השתלת תאי רקמת שומן-Derived גיליון כדי להפחית את זליגת לאחר קיצור קיבה חלקית במודל של עכברים

Summary

ההכנה והשתלות של רקמת שומן נגזר תאי גזע (ASC) מגיליונות דיו sutured. חיבור המעי הגס במודל חולדה מוצג. יישום זה הרומן מראה כי גיליונות ASC יכולים להפחית זליגת השקה המעי הגס.

Abstract

זליגת anastomotic הוא סיבוך נוראי לאחר ניתוח המעי הגס. למרות שיטות למניעת זליגת יש רמות שונות של יעילות קלינית, הם עד עכשיו לא מושלם פתרונות. טיפול בתאי גזע באמצעות גליונות ASC יכול לספק פתרון לבעיה זו. השיקופיים נחשבים כמו מבטיח מועמדים לקידום רקמת ריפוי בגלל תכונותיהם עם מחלות, immunomodulatory. כאן, אנו מספקים שיטות כדי לייצר הגליונות ASC בצפיפות גבוהה, אשר מושתלים על גבי השקה המעי הגס במודל חולדה כדי להפחית לדליפת. השיקופיים נוצר תא גליונות במנות תרבות תרמו מגיב זה יכול להיות מנותק בקלות. ביום של השתלת, בוצעה כריתת חלקית עם השקה המעי הגס 5-תפר. חיות הושתלו מייד עם גיליון 1 עולה לכל חולדה. גליונות ASC באופן ספונטני דבקה ההשקה ללא בדבק כלשהו, בתפר או biomaterial כלשהו. קבוצות בעלי חיים הוקרבו 3 ו 7 ימים במשככי. בהשוואה לבעלי המושתלים, השכיחות של אבצס anastomotic ודליפה היה גבוה בבעלי השליטה. במודל שלנו, השתלת של גיליונות עולה לאחר ההשקה המעי הגס היה מוצלח עם קצב דליפת נמוך יותר.

Introduction

קיצור קיבה חלקית עם השקה ראשי הוא ניתוח נפוץ שבוצעו שניתן להיעשות למחלות רבות להשפיע על המעי הגס כגון סרטן המעי הגס, מחלת קרוהן, דיברטיקוליטיס^1,2. הכי חששתי סיבוך לאחר ההשקה המעי הגס היא דליפה anastomotic³. למרות מספר גורמי סיכון הקשורים עם דליפות anastomotic זוהו, פתרונות למניעת זליגת נשארים unkown^4,5.

רקמת שומן-derived סטרומה תאים (השיקופיים) קשורים עם תכונות אנטי דלקתיות עם מחלות^6,7, מה שהופך את התאים האלה מבטיח מועמדים טיפולים משובי⁸. היעילות של השיקופיים כדי לקדם ריפוי רקמות הוצגה ברקמות שונות כגון שריר הלב, העור לוושט^{9,10,11,12,13}. עם זאת, ישנם כמה דיווחים על השימוש השיקופיים כדי לקדם ריפוי מעיים. השתלת המקומי של השיקופיים אל המעי הגס ניסיוני. חיבור באמצעות biosutures מצופים ASC או זריקות serosal של השיקופיים הראו שיפור או ריפוי¹⁴ או לא מנעו anastomotic זליגת למרות יותר לחיוביות anastomotic ריפוי¹⁵.

השתלת המקומי של השיקופיים ההשעיה או בשילוב עם biomaterials יכול להיות משויך תא לא מספיקות השמירה או של חלוקת התאים המושתלים¹¹לקוי. ^16,טכנולוגיה של תא גליון¹⁷ מציע שיטה חדשנית של עולה משלוח^18,19. לפיכך, במחקר הקודם, גישה מוזרה הוצע באיזה השיקופיים מאורגן בתא גליון יכול להיות מיושם על ניסיוני השקה המעי הגס²⁰. מחקר זה הראה כי השתלת גיליון ASC הוא מוצלח בהפחתת בריחת השקה המעי הגס לאחר קיצור קיבה חלקית במודל של עכברים. מאמר זה מדווח טכניקה כירורגית השתלת והכנה של גיליון ASC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

רקמת השומן התת עורית בטן הושג מתורמים האנושי עם אישור של הוועדה האתית הרפואית (#MEC-2014-092), המרכז הרפואי של אוניברסיטת MC ארסמוס, רוטרדם, הולנד. ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על-ידי אתית הוועדה של חיות ניסוי, המרכז הרפואי של אוניברסיטת MC ארסמוס, רוטרדם, הולנד (133-14-01).

1. האדם השיקופיים בידוד ותרבות

1. להכין 3 מ"ל של בידוד בינוני 1g של רקמת שומן. מיקס גלוקוז נמוך Dulbecco של בינוני הנשר ששינה (LG-DMEM) עם 10 גרם/ליטר שור אלבומין (BSA) ו 1 g/L collagenase סוג 1.
2. לנתח את האדם רקמת השומן התת עורית בטן (n = 8, כל נקבה, אומר גיל 40 ± בת 9) לחלקים קטנים (0.5 ס מ) באמצעות להב כירורגי סטרילי בגודל 10. לאדאמסון-חום רקמת מלקחיים, קורות חיים SafetyCabinet הביולוגיים סטרילית.
3. אחסן את הרקמה ביתור בקבוק אחסון זכוכית סטריליים מדיה. שוקל את הסכום הכולל של רקמות ביתור ולהתחיל העיכול עם המדיום בידוד מוכן (50 גרם של רקמת שומן עם 150 מ ל בידוד בינוני לכל בקבוק). ניתן להשהות את הפרוטוקול פה על-ידי אחסון הבקבוק עם רקמת שומן גזור, בידוד בינוני ב 4 ° C על מערבל רולר בן לילה. ואז prewarm את הבקבוק ביום המחרת לטמפרטורת החדר 25 º C למשך 15 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא.
   הערה: רקמת השומן התת עורית בטן הושג כחומר שאריות מתורמים שעברו ניתוח שחזור שד באישור ועדת ארסמוס MC רפואית אתית (# MEC-200) ועל פי את הקוד האתי: "שימוש משני נכונה של רקמה אנושית"(< http://www.federa.org>). שאריות רקמת שומן שימשה רק מתורמים אשר לא הפרסומות כדי שימוש משני.
4. לעכל את רקמת שומן ביתור בתוך בקבוק אחסון זכוכית סטריליים מדיה של שייקר-חממה-150 סל ד ו- 37 מעלות לשעה.
5. לחלק את הפתרון מתעכל צינורות 50 מ ל, centrifuge הצינורות 10 דקות ב 390 x g.
6. להכין תרבות בינוני: LG-DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 50 גנטמיצין µg/mL ו- µg/mL 1.5 ampothericin B.
7. בעקבות צנטריפוגה, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 20 מ של תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 50 גנטמיצין µg/mL ו- µg/mL 1.5 ampothericin B). Centrifuge את התאים שוב עבור 5 דקות ב 390 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
8. Resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 10% FBS, גנטמיצין µg/mL 50 ו- 1.5 µg/mL ampothericin B) ולסנן התליה תא דרך מסנן 100 מיקרומטר.
9. להוסיף 50 µL של 3% חומצה אצטית/מתילן כחול פתרון (עבור פירוק תאי הדם האדומים) µL 50 של השעיה תא, לערבב את הפתרון, להשתמש 10 µL כדי לספור את התאים. בצע תא סופר עם hemocytometer. ואז צלחת התאים-צפיפות של תאים/ס מ 40,000² תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 30% FBS, גנטמיצין µg/mL 50 ו- 1.5 µg/mL ampothericin B).
10. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב אווירה לח עם 5% CO₂ במשך 24 שעות ביממה.
11. בעקבות הדגירה, שטיפת התאים עם פוספט חמים (37 מעלות צלזיוס) buffered תמיסת מלח (PBS) כדי להסיר שאריות תאים ולהחליף את התקשורת עם 10% FBS תרבות בינוני עם טרי להוסיף חומצה אסקורבית-2-פוספט (25 µg/mL) ואת הצמיחה פיברובלסט רקומביננטי אנושי פקטור 2 (FGF2, 1 ng/mL).
12. תת-תרבות השיקופיים ב 90% זרימה באמצעות תקן 0.25% טריפסין EDTA פתרון (3 מ"ל של בקבוקון T175). לאחר 3-5 דקות, לנטרל את הפתרון EDTA טריפסין 0.25% עם 10 מ"ל של תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 10% FBS, גנטמיצין µg/mL 50 ו- 1.5 µg/mL ampothericin B).
    הערה: לזרום cytometry ניתוח שימוש נפוץ ASC סמני פני ובידול tri-השושלת מבחני היו שבוצעה בעבר, חשף כי השיקופיים מבודדים באמצעות זה פרוטוקול מוצגים ASC מאפיינים ספציפיים^21,22.
13. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 10% FBS, גנטמיצין µg 50/mL ו- 1.5 µg/mL ampothericin B) עבור בקבוקון T175 centrifuge התאים עבור 8 דקות ב 250 x g. הסר את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל של תרבות בינוני. לספור את התאים עם hemocytometer.
14. צלחת התאים T175 מבחנות תרבות-צפיפות של תאים/cm 8,000².
15. להקפיא את השיקופיים הנותרים של חנקן נוזלי עם 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) תרבות בינוני לפני שימוש נוסף.

2. עולה גיליון הכנה

1. מראש מעיל תרבות תרמו מגיב מנות (3.5 ס"מ קוטר) עם 1 מ"ל של FBS ולאחר מכן מקם את הכלים בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני תא זריעה.
2. Trypsinize השיקופיים באמצעות פתרון EDTA טריפסין 0.25% למשך 3-5 דקות (3 מ"ל על בקבוקון תרבות T175). אם יש גושים תא כלשהו לאחר trypsinization, לסנן את התאים דרך מסנן 100 מיקרומטר לפני שספר.
3. לנטרל את הפתרון טריפסין עם LG-DMEM בתוספת 10% FBS (10 מ"ל על בקבוקון T175), צנטריפוגה התליה תא במשך 8 דקות ב 250 x g... להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל של LG-DMEM בתוספת 10% FBS.
4. לאחר ציפוי כלים תרבות תרמו מגיב עם FBS, להעביר את הכלים החממה צלחת התחממות כדור הארץ ב 37 מעלות צלזיוס ולהסיר FBS מתוך קערה.
5. השיקופיים זרע-תאים/cm 400,000² (בסך הכל, 3.52 תאים⁶ × 10, מעורבבת עם 2 מ של תרבות בינוני לכל מנה).
6. בזהירות להפיץ את התאים בצורה אחידה ככל האפשר על ידי נדנוד בעדינות את המנה.
7. תרבות ASC גיליונות עבור h 48-37 מעלות צלזיוס ב אווירה לח עם 5% CO₂.
   הערה: לנסות למזער את פתיחת הדלת של החממה לאחר זריעה השיקופיים כדי למנוע טיפות טמפרטורה העלול להפריע היווצרות גיליון ASC או לגרום התנתקות מוקדמת של גליונות ASC בנוי.

3. חלקית קיצור קיבה, המעי הגס השקה

1. זירוז ולשמור על חולדות זכרים Wistar (במשקל בין 250-350 גר') עם 1 ליטר/דקה של איזופלוריין (1.5-5%)/oxygen באינהלציה ולהזריק 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין intramuscularly.
2. לאחר החיות תחת הרדמה כללית, להעריך את עומק הרדמה באמצעות בדיקת רפלקס. להחיל משחה העין המכילים ויטמין A לעיניים למניעת יובש. כאשר ההרדמה נחשב מספיק לניתוח, גילוח ורחיצה כירורגית הכן את הבטן על ידי גילוח שערות, ריסוס אזור כירורגית פעמיים עם 70% אתנול. לעטוף את הבטן עם וילונות נייר סטרילי. שימוש בטכניקה אספטית ולתחזק את שדה סטרילי במהלך הליך כירורגי לגמרי.
3. עושים חתך בבטן קו האמצע של 5 ס"מ עם גודל להב כירורגי סטרילי 10 ולהרחיב את החתך עם קורות חיים. לזהות exteriorize המעי הגס, שתשלח המעי הגס מהשארית חלל הבטן עם פדים בטעימת מלוחים. לזהות באמצע צודק, ולאחר כשנשארו העורקים מעינה מצע המעי, בוטה לנתח סביב כל ספינה וספינה באמצעות יתוש האלסטד מאתרים ומפסיקים את כל כלי בודדים עם משי קלועה נספגים 4 0.
4. לבודד את המקטע הגס בין 1.0 ס מ aborally אל המעי 0.5 ס מ מעל עורק מצע המעי העליון סימטרית. Transect דרך המעי הגס בריא באמצעות קורות חיים. לאחר כריתה מקטע מעי, להביא לקרע, קצוות המעי הגס יחד על ידי החדרת שני ספוגיות כותנה ארוכה הטרנס-אנלית דרך המעי הגס דיסטלי ולאחר מכן לתוך סוף המעי הגס הפרוקסימלית.
5. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי, ליצור לחיבור תעלות end-to-end sutured דיו על ידי אחד-שכבת היפוך תפירת בעזרת תפרים קטע 5 (המוזרק monofilament פוליאמיד 8/0). מקום התפרים קטע דרך כל השכבות של הקיר המעי הגס ומקם את extraluminally קשרים.
6. לחלק את החולדות באקראי שליטה או קבוצה גיליון ASC.

4. ASC גיליון השתלת

1. לאפשר את הכלים תרבות להתקרר לטמפרטורת החדר 40 דקות לפני ההשתלה ויוו , כדי להקל על ניתוק גיליון ASC.
   הערה: לאחר הניתוק, גליונות ASC לכווץ כ 2 ס מ קוטר. ASC גיליון הכדאיות נשאר גבוה לפחות 3-6 שעות לאחר ניתוק²⁰.
2. הסר את תרבות בינוני והחלף אותו עם 1 מ"ל של נסיוב חינם LG-DMEM.
3. בעדינות לתפוס העיטורים של הגיליון עולה עם מלקחיים atraumatic ומניחים בצד הצלחת של הגיליון עולה מעל הקו anastomotic.
4. בזהירות כדי למתוח את עולה גיליון כ 0.25 ס מ מעל ומתחת לקו anastomotic באמצעות מלקחיים atraumatic לעטוף הסדין סביב המעי הגס. הרם את המעי הגס עד עטיפת הגיליון ASC מסביב בצד הגבי.
   הערה: ASC גליונות באופן ספונטני לדבוק הקו anastomotic, אין צורך להשתמש בדבק רקמות או כל biomaterial אחרים. קבוצת הביקורת לא מקבל כל טיפול נוסף.
5. הסר את ספוגיות כותנה ולשנות את כפפות וכלי נגינה. החלף את המעי הגס בבטן. סגור הבטן-linea alba עם שכבה אחת של פועל באמצעות תפרים שנספג קלוע polyglycolic חומצה 5/0. תפר את subcutis, cutis ביחד בשכבה אחת של פועל באמצעות תפרים שנספג קלוע polyglycolic חומצה 5/0.

5. לאחר הניתוח והערכת מעקב

1. מיד נתרענן החיות עם זריקה תת עורית של 5 מ"ל תמיסת מלח חמים במשככי. מקם את החיות מתחת למנורת חום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולנטר את סימני החיים עד חיות להכרה מספקת כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
   הערה: בעלי חיים, כי עבר ניתוח לא הוחזרו לחברה של בעלי חיים אחרים עד החלים לחלוטין. לאחר התאוששות, לאפשר גישה חופשית למים, צ'או עכבר רגיל. לשיכוך כאבים לאחר ניתוח, לנהל 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין subcutaneously כל 6-8 h במשך 3 ימים. אנטיביוטיקה לא נוהלו בכל עת במחקר זה.
2. להשיג יומי הקליני הערכות של בריאות ומשקל. במקרה של ציון נמוך מאוד בריאות או הרזיה חמורה, חיות צריך להרדימם מאת מפצעי דקירה הלב עדיין תחת הרדמה.
3. ביום שלאחר הניתוח 3 או יום 7, עזים ומתנגד העכברושים שוב עם 1 ליטר/דקה של איזופלוריין (1.5-5%)/oxygen באינהלציה מבלי. הבופרנורפין, ולבצע re-פתיחת בטן עם חתך בצורת U. בדוק את הבטן על הסימנים של דלקת הצפק, stricture, הדבקויות סיביים, הנוכחות של אבצס. ציון דירוג הסיכון של הדבקויות, מורסה על הבטן וגם באזור anastomotic.
4. לקבוע את הלחץ המתפרצת anastomotic על ידי insufflation האוויר קטע סגור של המעי הגס כולל ההשקה. רישום לחץ האוויר והמקום של קרע כאשר האוויר הראשון לדלוף כ מתפוצץ לחץ.
5. הסרת המעי הגס כל חיה שהקריבה עצמה ולתקן על חתוך קטע של המעי הגס - המכיל ההשקה המעי הגס - עם 4% buffered פורמלדהיד, בעקבות פרפין הטבעה וחיתוך המעי הגס למקטעים עבה μm 4.
6. המתת חסד החיות תוך בהרדמה ישירות אחרי אוסף של המקטע השקה מאת מפצעי דקירה בלב. לאשר מוות בעלי חיים עם העדר נשימה תנועה ללא היסוס.
7. מבצעים stainings פתולוגיה Hematoxylin & אאוזין ו Picro סיריוס אדום, immunohistochemical stainings עם נוגדנים נגד המיטוכונדריה אנושי, תאי אנדותל של עכברוש (anti-CD34) ותאים של מערכת החיסון (CD3 +, CD163 +.).
8. Digitalize השקופיות לבדיקה ממוחשבת ולהשוות את קבוצות בעלי חיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תרשים זרימה של מחקר זה המתאר ASC גיליון תרבות והן את ההליך של צוות, השקה מוצג באיור1. איור 2 מציג ASC גיליון מורפולוגיה מיקרוסקופית ואת המראה מאקרוסקופית של הגיליון ASC במהלך ואחרי הניתוק. איור 3 מראה את השלבים השונים של ניתוק גי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

זליגת anastomotic הוא האירוע לוואי החמורה ביותר בעקבות צוות עם השקה ראשי. טכניקות אופטימלית למניעת הפרעה anastomotic ודליפה עדיין חסרים. יישום מקומי של מערך של biomaterials נערכה, עם שלל תוצאות^25,26,27. המטרה של טיפולים תא היא להקל על רקמות תיקון על ידי החלפת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LG DMEM	Gibco, Life technologies	22320022	ASC isolation and culture
Collagenase type I	Gibco, Life technologies	17100-01	ASC Isolation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418	ASC Isolation
Fetal bovine serum	Gibco, Life technologies	10270-106	FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue	Stemcell Technologies	7060	ASC Isolation
Gentamicin	Gibco, Life technologies	15750-037	ASC isolation and culture
Ampothericin B	Gibco, Life technologies	15290-018	ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400)	Akribis Scientific	F240	ASC Isolation
Centrifuge	Hettichlab	Rotina380	ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline	Gibco, Life technologies	14190-094	PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2	AbD Serotec	AF-100-15	FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA	Gibco, Life technologies	25200-056	ASC culture
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650-5x	DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes	Nunc Thermo scientific	174904	ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0	B Braun	21151042	surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0	B Braun	G1118170	surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0	B Braun	C1048207	surgery