תוצאות המופיעים בפרוטוקול זה כדי לאשר גילוי של הווריאציה הרצויה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר מערכת הבדיקה שפותחה עבור הגילוי של RNA גרסאות פיוז'ן לשימוש בהמידה של מוטציות הנהג בתוך הפלזמה של חולי NSCLC (איור 1א'). פיוז'ן mRNA היו מוצרים מן הביטוי של rearrangements רט ו- ROS1 הנפוץ ביותר בקרב האוכלוסייה NSCLC מזוהה^{13,14,15,16,17}. מבחני ה-PCR מרובבת תוכננו ואז לזהות על שמונה גרסאות התעתיק הנפוץ ביותר עבור כל מטרה NSCLC בתוך תגובה אחת. Translocations הנפוץ ביותר-מיקומה ROS1 ליצור שיוכי בחלקים 5' של CD74, SDC4, SLC34A2, EZR או TPM3 גנים (איור 1B). Translocations הנפוץ ביותר-מיקומה רט להוביל הסמיכות עם KIF5B, שעבורו assay מכסה שישה צמתים אקסון. שותפים רט נוספים מכוסים כוללים את אלה עם CCDC6 ו- TRIM33 (איור 1C). בסך הכל, מבחני מכסה כ- 88% של ROS1 ו- 99% של RET. שינויים עלולה להתרחש בתוך האוכלוסייה המטופלת NSCLC¹⁷.

ייחודה של הרכיבים assay הוערך קודם באמצעות שמונה בודדים במבחנה RNAs מכילים את רצף ה-mRNA לפי התרשימים פיוז'ן מכוסה על ידי ROS1 או רט מרובב מבחני. לכל מין RNA נבחנה נגד כל assay variant בודדים שכוללת את הגירסה מרובבת. היה לא אשיג של מבחני אלה, ובכך הפגנת 100% ירידה לפרטים אנליטית בתוך תוכנן מרובב מבחני (נתונים לא מוצג). כדי לקבוע את הגבול התחתון של זיהוי של פרוטוקול הבדיקה, הכולל RNA נגזר שורות תאים ביטוי variant פיוז'ן הכלולים וזמינותו היו מעורבבות רקע של RNA נורמלי בריכוזים 5%, 1%, 0.2% ו- 0.04%. מרובבת רט ו ROS1 variant PCR מבחני זוהה רק 0.2% פיוז'ן variant (איור 2א-ב). בנוסף, הכנה של 5% הנחה-יעד שורת התאים נגזר RNA (ביטוי של התעתיק פיוז'ן EML4-ALK) לא זוהה עם מרובבת ROS1, RET מבחני, בהמשך מדגימים ירידה לפרטים (איור 2א-ב).

דיוק בדיקה של תהליך RT-dPCR בוצע עבור שני ROS1 ומעובדים מיל' אנליטית בקרת החומר מורכב equimolar במבחנה RNAs היה בריכוזים שלוש (גבוהה, בינונית, נמוכה) דרך שעתוק במהופך, dPCR על שלוש הזדמנויות שונות בתוך באותו היום (אינטרה-יום), על שלושה ימים רצופים (inter-יום), ועם שני אופרטורים (inter-מפעיל). תוצאות בדיקות הדיוק הפגינו זיהוי מדויקת של התעתיק פיוז'ן מעניינים, כמו גם בקרת גנים, GUSB, אשר נכלל בתור מדד QC פנימי (איור 2C-D).

בנוסף בקרה פנימית של GUSB, שכל אצווה של דגימות קליניות הופעלה עם קבוצה של פקדים אצווה. פקד חיובי פותחה מתערובת של אנליטית חוץ גופית ב RNA מיוצגים כל אחד גרסאות פיוז'ן נבדק ב- RT-dPCR, כמו גם אנליטית במבחנה RNA עבור GUSB. RNA הזה נמזג לפלסמה אנושית רגילה lysate במהלך החילוץ-RNA, עובדה לצד הדגימות קליניים לאורך כל הפרוטוקול. הפקד רוורס טרנסקריפטאז (לא RT) לא היה פקד שלילי כדי לאשר את העדר של חומרים מזהמים בתהליך מיצוי העבודה RNA ומדגימים יחודיות של תחל עבור ה-RNA. הפקד RT לא נוצר באמצעות מאותו חומר כמו הפקד חיובית, אך היא אינה כוללת אנזימים בתוך התגובה סינתזה cDNA. אין RNA הפקד (NRC) הוא פקד שלילי כדי לוודא העדר מזהמות תעתיקים ברכיבי התגובה של שעתוק במהופך. פקד זה הוכנס שזרימת העבודה בשלב סינתזת cDNA, מים נוספה בהתגובה במקום תבנית ה-RNA. הפקדים לא RT ו- NRC חייב להיות שלילי בשני ערוצים, אם תוצאות מדויקות כדי להיגאל. טבלה 1 מציגה את רכיבי התגובה שעתוק במהופך עבור כל פקד. דוגמאות של החלקות 2D עבור כל אחד מהפקדים הללו מוצגים עבור ROS1 (איור 3 A-C), מבחני מולטיפלקס RET (איור 3 E-G). גרסאות פיוז'ן אותרו באמצעות בדיקה amidite (FAM) fluorescein, מיוצגים לאורך ציר ה-y, ואילו הגן בקרה, GUSB, זוהתה באמצעות בדיקה 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (הקסדצימאלי) והוא בציר ה-x. פקדים אצווה אלה היו העריכו במשך 21 ימים כדי לקבוע assay חוסן. טיפות חיובי fusion ו GUSB בקרת גנים טיפות נצפו עבור ROS1 ורט ב כל הרצפים 21 להורג במהלך המחקר (איור 3ד', H). כל הפקדים שלילית (לא RT ו- NRC) הניבו תוצאות שליליות על-פני כל 21 הימים (נתונים לא מוצג).

היכולת לפתור בעיות היא מרכיב קריטי בכל פרוטוקול הבדיקה כדי להפעיל את ההגדרה קליני מעבדתי. כאן, אנו מספקים דוגמאות מהעולם האמיתי של תוצאות תת אופטימלית באמצעות פרוטוקול RT-dPCR. הראשון הוא מגרש 2D לדוגמה הממחיש את חשיבות אין רוורס טרנסקריפטאז הפקד (איור 4א). בדוגמה זו, טיפות מוטציה חיובית נכחו למרות שלא היתה ללא המרה cDNA בשל חוסר אנזים. התוצאה הייתה ככל הנראה בגלל תחל dPCR הגברה דנ א גנומי את המטרה. במקרה זה, העיצוב של וזמינותו פורש-אינטרון תמנע הגברה של הדנ א. לחלופין, אנזים DNase נטולת RNase יכול לשמש כדי לחסל את ה-DNA מזהמים, אך זה לא מומלץ לצורך זיהוי של מטרות נדיר, כי קצת השפלה RNA עלולה להתרחש במהלך הדגירה עם האנזים. העלילה 2D הבא דוגמה היה NRC עם טיפות חיובי בשני ערוצים (איור 4B). זה הצביעו על זיהום בשלב מסוים בכיוונון RT-dPCR. במקרה זה, ההמלצה היא למחוק את כל ריאגנטים שעשויות להיות מזוהמים משמש בדיקות, ביסודיות decontaminate כל הציוד של בדיקה חוזרת עם רכיבי התגובה טריים. השלישי דוגמה 2D העלילה שהוצגו כמו תרסיס של טיפות לאורך קו 45° (איור 4C). זו נגרמת לעתים קרובות על ידי הטיית התגבשו של טיפות. זהירות droplet טיפול לפני רכיבה על אופניים תרמי חיוני, כמו טיפות הם נוטים לגרום נזק. אנו ממליצים על השימוש של דור droplet אוטומטית, כאשר היא זמינה. אם העברת ידנית שנוצר על ידי טיפות, להיות בטוח לבחור את הטיפים נשא רחב מומלץ ולהעסיק זהיר בטכניקה pipetting. העברת droplet דורש איטי והשאיפה ומקבלים, בכל מקום לקחת יותר מ 5-6 שניות, וזה חיוני כי הפתח עצה פיפטה לא לגעת הדיו droplet או טוב. כאשר מחלק, שמור על קצה פיפטה ברמת נוזלי, אעלה את זה לאט. כמו טיפות הם ויתרו (תצוגת וידאו להדגמה). הדוגמה מגרש 2D הסופי מדגים חוסר הפרדה בין האוכלוסיות droplet חיוביים ושליליים (איור 4D). זה יכול להיות מספר סיבות. מעכבי PCR חזקה, כגון דטרגנטים בשימוש פירוק מאגרי עודף של הדנ א פגום מאוד, יכול לגרום לאובדן של הפרדה. במקרה זה, שקול להוסיף צעד לנקות בין cDNA סינתזה dPCR (כגון המתוארות בתוך בשלב 5 של פרוטוקול זה). בסופו של דבר, חוסר ההפרדה ניתן גם בשל תנאי הגברה תת אופטימלית, אופטימיזציה של השלב ה-PCR צריך להיות גם נחשב.

נתונים בתוך איור 5 מייצגים 984 בעולם האמיתי החולה לטעום סיבוב פעמים ומדגים את אופי זרימת עבודה זו בדיקה מהירה. תוצאות דווחו על הרופא המטפל מוקדם כמו בתוך 48 שעות (79% מהמקרים) קבלת דגימות ו ב 95% מהמקרים, בתוך 72 שעות. לסיכום, השימוש התייצב במחזור ה-RNA דם אוסף צינורות, RNA ממוטבת מיצוי הליכים מן הדם, ו- RT-dPCR לפעול על-פי פרוטוקול ממוטבת עם המתאים פנימי ופקדי אצווה, יכול לספק מערכת בדיקה מהירה זיהוי מדויק של פיוז'ן RNA משתנים רלוונטיים ב NSCLC.

איור 1 : סקירה של דם דוגמת עיבוד השלבים לגילוי Variant היתוך באמצעות מבחני ספציפיים ביותר ונפוצים RET, גרסאות ROS1 ב NSCLC. (א) בדיקה של דגימות מתחילה כאשר דם משורטט, BCT נשלח בתוך ערכת איסוף הדגימה למעבדה קלינית. במחזור ה-RNA הוא התאושש ממקורות מרובים בתוך פלזמה מועשרת טסיות, הפוכה עיבד עם גנים ספציפיים לקרקע, מטוהרים לשימוש ב- dPCR. דוגמאות מעובדות באמצעות מערכת זמינים מסחרית, אשר מורכב של droplet דור (אמולסיה), הגברה וספירת droplet. ניתוח המידע באמצעות תוכנה זמינים מסחרית. תוצאות הבדיקה ואז מתועדים, דיווח על חזרה לרופא. מבקש בדיקה. התהליך מיועד לפעול בתוך פרק זמן של 72 שעות מעת קבלת דגימות למהדורה תוצאה. שמונה גרסאות עבור ROS1 (B) ו- (ג) RET מכוסים בתוך מבחני מרובבת. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : אימות אנליטית. שורות תאים לבטא (א) SDC4-ROS1 פיוז'ן ופיוז'ן CCDC6 (B)-RET היו מעורבבת עם רקע של RNA פראי-סוג האדם הכולל (WT RNA). עם כל משתנה פיוז'ן, המגבלה של זיהוי הוקמה באמצעות קריטריונים מוגדרים מראש עבור כל assay משתנה תדר משתנה של 0.2%. כל הדגימות מעל הסף הזה הכיל גם עותקים לפחות 21 של בקרת גנים. תקן EML4-ALK (ALK) 5% על רקע של RNA פראי-סוג נבחנה להדגים ירידה לפרטים assay, אשר אושר ע י תוצאה שלילית. סטנדרטים אנליטיים RNA מרובבת נמדדו ב גבוהה, בינונית, ריכוזים נמוכים עבור ROS1 (ג) ו- (ד) מיל' דיוק הוערך מעל שלושה מסלולי באותו יום (אינטרה-יום), פועל שלוש על שלוש יממות (inter-יום), ועם מפעיל עצמאי שני (inter-מפעיל). אמצעי העתקה מספר ואת סטיות תקן מוצגים. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : עיבוד שליטה דוגמאות ונתונים חוסן אצווה. 2D חלקת dPCR assay ROS1 מרובב תוצאות עבור שליטה חיובית (א), (B) אין רוורס טרנסקריפטאז ומערכת בקרת (C) אין שליטה תבנית הרנ א. פקדים (D) היו להפעיל על 21 ימים רצופים (למעט בסופי שבוע ובחגים). התכוונתי עותק מספר + /-סטיות תקן ROS1 חיובי הבקרה היו 439 + /-141. אין רוורס טרנסקריפטאז ופקדים תבנית לא היו גם להפעיל בכל יום, אלה היו כל שלילי (נתונים לא מוצג). 2D חלקת dPCR assay רט מרובב תוצאות עבור שליטה חיובית (E), (F) אין רוורס טרנסקריפטאז בקרה, (G) אין שליטה תבנית הרנ א. פקדים (H) היו להפעיל על 21 ימים רצופים (למעט בסופי שבוע ובחגים). התכוונתי עותקים + /-סטיות תקן רט חיובי הבקרה היו 586 + /-182. לא מוצגות אין רוורס טרנסקריפטאז ופקדים תבנית לא היו גם להפעיל בכל יום, היו שליליות. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : פתרון בעיות RT-dPCR. 2D מתווה וייצוג dPCR תת אופטימלית התוצאות המתקבלות כאשר יש זיהום () בתוך אין transcriptase הפוכה הפקד, זיהום (B) בתוך אין RNA הפקד, (ג) הטיה, התגבשו של טיפות, (D ) לקוי ממוטב PCR תנאים או עיכוב PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : משך העבודה (TAT). תאת (בשעות) נערך עבור בדיקות מבקש של variant RNA (n = 984). נתונים לא כולל סופי שבוע, חגים וימי דגימות הוחזק > 24 שעות בשל מידע קליני לא שלם על טופסי בקשה בדיקת המעבדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: הכנה של שעתוק במהופך ריאגנטים בקרות תהליכים.

רכיב	נפח
2 x dPCR supermix על הגששים (לא 2'-deoxyuridine 5'-טריפוספט)	10 ΜL
20 x היעד משתנה תחל/רגשים להגדיר (450 nmol/L תחל 250 בדיקה FAM nmol/L)	1 ΜL
20 x ערכת הבקרה היעד תחל/בדיקה (450 nmol/L תחל 250 בדיקה HEX nmol/L)	1 ΜL
נוקלאז ללא מים	1 ΜL
cDNA	7 ΜL

טבלה 2: הכנה של המיקס מאסטר dPCR.

רכיבה על אופניים שלב	טמפרטורה	זמן	# מחזורים	כבש שער
הפעלת אנזים	95 ° C	10 דקות	1	~ 2 oC/s
דנטורציה	94 ° C	30 s	40
חישול/הרחבה	55 ° C	1 דקות
ביטול הפעלה של האנזים	98 ° C	10 דקות	1
החזק (אופציונלי)	4 ° C	אינסוף	1	~ 1 oC/s...

טבלה 3: תנאי הרכיבה תרמי.

Discussion

Rearrangements רט ו ROS1 ביחד יוצרים ~ 3% של מוטציות הנהג בתוך האוכלוסייה NSCLC¹⁸. למרות שזה נדיר, זיהוי שינויים גנטיים אלה היא חיונית. חולי NSCLC עם שינויים אלה עשויים להפיק תועלת הרפוי יישוב זה במיוחד לעכב את פעילות קינאז aberrant הנובעת onco-חלבון¹³. כמה טיפולים כאלה כבר המאושרים על ידי ה-FDA לשימוש ב NSCLC חיובית ROS1, בעוד אחרים הוכחו בתמימותה נגד רט ניסויים קליניים¹⁹.

טכנולוגיית ה-PCR דיגיטלית מספקת רגישות זה אידיאלי עבור יישומים ביופסיה נוזלי²⁰. יש כבר אימוץ משמעותית של טכנולוגיה זו לשימוש עם מחזורי תא ללא ה-DNA של המדד של מוטציות הגידול בחולים עם NSCLC^4,6,21,22,23 . בנוסף cfDNA, פיתחנו פרוטוקול המיועד למדידת חזקים גרסאות פיוז'ן הנפוצות ביותר בחולים עם NSCLC מלהסתובב הגידול RNA (איור 1א')¹⁰.

פרוטוקול הוקמה שלנו מאפשר לתחום האנליטי של זיהוי עד 0.2% (איור 2). בעוד RT-dPCR הוא ספציפי ורגיש במיוחד, מבחני מוגבלות הלוח של גרסאות פיוז'ן ידוע כי הם בחרו מרובב לצורך זיהוי ב- PCR וזמינותו. לפיכך, fusions תיכלל מבחני מרובבת יש לבחור בקפידה כדי להבטיח כיסוי הולם בתוך האוכלוסייה של חולים עם NSCLC. עיצבנו בהצלחה מבחני רט ו ROS1 בו זמנית לזהות שמונה תוצאות גרסאות פיוז'ן מן rearrangements של לוקוסים RET או ROS1, לכסות 99% 88% מן האוכלוסייה חיובי רט ו- ROS1, בהתאמה (איור 1בג )¹⁷.

המבחן האחרון זרימת העבודה כפי שמתואר במחקר זה כולל בקרת אצווה כדי להבטיח עקביות של תוצאות. פקדים אלה כוללות הן ברמה האנליטית חיוביים, כמו גם שני פקדים שלילי, המבטיחים ביחד אין זיהום או עיכוב PCR המתרחשים בתוך החבילה (איור 3). כדי להבטיח את היציבות של וזמינותו, בוצע מחקר באמצעות הפקדים אצווה במשך 21 יום (איור 3יח, ח). נתונים אלה מדגימים את העקביות של תהליך ה-RNA כפי שנקבעו במסגרת פרוטוקול זה.

שיטות מעבדה של הטיפול RNA הם מרכיבי המפתח של המבטיח תוצאות חזקות ומדויקות. שטח וציוד ייעודי לשימוש עם ה-RNA, ניקוי הציוד לאחר כל שימוש, בעזרת ריאגנטים RNase ללא חומרים מתכלים והחלת של ספריי איון RNase במרחב העבודה של כל לסייע בהפחתת RNases מזהמים. טיפול מצפוני של RNA דגימות על ידי טכנאים, כולל חלוק מעבדה ייעודית, תכופות שינויים הכפפות, עובדים במהירות על התהליך החילוץ RNA, והם לשמור דגימות על קרח בעל חשיבות עליונה לשמירה על שלמות הדגימה. ברגע RNA היה הפוך עיבד כדי cDNA, הדגימה היא בצורה יציבה יותר כי הוא נוטה פחות השפלה. בנוסף לשיטות העבודה התומכים RNA שלמות, רכיבי ה-PCR ודוגמאות צריך להישמר באזורים הפרדה כדי למנוע זיהום שעלול להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות. ריאגנטים PCR מלאי והכנת mixes מאסטר PCR צריך להישמר נפרד מתבניות PCR, זהירות רבה יש לנקוט הפרדת תבנית מוגבר (post-PCR) של כל החומרים מראש מוגבר כולל ריאגנטים, רנ א cDNA דגימות. לבסוף, דור נכונה וטיפול mixes PCR emulsified לפני הגברה היא המרכזית לשמירה על תקינות droplet ותנאים אופטימליים dPCR. אמצעי זהירות כמו אלה הם קריטיים במהלך ביצוע של פרוטוקול זה כדי להשיג תוצאות עקבי ומדויק. כל הנתונים צריך להיבדק על ידי צוות מיומן לפני שחרורו של תוצאות כדי לוודא כי כל המדדים QC מולאו. במקרה של תוצאות שיוצרת (איור 4), האצווה חייב להיות נבדקו על ידי צוות טכני, מנהל המעבדה, עשוי לדרוש עיבוד מחדש.

RT-dPCR תוצאות יכול להיות מיוצר מוקדם ככל 24 שעות קבלת דגימות ו 95% של תוצאות המדגם בתוך המבחן לקבוע בשימוש במחקר זה (n = 984) דווחו לרופא ההזמנה תוך פחות מ- 72 שעות ממועד קבלת (איור 5). הפעם סיבוב מספקת לרופאים עם הרבה צריך מידע מולקולרית במסגרת זמן המאפשר חניכה של הטיפול המתאים. תוצאות אלו זמינים בדרך כלל מוקדם יותר מאלו שהושגו באמצעות ביופסיה רקמות קונבנציונלי. סמנים ביולוגיים נוספים NSCLC, סוגי סרטן אחרים ניתן לפתח באמצעות גישות מבוססות-RNA במחזור בדומה, ירוויחו באותו הזמן-כדי-תוצאות מהירות. לדוגמה, מדידה של תמליל mRNA מתוכנת מוות ליגנד 1 (PD-L1) באמצעות RT-dPCR יכול ליידע רופאים לגבי אפשרויות חיסוני. יש גם עניין הולך וגובר בכלי השירות של ביופסיה נוזלי dPCR בפיקוח על יעילות טיפולית. אינדיקציות קודמות של התחייה של הגידול באמצעות גנומית בדיקות עבור משתנים מסוימים עלולה לאפשר לרופאים להתאים משטרי הטיפול לפני המטופלים מפתחים סימפטומים על ידי תקן של אמצעי טיפול כגון הדמיה²⁴. פרוטוקולים כמו האחד דיווחו במחקר זה הינם אידיאליים עבור ניטור שלהם הלא-invasiveness, רגישות, מהירה, סיבוב סביב הזמן וכתוצאה יחס עלות-תועלת. וזמינותו המתוארים בזאת מספק תוצאות תוך 72 שעות מעת קבלת דגימות, במחירים זיהוי חיובי-false מינימלי, אשר מקלה על החלטות לטיפול מהיר עוקף כמה מגבלות המנוסה המבוסס על רקמות ובדיקות⁴.

פרוטוקול ונתונים שלנו להפגין מערכת הבדיקה חזקים לזיהוי. גרסאות ה-RNA שפע נמוך, כמו גם את פוטנציאל מבוסס-דם מוטציה הבדיקה הקלינית. עבור אותם חולים אשר אין מנהל התקן שבידיך מוטציה מזוהה על ידי ביופסיה נוזלי יישוב מהיר גישות כמו זה, התוספת של הגנום מקיפה יותר, פרוטאום בדיקות רקמות והן דם עשויים לספק מידע קליני אפילו רחבה יותר כדי לתמוך תכנון טיפול.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL)	Life Technologies	10977-015	1604071
Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL)	Life Technologies	10977-015	1809353
Nuclease-free water (molecular grade)	Ambion	AM9938	1604071
Nuclease-free water (molecular grade)	Ambion	AM9938	1606077
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile	Amresco	K812-500mL	1446C189
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile – 500 mL	Invitrogen	10010023	1916C092
RNase Zap (Life Tech) (250 mL)	Ambion	AM9780	353952
Beta-Mercaptoethanol (BME)  (250 mL)	CalbioChem	6050	W105B
OmniPur Ethyl Alcohol	CalbioChem	4455-4L	56054611
OmniPur Ethyl Alcohol	CalbioChem	4455-4L	56238638
Isopropyl Alcohol	VWR	0918-4L	2116C416
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Scientific	K0441	403648
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Scientific	K0441	288461
DNase I	Thermo	K0441	371299
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	54809699
20x TE buffer pH 8.0	Alfa Aesar	J62388	R13C548
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100	552730
10x TBE buffer	Invitrogen	AM9863	353065
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	60110327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	61900327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	61480327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	62320327
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps	Norgen	42800	585849
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps	Norgen	42800	588308
Lysis Buffer	Norgen	21205	A5F61E
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps	Norgen	61000	585848
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps	Norgen	61000	588309
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC186976
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC188077
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC188413
Collection Tubes 500 pack	Zymo	C1001-500	N/A
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	391657
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	392504
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	448001
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Life Technologies	18090200	451702
Qubit HS RNA Assay Kit (500)	Life Technologies	Q32854	1745264
Qubit assay tubes (500)	Life Technologies	Q32856	13416Q311
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64031651
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64063941
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065740
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065741
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64079083
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad	1863052	64025320
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad	1863052	64052358
gBlock KIF5B-RET K15:R12	IDT	151004172	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K16:R12	IDT	151004173	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K22:R12	IDT	151004174	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K23:R12	IDT	151004175	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R11	IDT	151004176	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R8	IDT	151004177	4-Oct-16
gBlock CCDC6-RET C1:R12	IDT	151004178	4-Oct-16
gBlock TRIM33-RET T14:R12	IDT	151004179	4-Oct-16
RET exon 8 RT Gene Specific Primer	IDT	150554385	28-Sep-16
5’-CTCCACTCACACCTG-3’	IDT	150554385	28-Sep-16
RET exon 11 RT Gene Specific Primer	IDT	150554384	28-Sep-16
5’-GCAAACTTGTGGTAGCAG-3’	IDT	150554384	28-Sep-16
RET exon 12 RT Gene Specific Primer	IDT	150554383	28-Sep-16
5’-CTGCCTTTCAGATGGAAG-3’	IDT	150554383	28-Sep-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R34	IDT	152324366	15-Nov-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R32	IDT	152324367	15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R32	IDT	152324368	15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R34	IDT	152324369	15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R32	IDT	152324370	15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R34	IDT	152324371	15-Nov-16
gBlock EZR-ROS1 E10:R34	IDT	152324372	15-Nov-16
gBlock TPM3-ROS1 T8:R35	IDT	152324373	15-Nov-16
ROS1 exon 34 RT Gene Specific Primer	IDT	152704983	21-Nov-16
5’-CCTTCCTTGGCACTTT-3’	IDT	152704983	21-Nov-16
ROS1 exon 35 RT Gene Specific Primer	IDT	152704985	21-Nov-16
5’-CTCTTGGGTTGGAAGAGTATG-3’	IDT	152704985	21-Nov-16
ALK Gene Specific Primer	IDT	140035422	26-Aug-16
5’-CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’	IDT	140035422	26-Aug-16
EML4-ALK Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
SLC34A2-ROS1 Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
CCDC6-RET Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
Human Brain Total RNA	Ambion	AM7962	1703548
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K15:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K16:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K22:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K23:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R11	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R8	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C1:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T14:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: E10:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T8:R35	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
(version 2)	Bio-Rad	12003909	213939881
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2)	Bio-Rad	N/A	13-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2)	Bio-Rad	N/A	20170112v3.2
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	212851151
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	207383915
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	195995635
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	212851152
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	213949301
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK	Bio-Rad	12003909	20160914
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK	Bio-Rad	12003909	211383227
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	1065C220
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	64052953
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	64052358
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96)	Bio-Rad	186-4110	1065C320
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96)	Bio-Rad	186-4110	64052952
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96)	Bio-Rad	186-4110	64064127
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000065883
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084276
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000079928
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084395
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084634
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20160627
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161107
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161206
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161216
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20170125
Pipet Tips for Automated Droplet Generator	Bio-Rad	1864120	PR125340
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)	Bio-Rad	186-4108	206894
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)	Bio-Rad	186-4108	206893
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	1409850
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	100402
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	145851
Microseal 'B' seals	Bio-Rad	MSB1001	BR00428490
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64039089
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64049253
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64049255
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64081870
DNA Lo Bind Tube 0.5 mL	Eppendorf	22431005	E1629620
DNA Lo Bind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021	F16698K
DNA Lo Bind Tube 2 mL	Eppendorf	22431048	E160610I
50 mL Conicals, Polypropylene (25)	Thermo	339652	G5ZF5W8118
TempAssure PCR 8-Strips, Optical Caps, Natural, polypropylene (120)	USA Scientific	1402-4700	16202
For Rainin LTS Pipettors 0.5-20 µL tips	Pipette.com	LF-20	40155-642C4-642C
For Rainin LTS Pipettors 5-200 µL tips	Pipette.com	LF-250	40154-642C4-642B
Tips LTS 200 ul Filter 960/10 RT-L200F (10 boxes)	Rainin	17002927	1635
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1181-3710	F1175551-1108
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1181-3710	F118054L-1720
Pipet Tips, 100 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10x96)	USA Scientific	1180-1740	0014961Q-2501
Pipet Tips, 200 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1180-8710	E116684P-1540
Pipet Tips, 1000 ul XL TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10x96)	USA Scientific	1182-1730	F118815P
5 mL Standard Racked Gilson-fit Reference Tips	Scientific Specialties	4411-00	14312
Combitips advanced, 0.1 mL Biopur	Eppendorf	003 008 9618	F165414H
Combitips advanced, 0.2 mL Biopur	Eppendorf	0030 089.626	F166689J
Combitips advanced, 5 mL Biopur	Eppendorf	0030.089 669	F166054J
Combitips advanced, 50 mL Biopur	Eppendorf	003.008.9693	F166055I
Reagent Reservoir	VWR	89094-680	141500
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	F165029I
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	F165028G
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Green	Eppendorf	951020346	F166183K
Equipment Type		Equipment ID
Analytical Balance		EQP0125
Cryogenic Freezer 1, -80oC		EQP0095
Refrigerator 6.1 cu ft GP06W1AREF		EQP0139
-20oC Freezer		EQP0140
Beckman Coulter Microfuge 22R		EQP0025
Beckman Coulter Microfuge 22R		EQP0124
Thermo Scientific Hereaus Megafuge 8		EQP0104
Mini Centrifuge		EQP0131
Mini Centrifuge		EQP0136
Mini Centrifuge		EQP0134
Mini Centrifuge		EQP0235
Mini Centrifuge		EQP0216
Thermo Scientific HeraTherm Incubator		EQP0105
Pipette 0.1 - 2.5 μL		EQP0182
Pipette 0.1 - 2.5 μL		EQP0072
Pipette 0.1 - 2.5 μL		EQP0070
Pipette 0.5-10 μL		EQP0218
Pipette 0.5-10 μL		EQP0075
Pipette 0.5-10 μL		EQP0169
Pipette 0.5-10 μL		EQP0074
Pipette 0.5-10 μL		EQP0147
Pipette 2 - 20 μL		EQP0128
Pipette 2 - 20 μL		EQP0160
Pipette 2 - 20 μL		EQP0018
Pipette 2 - 20 μL		EQP0146
Pipette 10 - 100 μL		EQP0079
Pipette 10 - 100 μL		EQP0181
Pipette 10 - 100 μL		EQP0085
Pipette 10 - 100 μL		EQP0077
Pipette 20 - 200 μL		EQP0088
Pipette 20 - 200 μL		EQP0087
Pipette 20 - 200 μL		EQP0231
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0050
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0158
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0217
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0082
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0183
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0083
Pipette 5 mL		EQP0153
Timer		S/N 140623950
Hamilton SafeAire VAV Fume Hood		EQP0206
Biosafety Cabinet		EQP0205
Biosafety Cabinet		EQP0204
Qubit 3.0		EQP0102
Benchmark Digital Heat Block		EQP0108
Benchmark Digital Heat Block		EQP0231
Polaroid Z2300 Instant Print Digital Gel Camera with WiFi and 16GB SDHC memory card		EQP0111
Electrophoresis Power Unit		EQP0113
Electrophoresis Small Gel Box		EQP0116
Maestro Transilluminator		EQP0118
Microwave		EQP0215
Multichannel 8-well Pipette 2 -  20 μL		EQP0207
Multichannel 8-well Pipette 10 - 100 μL		EQP0090
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0094
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0161
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0162
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0163
Vortex Genie 2		EQP0052
Vortex Genie 2		EQP0007
Vortex Genie 2		EQP0132
Vortex Genie 2		EQP0137
Vortex Genie 2		EQP0135
Air Clean PCR Workstation		EQP0203
Air Clean PCR Workstation		EQP0096
Air Clean PCR Workstation		EQP0148
Air Clean PCR Workstation		EQP0097
QX200 Droplet Generator		EQP0202
QX200 Droplet Generator		EQP0121
Automated Droplet Generator		EQP0179
PX1 PCR Plate Sealer		EQP0123
PX1 PCR Plate Sealer		EQP0186
C1000 Touch Cycler w/96W FS RM		EQP0120
S1000 Cycler w/96W FS RM		EQP0174
S1000 Cycler w/96W FS RM		EQP0173
T100 Thermal Cycler		EQP0180
T100 Thermal Cycler		EQP0175
QX200 Droplet Reader		EQP0194
QX200 Droplet Reader		EQP0122