JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Abstract

היסטון שינויים post-translational (PTMs), כגון acetylation, מתילציה זרחון, מוסדרים באופן דינאמי על ידי סדרה של אנזימים להוסיף או להסיר את הסימנים האלו בתגובה לאותות שהתקבלו על-ידי התא. PTMS אלה אנו רותמים את ויסות תהליכים כגון בקרת ביטוי גנים ותיקון דנ א. Immunoprecipitation כרומטין (chIP) כבר גישה אינסטרומנטלית ניקוד את השפע ואת לוקליזציה של PTMs היסטון רבים ברחבי הגנום בתגובה לפליטת מגוונים אל התא. . הנה, מתוארת שיטה רב-תכליתי לביצוע שבב של שינויים היסטוניים post-translationally ששונה מ שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) . שיטה זו מתבססת על crosslinking של חלבונים ודנ א באמצעות טיפול פורמלדהיד שמרים תרבויות, דור של שמרים lysates מאת חרוז מכות, solubilization של כרומטין קטעים על ידי נוקלאז micrococcal, immunoprecipitation של היסטון-DNA מתחמי. DNA הקשורים עם הסימן היסטון עניין מטוהרים, שעבר ניתוח ה-PCR כמותי כדי להעריך את העשרת ב לוקוסים מרובות ברחבי הגנום. נציג ניסויים חיטוט הלוקליזציה של הסימנים היסטון H3K4me2, H4K16ac wildtype, שמרים מוטציה נידונות להפגין ניתוח נתונים ופרשנות. שיטה זו מתאימה למגוון רחב של היסטון PTMs ואת יכולה להתבצע עם זנים מוטציה או בנוכחות לחצים סביבתיים מגוונים, שהופך אותו כלי מצוין עבור חוקרים לשינויים כרומטין dynamics בתנאים שונים.

Introduction

השינוי post-translational דינמי (PTM) של שינויים היסטוניים הוא מנגנון רגולטורי מפתח עבור תהליכים תבניות DNA רבים, כולל תמלול, שכפול ה-DNA תיקון1,2. היכולת לקבוע את השפע ואת לוקליזציה מדויק של שינויים היסטוניים ששונה והמצוות בתהליכים אלה ולכן קריטי להבנת שלהם תקנה בתנאים שונים בתא. הפיתוח של כרומטין immunoprecipitation (chIP) כשיטה בעיקר נבעה מחקרים ביוכימיים של האינטראקציות של חלבונים עם ה-DNA, במיוחד במבחנה שיטות שימוש crosslinkers כימיים, בשילוב עם הצורך להעריך באופי הדינמי של חלבון-DNA אינטראקציות ויוו ועל אזורים ספציפיים של גנום3,4,5. קידום של ה-PCR כמותי (qPCR), טכנולוגיות רצף התרחב גם את היכולת לבצע ניסויים שבב עם השוואות כמותיים ועל -פני כל הגנום, שהופך אותו לכלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות חלבון-דנ א- רמות מרובות.

כיום, השבב הוא שיטה נדרש עבור כל קבוצת המחקר מתעניין בתיווך כרומטין רגולציה של הגנום כפי ישנן שיטות דומות לא ישירות חוקר את הקשר הפיזי בין של היסטון ששונה מסוים גנומית לוקוס ב ויוו. למרות וריאציות של שיטה זו באמצעות רצף הדור הבא כדי למפות היסטון שינויים בכל רחבי הגנום6,7 זמינים, גישות אלה רשאי לפנות שאלות מדעיות שונות, קנה המידה שלהם, עלות והגבלת משאבים טכניים עלולה להיות לכמה קבוצות מחקר. בנוסף, יישוב שבב-qPCR יש צורך להשלים את אלה גישות על-ידי מתן שתי שיטות לייעל את פרוטוקול שבב לפני רצף וכדי לאמת תוצאות epigenomic datasets. ספקטרומטר מסה גישות מבוססות על זיהוי מגוון היסטון סימנים הקשורים עם אזורים גנומית יש גם הופיעו8,9,10,11, עם זאת, אלה גישות יש כמה מגבלות לגבי אשר אזורים בגנום פתור והן דורשות מומחיות טכנית ומכשור לא יהיה זמין כל קבוצות מחקר. לכן, שבב נשאר שיטה למעין לניתוח את השפע ואת ההפצה של היסטון שינויים בתנאים מגוונים עבור כל קבוצות מחקר אפיגנטיקה, כרומטין, ברגולציה של פונקציות גנומית.

כאן, אנו מתארים שיטה עבור השבב באמצעות שמרים ניצני דגם האפייה (cerevisiae ס) לחקור את ההפצה של היסטון PTMs-כרומטין. גישה זו נסמכת על מספר רכיבים מרכזיים של פרוטוקולים השבב פותח שמרים וחלים גם מודל מגוון מערכות12,13. אינטראקציות בין שינויים היסטוניים שונה ל- DNA בתא נשמרים על ידי crosslinking עם פורמלין. בעקבות הכנה lysate, שברי כרומטין solubilized לחלקים בגודל אחיד על ידי עיכול עם נוקלאז micrococcal. Immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מתבצע באמצעות נוגדנים או מסחרי או שנוצרו על-ידי מעבדה, אנ-איי הוא מבודד וניתח העשרה על אזורים מסוימים גנומית באמצעות qPCR (איור 1). עבור שינויים רבים היסטון, כמות ה-DNA המתקבל פרוטוקול זה מספיקה לבדיקה יותר מ 25 לוקוסים גנומית שונים על ידי qPCR.

שיטה זו שבב היא רב תכליתי עבור ניטור ההתפלגות של שינוי היסטון יחיד על-פני מספר זנים מוטציה או תנאים סביבתיים, או לבדיקת שינויים מרובים היסטון בתאים wildtype במספר רב של לוקוסים גנומית. יתר על כן, רכיבים רבים של הפרוטוקול הם מתכוונן בקלות כדי למטב את זיהוי סימני מאוד - או נחות-בשפע גם היסטון. בסופו של דבר, מבצע שבב של שינויים היסטוניים ששונה ניצני שמרים מספק את ההזדמנות לשימוש בפקדים מפתח נוגדנים ירידה לפרטים שאינם זמינים בעיקר במערכות אחרות. כלומר, זני שמרים ניתן להפיק שנושאים מוטציות נקודה ב שאריות היסטון זה מיועדים להחלת השינוי, במקרים מסוימים, יש רק אנזים יחיד זה מזרז את השינוי על משקע היסטון מסוים (למשל-היסטון ליזין methyltransferases). לכן, שבב יכול להתבצע גם היסטון מוטציה או אנזים מחיקה זנים כדי assay במידה שאליו שאינם ספציפיים קשירה של הנוגדן עשוי להיות המתרחשים ותפיק תוצאות חיוביות שגויות. פקד זה חשובה במיוחד עבור פיתח נוגדנים, אפילו יכול לשמש כדי לאמת ירידה לפרטים נוגדנים עבור השינויים שנשמרת היסטון לפני השימוש במערכות אחרות. גישה זו משלימה שיטות אחרות כדי לבדוק נוגדנים ירידה לפרטים להבחין בין מדינות שונות שינוי (כגון מונו-, די - tri-מתילציה), לרבות חקירת מערכים של פפטידים ששונה וביצוע שהכלים המערבי של שינויים היסטוניים או נוקליאוזומים עם שינויים מוגדר. בסך הכל, לשבב ניצני שמרים היא שיטה חזקה עבור הערכת את הדינמיקה של היסטון PTMs ברחבי הגנום, לנתח את המנגנונים השולטים שלהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. מראש לאגד נוגדנים כדי Beads מגנטי

  1. מערבבים היטב את חלבון A/G beads מגנטי ולהעביר µL 20 של beads מגנטי לכל אחד immunoprecipitation (IP) מדגם צינור 1.5 מ.
    הערה: כאשר pipetting חרוזים, השתמש בעצות נשא רחב, נמוך-השמירה.
  2. למקם את הצינור עם חרוזים עמדה מגנטי ולאפשר חרוזים לאסוף בצד של הצינור. הסר את תגובת שיקוע.
  3. לשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה טריס (TBS) (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ מ NaCl).
  4. להוסיף 200 µL של TBS חרוזים, הכמות המתאימה של נוגדן. סובב ב rpm 8 בן לילה ב 4 º C.
    הערה: עבור רבים היסטון PTM נוגדנים, 1-3 µg של נוגדנים לכל IP מספיקה. עם זאת, ניסויים טיטור מומלצים לקביעת ריכוזים המתאים. ריכוזי המומלצת עבור מסחר, מאופיין היטב היסטון PTM נוגדנים לעיתים קרובות מדויק, ניתן למצוא דיווחים שפורסמו או מסמכי מוצרים.
  5. הכנס את החרוזים עמדה מגנטי ולהסיר את תגובת שיקוע. לשטוף אותם עם 1 מ"ל של TBS.
  6. Resuspend את החרוזים µL 20 של TBS IP לדגימה בתוספת של µL 5 נוספים (במקרה של שגיאה pipetting) של TBS.
    הערה: החרוזים ניתן לאחסן לטווח קצר ב 4 ° C עד השימוש.

2. לגדל תאי שמרים.

  1. לחסן 10 מ"ל של YPD (תמצית שמרים 10%, 20% peptone ו- 20% דקסטרוז) עם מושבה בודדת של המתח המתאים, לגדל את זה ב 30 מעלות צלזיוס לילה ב חממה חזק-220 סל"ד.
  2. מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של התרבות שמרים באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את תרבות יתר600 = 0.2 ב- 100 מ ל בקבוקון חדש YPD.
  3. לגדל את התאים ב- 30 מעלות צלזיוס חממה חזק-220 סל"ד עד שיגיעו יומן באמצע שלב (OD600 = 0.6-0.8).

3. in Vivo Crosslinking של חלבונים ל- DNA

  1. כאשר תרבויות מגיעים יומן באמצע שלב, להוסיף מ 2.7 ל 37% פורמלדהיד ישירות אל המדיום, עבור ריכוז סופי של 1% פורמלדהיד. להעביר את הבקבוקון מטרף-25 ° C (או בטמפרטורת החדר), לנער את זה ב-50 סל ד למשך 15 דקות.
  2. הוסף 5 מ של 2.5 מטר גליצין למדיום ולהמשיך רועד ב-50 סל ד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי להרוות את הפורמלדהייד.
  3. העבר את התאים כדי צנטריפוגה בקבוקים, לסובב את התאים ב 5800 g x עבור 5 דקות ב 4 º C. Decant תגובת שיקוע.
    1. לשטוף את התאים על ידי resuspending אותם ב- 45 מ של TBS קר ולהעביר את המתלים לתוך צינור חרוטי 50 מ. לסובב את הצינור ב 2800 g x עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
    2. שטיפת שהתאים 10 מ"ל של קור צ'יפ פירוק מאגר (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ מ NaCl, 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), nonidet 1% תמצית phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), המאוחסנים ב 4 ° C).
    3. לסובב את התאים ב 2800 g x עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
      הערה: התאים יכולים להיות קפוא עם חנקן נוזלי, המאוחסנים ב- 80 ° C עד עיבוד נוסף.

4. הפוך שמרים Lysates

  1. Resuspend התאים 1 מ"ל קר מאגר פירוק שבב עם 1 מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF), 1:1,000 דילול של מעכב פרוטאז שמרים קוקטייל. להעביר את המתלים צינור פקקי בורג 2.0 mL המכיל 200 µL של חרוזי זכוכית.
  2. העבר את התאים חרוז להכות מכשירי עצבנות במהירות גבוהה ב 4 ° C והיכו חרוז 6 פעמים במשך 30 s כל. שמור את התאים על קרח לפחות 1 דקות בין כל חרוז פועם.
  3. להעביר את lysate אל צינור 1.5 mL באמצעות ג'ל טעינת טיפים. Centrifuge lysate-g x 15,500 עבור 20 דקות ב 4 º C.
  4. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב µL 250 MNase עיכול מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl2, 21 מ מ CaCl2, 1% NP-40, המאוחסנים ב 4 ° C) על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
  5. להוסיף 2.5 µL של MNase התגובות. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך 4 - 6 פעמים מיד דגירה אותו באמבט מים 37 º C למשך 20 דקות.
    הערה: תקציר תנאים צריך להיות מותאם כאשר מלאי חדש של MNase משמש. ראה שלב 10 לפרוטוקול.
  6. מיד במקום הצינורות על קרח כדי לעצור את התגובה ולהוסיף 5 µL של EDTA 0.5 M עבור ריכוז סופי של 10 מ מ EDTA. מערבבים בעדינות אותם על-ידי היפוך.
  7. Centrifuge את התגובה ב g x 15,500 למשך 15 דקות ב 4 ° C, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.
    הערה: מסיסים כרומטין (מתעכל) יהיה תגובת שיקוע. בגדר מכיל שאריות תאים מעוכל משהו ואני לא מסיסים.

5. Immunoprecipitate (IP) שונו שינויים היסטוניים

  1. לקבוע ריכוז חלבון של כל שבר כרומטין שפורסמו MNase שימוש assay ברדפורד. להוסיף 1 מ"ל של ברדפורד מגיב אחד של וואקום חד פעמיות 8 בתוספת 1 cuvette נוספים עבור כל דגימה חלבון להיבדק.
    1. להכין פתרון מניות של 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA).
    2. הוסף את אמצעי האחסון המתאים כדי להשיג את ריכוזי BSA. הבאים ב- 1 מ"ל של ריאגנט ברדפורד: 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL, μg/מ"ל. להוסיף 2 μL של השבר כרומטין שפורסמו MNase כימיקלים נוספים.
    3. לכסות את החלק העליון של כל cuvette עם חתיכה קטנה של מצלמות-מיקרוסקופים, היפוך וואקום של 4 - 6 פעמים לערבב הפתרון טוב. דגירה של וואקום בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    4. באמצעות ספקטרופוטומטרים אור, גלוי למדוד את ספיגת-595 nm עבור עיקול רגיל ודגימות ניסיוני.
      הערה: השתמש את cuvette ללא BSA (0 μg/mL) כדי בלנק את ספקטרופוטומטרים לפני נטילת המדידה הראשונה.
    5. להתוות עקומה רגיל באמצעות הערכים ספיגת ריכוזים שונים של BSA בתוכנה המקושרת את ספקטרופוטומטרים או תוכנת הגיליון האלקטרוני. בהתבסס על העקומה סטנדרטי, הגורם דילול בשימוש (שבערך), להשתמש בערכים ספיגת לחישוב ריכוז חלבון עבור כל אחת הדגימות שבר כרומטין.
  2. עבור כל IP, להוסיף 50 µg של חלבון הכולל השבר כרומטין שפורסמו MNase למאגר פירוק שבב להגיע נפח סופי של 1 מ"ל.
    הערה: אם הגדרת IP אחד או יותר לכל lysate, להפוך את תערובת הבסיס של lysate, צ'יפ פירוק מאגר ו- aliquot 1 מ"ל עד צינורות בודדים עבור ה-IP.
  3. הסר 100 µL המיקס IP כדי התהליך כמו הדוגמה קלט. להקפיא את הדגימה קלט ב-20 ° C עד שלב 7.1.
    הערה: דוגמה כרומטין הנותרים יכולים גם להיות קפוא ב-20 ° C, המשמש IP הבאים במקרה הצורך.
  4. הוסף 20 µL של חלבון A/G beads מגנטי מראש קשורים נוגדנים כדי כל מדגם ה-IP.
לסובב דגימת ה-rpm 8 עבור 3 h (סטנדרטי) או למשך הלילה (אם מועדפת) ב 4 º C.

6. לשטוף את כתובות ה-Ip ואת Elute מתחמי היסטון-DNA

  1. למקם את הצינורות עמדה מגנטי ותנו חרוזים לאסוף בצד של הצינור. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה. לשטוף את החרוזים במרוכז עם 1 מ"ל של כל אחד המאגרים להלן.
    1. לבצע כל כביסה על-ידי מסתובב ב rpm 8 עבור 5 דקות ב 4 ° C, הצבת חרוזים עמדה מגנטי, הסרת תגובת שיקוע והוספת מאגר הבא: 2 x - מאגר פירוק שבב, 2x - מאגר שטיפת מלח גבוהה (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 1 מ"מ EDTA 1% NP-40, המאוחסנים ב 4 ° C), 1 x - LiCl/סבון שטיפת מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 250 מ מ LiCl, 1 מ"מ EDTA, 1% NP-40, deoxycholate 1% נתרן, המאוחסנים ב 4 ° C), 1 x - TE (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, המאוחסנים ב 4 ° C), ו- x 1 - טה.
    2. עם שטיפת טה האחרון, העברת חרוזי צינור באמצעות 0.5 מ של טה להעברת רוב החרוזים, ואז עוד 0.5 מ"ל של טה שטוף הצינורית ולהעביר החרוזים הנותרים.
  2. להוסיף 250 µL צ'יפס טרי • תנאי מאגר (1% מרחביות, 1 מ NaHCO3). מערבולת הפתרון בקצרה. לסובב את הדגימות-סל ד 8 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. למקם את צינור עמדה מגנטי ולאסוף את החרוזים. בזהירות להעביר את תגובת שיקוע צינור ולהימנע החרוזים.
    הערה: eluate מכיל חלבונים immunoprecipitated אנ-איי.
  4. להוסיף עוד 250 µL שבב • תנאי מאגר חרוזים. לסובב את הדגימות-סל ד 8 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. להעביר בזהירות את תגובת שיקוע הצינור המכיל את • תנאי הראשון. במידת הצורך, הסר אמצעי אחסון קטן יותר (240 µL) עבור כל כתובות ה-Ip שלא להפריע למטופלים את החרוזים.

7. הפוך חלבון-DNA Crosslinks

  1. להפשיר את דגימות קלט ולהוסיף 400 µL שבב • תנאי מאגר כל קלט.
  2. הקלט והן דגימות ה-IP, להוסיף 20 µL של NaCl 5 מ', µL 5 של 20 מ"ג/מ"ל גליקוגן ו 12.5 µL של 20 מ"ג/מ"ל Proteinase ק. לערבב היטב על ידי היפוך או מצליף צינורות. דגירה בדגימות באמבט מים 65 ° C בין לילה.

8. לטהר ולרכז את הדנ א

  1. להוסיף 10 µL של 10 מ"ג/מ"ל RNase A קלט ודוגמאות IP. דגירה בדגימות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. להוסיף µL 600 של פנול: chlorofrom:isoamyl אלכוהול (25:24:1 PCI) לתמיסה מימית ומערבבים אותם היטב. לסובב אותם ב- g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. להסיר את שכבת מימית כדי צינור חדש. להוסיף µL 600 של PCI ומערבבים אותם היטב. לסובב את הצינור ב- g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את השכבה המימית צינור חדש.
      התראה: לעבוד בשכונה fume, ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כאשר עובדים עם PCI. השלך פסולת נוזלי ומוצק שהומלץ על ידי המוסדיים הנחיות.
  3. הוסף 0.1 x נפח של 3 מ' סודיום אצטט 1 מ"ל אתנול 100% קר, כדי לזרז את ה-DNA. היפוך הצינור 4 - 6 פעמים לערבב הפתרון טוב. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    1. לסובב את הצינור ב g x 15,500 כעשרים דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.
    2. לשטוף את צניפה ב 1 מ"ל אתנול 70% קר. לסובב אותו ב 15,500 g x 10 דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.
    3. מילה נהדרת כדורי בשכונה במשך כ 20 דקות (עד יבש לחלוטין). Resuspend דגימות ה-IP ב- 50 µL של נוקלאז ללא מים, resuspend דגימות קלט ב 100 µL של נוקלאז ללא מים. לאחסן דגימות ה-DNA ב-20 ° C עד ביצוע qPCR.

9. כמותיים PCR (qPCR) כדי לזהות מועשר אזורים גנומית

  1. להפוך את תערובת הבסיס qPCR עבור כל ערכה של צבעי יסוד. תגובה אחת מכילה 5 µL של תערובת x qPCR 2, µL 0.25 של 20 מיקרומטר פריימר לפנים ו 0.25 µL של 20 מיקרומטר פריימר הפוכה.
    הערה: פריימר מתאים לעיצוב ובדיקה עבור ניסויים qPCR הם תיארו במקום14,15,16.
  2. להפוך תערובות מאסטר הדנ א כל מדגם ה-DNA. תגובה אחת מכיל 0.5 µL של ה-DNA µL 4.0 של נוקלאז ללא מים.
  3. להוסיף µL 5.5 של המיקס מאסטר פריימר מתאים ו- 4.5 µL של המיקס הבסיס המתאים DNA מכל קידוח על צלחת qPCR 384-. טוב.
    הערה: להתחיל עם הוספת 5.5 µL של המיקס תחל בכל טוב. לסובב את הצלחת ב g x 200 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר לפני הוספת 4.5 µL של המיקס הדנ א.
  4. דבקים החותם צלחת, ספין-200 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לבצע qPCR באמצעות מערכת qPCR בזמן אמת עם התנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 40 מחזורי 95 ° C עבור 10 s, 55 ° C ל 30 s; עקומת ההיתוך 65 ° C עד 95 ° C עם גידול של 0.5 ° C, 5 s.
  6. עבור כל זוג פריימר, לחשב את הקלט אחוז של המדגם IP ביחס המדגם קלט 5% בשימוש qPCR. השתמש אמצעי triplicates ה-PCR טכנית לבצע את החישובים.
    הערה: אם ניכר וריאציה הוא ציין את triplicates ה-PCR, מומלץ לחזור על qPCR עם תשומת לב מיקס מאסטר קומפוזיציה, pipetting שגיאות של זיהום צולב בין בארות בצלחת 384-. טוב.
    1. התאם את הערכים סי על המידע ל- 100% על-ידי הפחתת מספר מחזורים המייצג את הגורם לדילול מתוך הערכים סי raw.
      הערה: חמישה אחוזים קלט מייצג גורם לדילול של 20-fold, אשר שווה ל 4.32 מחזורים (כניסה2 20 = 4.32).
    2. לחשב את אחוז קלט כ- 2 ^ (סיקלט - סיIP) מוכפלים ב- 100.

10. לקבוע תנאים תקציר MNase (מומלץ מראש הראשון מלא שבב ניסוי)

  1. בצע את שלבים 2.1 דרך 4.4 של הפרוטוקול הקודם. קנה המידה של פרוטוקול לייצר מספיק lysate עבור מספר דוגמאות MNase עיכול בגדר המכילות כרומטין. שלב 4.4, resuspend כדורי ב- mL 1.25 MNase עיכול המאגר. Aliquot הדגימות 5 מנורות אז כי כל אחד מכיל 250 µL של בגדר כרומטין resuspended במאגר עיכול MNase.
  2. להוסיף 0, 1.5, 2.5 או 5 µL של MNase על כל שפופרת. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך 4 - 6 פעמים מיד דגירה הצינורות בתוך אמבט מים 37 º C למשך 20 דקות.
  3. להפסיק תגובות על-ידי הנחת צינורות על הקרח מיד והוספת µL 5 של EDTA 0.5 M עבור ריכוז סופי של 10 מ מ.
מערבבים בעדינות את הפתרון על-ידי היפוך.
  • Centrifuge הצינורות ב g x 15,500 למשך 15 דקות ב 4 ° C, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.
  • להוסיף מרחביות 1% ריכוז סופי (25 µL של 10% הפתרון מניות) ו- NaHCO3 כדי ריכוז סופי 0.1 M (25 µL של פתרון מניות 1 מ') הדגימות בתוך הצינורות 1.5 mL.
  • הוסף 20 µL של NaCl 5 מ', µL 5 של גליקוגן ו 12.5 µL של 20 מ"ג/מ"ל proteinase K הדגימות בתוך הצינורות 1.5mL. תדגור אותם ב 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה
  • להוסיף 10 µL של RNaseA 10 מ"ג/מ"ל. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  • להוסיף 300 µL של PCI לתמיסה מימית ומערבבים אותם היטב. ספין-g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. להסיר שכבה מימית כדי צינור חדש. להוסיף 300 µL של PCI ומערבבים היטב. ספין-g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר שכבה מימית צינור חדש.
  • הוסף 0.1 x נפח של 3 מ' סודיום אצטט (בדרך כלל µL ~ 30) 1 מ"ל אתנול 100% קר, כדי לזרז את ה-DNA. היפוך הצינור 4 - 6 פעמים כדי לערבב היטב. דגירה בן לילה את הצינור ב- 80 ° C 1 h או-20 ° C.
    1. לסובב את הצינור ב g x 15,500 כעשרים דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.
    2. לשטוף את כדורי ב 1 מ"ל אתנול 70% קר. ספין ב 15,500 g x 10 דקות ב 4 º C.
    3. תן שכדורי מילה נהדרת. את הוד כ 20 דקות (או עד יבש לחלוטין). Resuspend כדורי ב 30 µL של נוקלאז ללא מים.
  • להוסיף את ה-DNA בטעינת צבע, להפעיל 20 µL agarose 2% ג'ל להמחיש מתעכל הדנ א.

    • Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    תוצאות

    מרכיב מפתח אחד של פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה של הריכוז של נוקלאז micrococcal (MNase) נעשה שימוש כדי לעכל את כרומטין לחלקים מסיסים, כפי שמתואר בשלב 10. . זה קריטי עבור קבלת נתונים ברזולוציה גבוהה ביחס להתפלגות שינויים היסטון-גנומית אזורים מעניינים רבים. טיטור MNase צריכה להתבצע כדי ל?...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    ההליך המתואר כאן מאפשר התאוששות יעיל של DNA המשויכים ששונה שינויים היסטוניים בתאים שמרים על-ידי immunoprecipitation. זה מלווה qPCR באמצעות תחל אשר להגביר את האזורים עניין לקבוע העשרה המקומיים או דלדול של שינויים ספציפיים היסטון. למרות מפותח כשיטה לפני כמעט 20 שנה, שבב עדיין וזמינותו המכונן על חקירת מצב...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    המחברים אין לחשוף.

    Acknowledgements

    המחברים רוצה להודות חברי המעבדה ירוק לדיונים מועיל. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים NIH R03AG052018 ו- R01GM124342 כדי E.M.G.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Yeast ExtractResearch Products International (RPI)Y20025-1000.0
    PeptoneResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
    DextroseThermoScientificBP350-1
    FormaldehydeSigma-AldrichF8775
    GlycineFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-Nonylphenyl-polyethylene glycolSigma-Aldrich74385Equivalent to NP-40
    MgClThermoScientificS25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    Sodium Dodecyl SulfateAmrescoM107-1KG
    Sodium DeoxycholateSigma-Aldrich30970-100G
    Sodium AcetateSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    Yeast protease inhibitor cocktailVWR10190-076
    25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl AlcoholVWR Life Science97064-824
    EthanolSigma-AldrichE7023
    Nuclease-Free WaterVWR100720-992
    Micrococcal NucleaseWorthington BiochemicalLS004797
    GlycogenThermoScientificR0561
    Proteinase KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNase A Sigma-AldrichR6513-50MG
     Bradford Assay ReagentThermoScientific23238
     BSA Standard 2 mg/mLThermoScientific23210
    α H4EMD Millipore04-858
    α H4K16acEMD MilliporeABE532
    α H3Abcamab1791
    α H3K4me2Active Motif39142
     High Rox qPCR MixAccuris qMax Green, Low Rox qPCR MixACC-PR2000-L-1000
    Protein A/G Magnetic BeadsThermoScientific88803
    magnetic stand for 1.5mL tubesFisher ScientificPI-21359
    Acid-Washed Glass BeadsSigma-AldrichG8772
     Microtube HomogenizerBenchmarkD1030
    2.0 mL screw-cap tubes with sealing ringsSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Gel loading tipsFisher Scientific07-200-288
    CuvettesFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    50 mL conical tubesFisher Scientific14-432-22
    384-Well PCR PlateFisher ScientificAB-1384W
     Gyratory Floor ShakerNew Brunswick ScientificModel G10
    SpectrophotometerThermoScientificND-2000c
     Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855485

    References

    1. Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
    2. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
    3. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
    4. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
    5. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
    6. Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37(2009).
    7. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
    8. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
    9. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
    10. Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
    11. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
    12. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
    13. Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
    14. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
    15. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
    16. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
    17. Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
    18. Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
    19. Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
    20. Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
    21. South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
    22. Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).
    23. Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
    24. Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
    25. Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
    26. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130acetylationimmunoprecipitation

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved