JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה על כיצד לשלב מלאכותי בתיווך microRNA RNA הפרעה optogenetics לעורר במיוחד presynaptic עם העיתון ons עם ביטוי מופחתת של gene (s) סלקטיבי בתוך מעגלים עצביים ללא פגע.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה היא לאפיין את ההשפעה של גנים על פונקציה presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע. אנו מתארים זרימת עבודה כיצד לשלב microRNA מלאכותיים (מיר)-מתווכת התערבות RNA optogenetics כדי להשיג גירוי סלקטיבי של מניפולציה עם העיתון ons presynaptic פרוסות המוח חריפה. הגישה ניסיוני כרוכה בשימוש של מבנה ויראלי יחיד, מקדם מכירות ספציפיים נוירון בודד לנהוג הביטוי של בדיקה optogenetic והן miR(s) מלאכותי נגד presynaptic gene (s). כאשר מזריקים stereotactically באזור המוח של עניין, הבונה ביטוי מאפשר לגרות עם אור באופן בלעדי את הנוירונים עם ביטוי מופחתת gene (s) תחת חקירה. אסטרטגיה זו אינה דורשת את פיתוח ותחזוקה של קווים העכבר מהונדסים, באופן עקרוני ניתן להחיל על אורגניזמים אחרים, כל הגן עצביים של בחירה. אנחנו לאחרונה פירשו אותו לחקור איך נוקאאוט של splice חלופי איזופורמים של תעלות סידן ממותגת מתח מסוג P/Q presynaptic (VGCCs) מסדיר הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר ב CA3 כדי סינפסות מעוררות CA1 פרוסות בהיפוקמפוס חריפה... בגישה דומה יכול לשמש גם כדי לתפעל, בדיקה של מעגלים עצביים בתוך vivo.

Introduction

פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה כדי לאפיין את ההשפעה של גנים על פונקציה presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע. חקירת פונקצית presynaptic מעגלים עצביים שלם הוא מאתגר כי רבים presynaptic עם העיתון ons קטנות מדי, רחוק מ את סומה על מנת לאפשר התערבויות אלקטרופיזיולוגיות המולקולריים משולב. למרות התערבות RNA מציע אמצעי וגמישה חלבונים סינפטיים תמונות ציפורים1, גישה זו שימש במשורה לחקור פונקציה presynaptic כי זה קשה לזהות את ההשפעות של שימוש מסורתי נוקאאוט stimulations חשמל, אשר אינם מבחינים בין מניפולציות תמים עם העיתון ons presynaptic2. כאן, אנו נתאר כיצד לשלב microRNA מלאכותיים (מיר)-מתווכת התערבות ב RNA עם טכנולוגיית optogenetic פיתחה לאחרונה כדי להשיג גירוי סלקטיבי של מניפולציה עם העיתון ons presynaptic פרוסות המוח חריפה.

בעוד עכברים knockout מותנה בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפונקציה של חלבונים presynaptic3,4, האסטרטגיה שלנו אינו מחייב בפיתוח ותחזוקה של גנטית שינוי קווים העכבר, יכול גם להיות בקלות מועסק כדי להפיל איזופורמים ספציפי של גנים. באופן יחסי יותר נפוץ בשימוש קצר מכבנה RNAs (shRNAs), מירס מלאכותי, אשר אנו מעסיקים כאן, מציעים יתרונות מפתח עבור נוקאאוט בנוירונים. בניגוד shRNAs, הם יכולים להתבטא תחת השליטה של פולימראז II יזם1. לפיכך, מקדם בודד ניתן להסיע את הביטוי של מיר והן של בדיקה optogenetic, יחד עם כתב פלורסנט. בדרך זו, ניתן לשמור את הגודל של הבונה בגבולות אריזה של וירוסים adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV, איור 1 א'). גם השימוש מבנה יחיד מקדם בודד מפחית השתנות ניסיוני כי זה מאפשר ביטוי של מיר, החללית optogenetic והעיתונאית פלורסנט על יחס קבוע.

אנחנו לאחרונה החלת טכנולוגיה זו לבחון את התפקיד של לחלופין משולבים איזופורמים של תעלות סידן presynaptic ההיפוקמפוס5. אסטרטגיה כזו חל בדרך כלל לומדת את הרלוונטיות פיזיולוגיים של חלבונים presynaptically ביטוי אחרים במעגל המוח בכל עניין.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על-ידי המועצה האירופית קהילות (הוראה 2010/63/EU של מרץ 4, 2014), אושרו על ידי משרד הבריאות איטלקית.

1. עיצוב של מיקרו Rna התערבות RNA ולהערכה של היעילות שלהם במערכות ביטוי Heterologous

הערה: פרוטוקול זה דורש ידע של שיטות ומבוססת הבאות: שיבוט מולקולרי, רצפי DNA, תחזוקה של שורות תאים, תרביות תאים סידן פוספט, אמת כמותיים בפעם ה-PCR (לרביעיית-PCR), הכנת תא lysates של שורות תאים אפילו השחרת המערבי.

  1. קבע אם הגן העניין בכפוף שחבור חליפי. נוקאאוט כללי של הגן, בחר באופן בלעדי קונסטיטוטיביות exons; נוקאאוט של isoform spliced לחילופין ספציפי, בחר את אקסון spliced לחילופין הרלוונטיים.
  2. להשתמש תכנה ייעודית (למשל https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) כדי לעצב מירס מלאכותי להפרעות RNA כנגד הרצף של עניין.
    הערה: חשוב לשימוש בסיסי מקומי יישור חיפוש כלי (פיצוץ) כדי לבדוק את-מטרות אפשריות בתוך בני אותו מין.
  3. בחר את מירס מדורגת 3 העליון עבור הגן היעד.
  4. סדר גדילי העליון והתחתון מירס שנבחר מחברה מתאימים. לשליטה שלילי, השתמשו גרסה טרופה של אחד את מירס שנבחר או מיר חזה לא לפגוע בכל הגנים הידועים המינים המשמשים את הניסוי (למשל. עבור גנים חוליות, מיר נוכח pcDNA6.2 GW/EmGFP-מיר-. שלילי).
  5. Anneal העליון והתחתון בהתאמה את גדילי מירס שנבחר, לשכפל אותם לתוך פלסמיד תוכנן עבור הביטוי של מירס (למשל pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) באמצעות אסטרטגיות שיבוט רגיל.
    הערה: המטרה היא ליצור קלטת ביטוי מיר בהיקף של 5' מיר איגוף אזור, הרצף מיר שנבחר, 3' מיר איגוף אזור יכול להתבטא מ 3' UTR גנים כתב תחת השליטה של RNA פולימראז סוג II מקדם מכירות.
  6. להשתמש רצפי DNA כדי לאמת את הכניסה הנכון של מירס שנבחרו.
  7. לגדל תאים HEK293 תא humidified תרבות חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) באמצעות DMEM בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברית, 1 מ NaPyruvate, 10 מ מ HEPES (pH 7.39) ו x 1 פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת).
  8. כאשר תאים HEK293 ~ 70% confluent, transfect אותם במשותף עם כל אחד את הווקטורים ביטוי מיר ווקטור לבטא את הגן יישוב על יחס 1:1 DNA באמצעות שיטת סידן פוספט6. כוללים את הפקדים הבאים: (i) untransfected תאים, התאים (ii) transfected עם וקטור לבטא את הגן יישוב יחד עם המוביל גם דנ א (למשל pBluescript II SK(+)) או (iii) מיר שליטה.
    הערה: (i) ביטוי הגן יישוב חייב להיות בין בני אותו מין כלפי אשר תוכננו את מירס, אלא אם כן רצפי ממוקד במירס בהחלט נשמרים באותה רמת נוקלאוטיד בין שני המינים. (ii) תא קווי חוץ HEK293 יכול לשמש. (iii) שיטות אלטרנטיביות של תרביות תאים, כגון אלקטרופורציה או מבוססי ליפוזום שיטות, יכול לשמש.
  9. 48 שעות לאחר תרביות תאים, lyse התאים, הפעלת חלבון ג'ל, לבצע תספיג ולנתח חלבון תוכן עם נוגדן לזהות את חלבון המטרה. המטרה ליעילות תמונות ציפורים של ≥50%.
    הערה: יעילות תמונות ציפורים ניתן לחלופין, או בנוסף, ניתן להעריך (i) על-ידי ניתוח אליסה, (ii) על-ידי מדידת הפעילות של החלבון היעד אם רלוונטי (למשל צפיפות זרם של תעלות יונים) או (ג) על-ידי לרביעיית-PCR ברמת mRNA אם מתאים נוגדנים אינן זמינות (פרוטוקול שלב 3).
    1. מניחים את הכלים תרבות על הקרח ולשטוף את התאים פעם אחת עם קרח באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    2. האחות של PBS, ולאחר מכן להוסיף מאגר ריפה כקרח (50 מ מ טריס-HCl pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 2 מ מ EDTA, 1% NP40, 0.1% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות), המכיל מעכבי פרוטאז, פוספטאז; 1 מ"ל עבור מנה של Ø 100 מ מ, 0.5 mL עבור קערת Ø 60 מ מ).
    3. לגרד תאים חסיד את המנה באמצעות מגרד תא והעבר בעדינות התליה תא לתוך צינור microcentrifuge טרום מקורר.
    4. Centrifuge את הצינור ב g x 15,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C, להעביר את תגובת שיקוע בתוך צינור microcentrifuge טרום מקורר וזורקים בגדר.
    5. לקבוע ריכוז חלבון באמצעות ערכת BCA חלבון Assay או שיטה מתאימה אחרת (למשל ברדפורד assay).
      הערה: דגימות יכול להיות קפוא ב-20 ° C או -80 ° C לשימוש מאוחר יותר או מעובד באופן מיידי.
    6. העברת אמצעי אחסון המתאים של lysates צינורות microcentrifuge כך כל דוגמאות יש ריכוז חלבון זהה ולהוסיף מאגר פירוק כקרח נאותה כדי לפצות את כל lysates באותו אמצעי אחסון.
      הערה: 30-50 µg של חלבון הכולל יהיה מספיק בשביל רוב החלבונים, אך הכמות המתאימה ייטענו ייקבע על פי השפע של החלבון עניין.
    7. להוסיף כמות מספקת של מאגר x Laemmli 2 (מרחביות 4%, 10% מרקפטואתנול, 20% גליצרול, bromophenol 0.004% כחול, 0.125 מ' טריס-HCl, pH 6.8). והרתיחו הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    8. לטעון את הדוגמאות על ג'ל אקרילאמיד יחד עם סמן משקל מולקולרי. הפעל את הג'ל ב- 100 וולט עבור h 1-2.
      הערה: אחוז ג'ל תלוי בגודל של החלבון עניין.
    9. להרכיב את הכריך העברה, להעביר את החלבונים הג'ל על גבי קרום ב- 100 וולט כבר שעתיים. הקרום יכול להיות ניטרוצלולוזה או PVDF. להפעיל PVDF עם מתנול עבור 1 דקות, לשטוף אותו עם מאגר העברה לפני הכנת הערימה.
    10. לחסום את הקרום לשעה בטמפרטורת החדר באמצעות מאגר חסימה (5% חלב PBST (PBS + 0.1% Tween-20)), ואז דגירה קרום בן לילה ב 4 ° C עם נוגדן ראשוני מדולל במאגר חסימה.
    11. רוחצים את הקרום 10 דקות ב- PBST שלוש פעמים את דגירה זה עם נוגדנים משניים מצומדת HRP במאגר החסימה לשעה בטמפרטורת החדר.
    12. לשטוף את הקרום 10 דקות ב- PBS ארבע פעמים, ולאחר מכן להחיל את המצע chemiluminescent הקרום, ללכוד את אותות chemiluminescent באמצעות imager מבוסס מצלמה מצלמות.
    13. השתמש בתוכנת ניתוח התמונה כדי לכמת את היעילות תמונות ציפורים.
  10. בחר את מירס היעילה ביותר שני מיקוד שאינם חופפים רצפי מבחני פונקציונליות נוספת.
    הערה: את המטרות אפקטים ניתן אף פעם לא לגמרי לשלול עבור כל מיר. עם זאת, אם שני מירס עצמאית יש השפעה דומה, זה שהסיכוי שזה בגלל נוק-אאוט את המטרה זהה.
  11. אם יעילות תמונות ציפורים מירס שנבחרה אינה מספקת (< 50%), מסך עבור מירס אחרים. לחלופין, לבטא miR(s) היעילה במשולב, קרי אקספרס אותם עותקים מרובים בקלטת באותו ביטוי, והתוצאה עשויה להיות התייעלות תמונות ציפורים7.

2. בניית רקומביננטי Adeno-הקשורים וקטורים בשילוב הביטוי של Optogenetic רגשים, מיקרו Rna

הערה: פרוטוקול זה דורש ידע של שיטות ומבוססת הבאות: שיבוט מולקולרי, רצפי DNA וייצור rAAV.

  1. שיבוט של הקלטות ביטוי מיר היעילה לתוך 3' UTR של מבנים המיועדים לייצור rAAVs רקומביננטי וביטוי של optogenetic סינאפסות probes, כגון pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (איור 1 א'), איפה נוירון ספציפיים סינפסין יזם כוננים הבעת channelrhodopsin מרביים ChETA, כתב ניאון אדום TdTomato ו miR(s) בין NheI ו EcoRI אתרים5.
    הערה: (i) לא לעלות על מגבלת אריזה של rAAVs, אשר הוא כ 4.7 Kb באורך מ ITR (הפוך חזרה מסוף) כדי ITR (איור 1A, כתום). (ii) קלטת הביטוי ' מיר ' צריך להיות מוכנס בין stop codon WPRE (וודצ'אק הפטיטיס וירוס Posttranscriptional רכיב; איור 1 א'). (iii) הכללה של חלבון פלואורסצנטי, כגון TdTomato, שימושי מאוד שכן היא מאפשרת ניטור ברצון את לוקליזציה והעוצמה של זיהום (פרוטוקול שלב 4).
  2. להשתמש רצפי DNA כדי לאמת את הכניסה הנכון של הקלטות מיר.
  3. התוצרת כייל נוגדנים rAAV1/2 על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר8, אחד rAAV1/2 עבור כל מיר שנבחרו. ניסוי טיפוסי אחד נוקאאוט של אחד הגנים יכלול שני מירס עצמאי נגד אותו גן, מיר אחד שליטה. . כווני כייל וירוס של ≥ 109 הגנום הנגיפי (vg) / µL.
    התראה: rAAVs צריכים להיות מטופלים במתקן אבטחה ברמה 1 (BSL-1). אנא בדקו עם הוועדה המוסדית אבטחה לקבלת מידע מפורט.
    הערה: אם המעבדה אין מתקן ויראלי או אם titers ויראלי אינם משביעי רצון, הפקה rAAV יכול להיות במיקור חוץ. לדוגמה, בקר https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ או https://vcf.charite.de/en/metas/.

3. מיצוי של RNA מתרבויות עצביים העיקרי להערכה של מיר נוקאאוט יעילות של אנדוגני גנים מאת לרביעיית-PCR

הערה: הפרוטוקול (i) זה דורש ידע של שיטות ומבוססת הבאות: הכנה ותחזוקה של תרבויות עצביים העיקרי לרביעיית-PCR. (ii) חוזר כימות של תמונות ציפורים יעילות (שלבים 3.1 – 3.14) לפחות 3 פעמים (משכפל ביולוגי). (iii) להערכת יעילות תמונות ציפורים ברמת mRNA מאת לרביעיית-PCR מתאימה כאשר מנעה ניתוח של תכולת החלבון של, כגון כאשר הורסים לחלופין משולבים איזופורמים שעבורו נוגדנים ספציפיים אינם זמינים5.

  1. להכין ראשי עצביים תרבויות מאזור המוח של עניין. בצע את הפרוטוקול עבור תרבויות קורטיקלית נתון במשחק הקודם הפרסום9, עם השינויים הבאים:
    1. צלחת נוירונים ב- 6 צלחות היטב על צפיפות של 500,000 נוירונים לכל טוב. השתמש 2.5 מ ל/טוב מצורף בינוני ו- 3.3 mL/טוב של תחזוקה בינוני.
    2. אם אסטרוציט overgrowth נצפית, להוסיף 0.5 mL/טוב של תחזוקה בינוני בתוספת 7.5 מיקרומטר של ציטוזין β-D-arabinofuranoside (עבור ריכוז סופי של 1 מיקרומטר) ב 3-4 ימים במבחנה (DIV).
  2. להדביק משלוש בארות לכל מיר (משכפל טכני)-5–חטיבת 6 השימוש הנמוך ביותר זיהומיות המינון אשר יזהם ≥ 99% של הנוירונים.
    1. להסיר 2 מ"ל של מדיום מכל קידוח ולאסוף אותו בצינור בז 50 מ.
    2. להוסיף וירוס ישירות הנוירונים, לערבב בעדינות, למקם את הצלחות בחזרה בחממה ב 37 º C.
    3. חנות המדיום שנאספו בחממה. רופף את הכובע של הצינור בז כדי לאפשר equilibration גז.
    4. לאחר 24 שעות, להוסיף גב בינוני שהוסרו כל טוב (1.9 מ ל/טוב).
  3. ב 17–18 DIV, lyse הנוירונים לחילוץ רנ א.
    התראה: פירוק ריאגנט כלורופורם הם רעילים מאוד. לעבוד תחת ברדס כימי, ללבוש ציוד מגן; השלך פסולת לפי ההנחיות שלך הלאומית ומוסדיים.
    הערה: עבור שלבי 3.3 – 3.13, עבודה בתנאים RNAse-חופשית. יש ללבוש כפפות ולהשתמש RNAse ללא כלי זכוכית, plasticware חד פעמיות. עבור כללי הזהירות כיצד ידית ה-RNA, להתייעץ עם דוגמה בנספח A בהוראות מיקרו RNeasy זמין באינטרנט.
    1. דגירה זכוכית שפסטר סיליקון במשך הלילה בתנור ב 180 מעלות צלזיוס.
    2. להטות את הצלחות, תשאף המדיום לחלוטין משימוש בכל טוב כוס פסטר פיפטה מחובר משאבת ואקום.
    3. מיד להוסיף 700 µL של ריאגנט פירוק כל טוב.
    4. נמרח את הפתרון על ידי נדנדה וניער את הצלחת בקצרה ביד ובזהירות.
    5. Pipette הפתרון למעלה ולמטה 4 – 5 פעמים או עד השעיה הומוגנית מתקבל.
    6. להעביר את הפתרון מכל קידוח לתוך mL 1.5 נפרדים גלאים שפופרת.
      הערה: lysates תא יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס או מעובד מיד.
  4. אם נדרש, להפשיר תא lysates-RT, פנה/י מיד לשלב 3.5.
  5. להוסיף µL 140 של כלורופורם כל דגימה של תאים lysates.
    הערה: כלורופורם הוא תנודתי וקשה פיפטה, סגור את הצינורות גלאים בהקדם האפשרי.
  6. לנער את צינורות גלאים נמרצות עבור 15 s או עד הדגימות הן באופן מלא emulsified.
  7. לשמור את הדגימה RT למשך 1-2 דקות, או עד השלבים נוזלי להתחיל להפריד.
  8. Centrifuge את הדגימות ב g x 12,000 למשך 15 דקות ב 4 º C.
  9. העברה העליון מימית השלב (~ 320 µL) המכילה RNA ל צינור גלאים, ולמחוק את הנוזל הנותר.
    הערה: אל תיגע השלב התחתון אורגני ורוד או את הטבעת לבן בין שני השלבים עם קצה פיפטה.
  10. להוסיף 1.5 בנפחים של 100% אתנול (480 µL) לשלב מימית, pipette הפתרון באיטיות לאורך 3 פעמים כדי לערבב.
  11. לטהר RNA באמצעות ערכת זמינים מסחרית תוכנן עבור טיהור של RNA מדגימות קטנות.
  12. לכמת טוהר ריכוז ודגימת RNA עם ספקטרופוטומטרים.
    הערה: (i) מצפה התשואות של ≥3.5 µg/טוב; את 260/280 ו- 260/230 יחסי עבור טוהר חלבונים ושל תרכובות אורגניות צריך גם להיות ≥1.9. (ii דגימות ה-RNA) יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס או מעובד מיד.
  13. Retrotranscribe 250, 500 או 1000 ננוגרם של RNA עם ערכת זמינים מסחרית.
  14. לכמת את היעילות תמונות ציפורים עבור הגן אנדוגני של עניין על-ידי לרביעיית-PCR. ראו פרוטוקול מפורט, הפניה10. המטרה ליעילות תמונות ציפורים של ≥60% (איור 2). לנרמל את הנתונים כדי ≥2 ניקיון הגנים (למשל. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) משתמשים מרובים בקרה פנימית גן שיטה11.
    הערה: אם עובדים בשנת החולדה, השתמש תחל הבאה של ה-PCR על הגנים משק בית: GAPDH-fwd: 5' GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3' ו GAPDH-rev: 5' GATGATGACCCTTTTGGC 3'; ACTB-fwd: 5' CATCACTATCGGCAATGAGC 3' ו ACTB-rev: 5' TCATGGATGCCACAGGATT 3'; TUBB3-fwd: 5' GCCTTTGGACACCTATTCAG 3' ו TUBB3-rev: 5' TCACATTCTTTCCTCACGAC 3'; PPIA-fwd: 5' CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3' ו PPIA-rev 5' CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3'.

4. הערכת תפקידה של חלבונים Presynaptic ב מעגלים עצביים ללא פגע על ידי גירוי יישוב של נוירונים הפילו-למטה עם Optogenetics

הערה: פרוטוקול הבאות מחייבת התנסות קודמת עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות פרוסות המוח חריפה, גישה התקנה אלקטרופיזיולוגיות.

  1. Stereotactically להזריק rAAV1/2 לתוך המוח בעקבות פרוטוקול מפורט הפרסום הקודם12. לקבוע את נקודות הציון סטיאוטטי לאזור המוח עניין באמצעות אטלסים סטיאוטטי העכבר13 או עכברוש המוח14.
    1. משתמשים של פולר micropipette כדי הזרקת micropipettes עם שאנקס ארוך של Ø מיקרומטר 7-9; קליפ של micropipettes הזרקת שאנקס עם מספריים. השתמש דק מרקר ונייר למקם סימני וכיול הזרקת micropipettes כל 2 מ מ.
    2. עזים ומתנגד החיה עם איזופלוריין ולתקן את זה במנגנון סטיאוטטי.
    3. לחמם את החיה לאורך כל המבצע עם כרית חימום להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס.
    4. להגן על העיניים עם חומר סיכה עינית.
    5. לגלח את הפרווה על הראש עם מכונת גילוח חשמלית.
    6. מורחים povidone יוד על הראש המגולח שימוש במקלון צמר גפן.
    7. תחת מיקרוסקופ ויבתר, עושים חתך קו האמצע.
    8. לנקות את השטח הגולגולת עם במקלון צמר גפן, אז כדי להפוך את bregma ואת למדא לגלוי.
    9. מניחים את micropipette הזרקה לתוך הנרתיק. לצרף בעל הזרוע סטיאוטטי.
    10. לקבוע x ו- y הקואורדינטות של האתר של הזרקת יחסית של bregma ו/או את למדא.
    11. השתמש תרגיל דק הגולגולת מעל אזור המטרה.
      הערה: השתמש בעדינות בתנועות סיבוביות והימנע קידוח דרך הגולגולת כמו זו עתידה לפגוע השטח של המוח.
    12. אם יש דימום, לספוג את הדם מוגזם בנייר מגבת.
      הערה: דם מוגזמת עלולה להקשות לקבוע כראוי הקואורדינטה z.
    13. לטעון ≤2 µL של וירוס לתוך micropipette הזרקת מאת נימיות.
    14. להביא את micropipette הזרקת x ו- y הקואורדינטות של האתר של הזרקה.
    15. לחשב את הקואורדינטה z מדורא ולהוריד את פיפטה לאט לתוך המוח.
    16. כאשר הקואורדינטה z, להמתין 3 דקות כדי לאפשר התאמת רקמות.
    17. הפעילו לחץ חיובי נמוך באמצעות מזרק 1 מ"ל מחובר דרך צינור גמיש לחלק האחורי של micropipette הזריקה. מבחינה ויזואלית לנטר את המהירות של הוצאה של הוירוס מן micropipette הזרקת מבעד למיקרוסקופ לנתיחה, באמצעות כיול את מסמנת נקודות התייחסות.
      הערה: וירוס צריך להיות מוזרק בקצב איטי (< nL 100/min) כדי למנוע נזק לרקמות.
    18. לאחר סיום הזרקה, להמתין 5 דקות, למשוך את micropipette הזרקת מאת 0.2 מ מ, לחכות עוד 5 דקות, כדי להימנע זרם אחורי של הנגיף.
    19. למשוך את micropipette הזרקת לאט, לחלוטין המוח ואת השלך אותו לתוך מיכל מלא עם אקונומיקה.
    20. להרטיב את הגולגולת עם פתרון פיזיולוגיים, תפר את העור עם 3-4 תפרים.
    21. משחה גנטמיצין חלות על הפצע.
    22. יחיד-בית החיה בתוך כלוב נקי עם אוכל. גללים ומשחזרת תחת מנורת חימום עד באופן מלא.
  2. ≥15 ימים שלאחר ההזרקה, לערוף חיות תחת הרדמה עמוקה איזופלוריין.
  3. להכין פרוסות המוח חריפה של האזור במוח עניין עם Vibratome שימוש בגז (95% או2, 5% CO2) חנה המבר קר כקרח, לאודנום (במ מ): 123 NaCl, 1.25 אשלגן כלורי, ח' 1.252PO4, 1.5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPyruvate ו- 18 גלוקוז (osmolarity מותאמות 300 mOsm). לדוגמה, אם המטרה היא לנתח הסינאפסית מ CA3 את הנוירונים כפירמידה CA1, להכין פרוסות הווריד של היווצרות בהיפוקמפוס (בעובי 350 מיקרומטר).
    הערה: משלב זה ואילך יפעלו בתנאים תאורה כדי למנוע הפעלה של המכשיר optogenetic על ידי אור סביבתי.
  4. תן את הפרוסות לשחזר למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ב חנה המבר אותו בחדר המיועד להחזקת פרוסות המוח. שמור את הפרוסות בתא פרוסה של המוח באותו בטמפרטורת החדר עד הקלטה.
    הערה: באמצעות תנאים אלה, פרוסות יכול להישמר בריא עד 6-8 שעות.
  5. העברה אחת פרוסה הקלטה המשוקע קאמרית ו superfuse זה עם 2 mL/min של חנה המבר באותו המשמשת לשחזור בתוספת 1.5 mM CaCl2 (Ca2 +סה כ: 2.5 מ מ), ללא NaPyruvate.
    הערה: פרוסות מוכן, בהשתתפות ריכוז נמוך של Ca2 + (1 מ מ) כדי למזער את רעילות. הקלטות מבוצעות ב- 2.5 מ מ Ca2 + לטובת שחרור שלפוחית.
  6. הסימון בקצרה את האות של הכתב פלורסנט ביטוי (למשל. TdTomato; איור 3B) כדי לברר את לוקליזציה והעוצמה של זיהום.
  7. מילוי של אלקטרודה תיקון עם פתרון תאיים המכיל (במ מ): 110 K-gluconate, 22 אשלגן כלורי 5 NaCl, 0.5 EGTA, 3 MgCl2, 4 מ ג-ATP, 0.5 נה3-GTP, 20 K2-קריאטין פוספט, HEPES 10-קו (pH 7.28, 290 mΩ).
    הערה: השתמש תיקון אלקטרודה עם התנגדות פיפטה של 5-6 mΩ.
  8. תחת תאורה אינפרא-אדום, להגיע חזק-חותם תאים כל תצורה של נוירון מקבל תשומות סינפטית של הנוירונים נגוע. לדוגמה, אם CA3 נוירונים כפירמידה נדבקו, תיקון כפירמידה נוירונים ב- proximal כדי בדרכי המדיאלי של האזור CA1 (איור 3C).
    הערה: סדרת התנגדות ניתן יהיה להשאיר uncompensated, אבל זה צריך להיות קבוע ונמוך (≤20 MΩ).
  9. השתמש פרמקולוגיה כדי לבודד את הזרמים סינפטית תחת חקירה. לדוגמה, אם המטרה היא לחקור הסינאפסית סינאפסות, לחסום מעכבות הסינאפסית עם 10 מיקרומטר bicuculline.
  10. לעורר זרמים סינפטית, לדוגמה, מעוררים postsynaptic זרמים (EPSCs), באמצעות לייזר כחול nm 473 מצמידים של סיב אופטי (Ø ≤250 מיקרומטר) ממוקם על somata של הנוירונים הנגוע (למשל. CA3. נוירונים כפירמידה).
    1. להתאים גירוי אורך מינימלי, כדי לצמצם את האפשרות של לעורר פוטנציאל הפעולה אחד או יותר לפי הדופק אור. אם משתמש ChETA, להגדיר אותו ל 2 מילי-שניות15.
    2. להתאים את עוצמת גירוי הלייזר להניב קטן אך ברור לזיהוי זרמים סינפטית (משרעת השיא של הרשות הפלסטינית ≤50 עבור EPSCs להקליט פוטנציאל החזקה של-70 mV בין נוירונים כפירמידה CA3 ו CA1; דמות תלת-ממד). אם שימוש ChETA של סיב אופטי מיקרומטר 250 בקוטר, גירוי נקודות החוזק של 1-3 mW ב סיבים יציאה צריך להיות מתאים.
      הערה: אם לא ניתן להזרים כוח לייזר, להשתמש במסנני דחיסות נייטרלית.
    3. תאיר 473 ננומטר לייזר על somata של הנוירונים נגועים, אך לא על אקסונים שלהם. לדוגמה, לשפוך האור על CA3 somata, וכך להרחיק את בהתקפה שפר, כדי להימנע ישירה דפולריזציה של האקסונים.
    4. להחיל טטרודוטוקסין (TTX; 0.5 מיקרומטר), חוסם של תעלות נתרן, לדגימת כדי לאשר את הערוצים הן מונחות על פוטנציאל הפעולה.
    5. בהקלטות שונות, להחיל חוסם סלקטיבי הנוכחי סינפטית תחת חקירה כדי לאשר שהגירוי היא סלקטיבית.
      הערה: לדוגמה, להחיל NBQX (10 מיקרומטר) כדי אמפא-סוג גלוטמט קולטן בתיווך EPSCs.
    6. להשוות בין שטיחות ולחתוך חשמלית עורר זרמי סינפטיים במוח חריפה אותו בתגובה לגירוי החוזרות על עצמן (גירויים ≥2 ב ≤20 הרץ). מידה דומה של ההנחיה סינפטית או דיכאון להתייחס בין גירוי חשמלית, אופטי בעת שימוש של מיר שליטה, ובכך רומז כי המנגנונים התאיים דומה מופעלים על ידי שני סוגים של stimulations.
      הערה: השלבים לעיל נחוצים להבטיח כי גירוי אופטי לא זירוז של דפולריזציה ישירה של presynaptic עם העיתון ons, ובכך לעקוף כמה מנגנונים של ההעברה הסינאפסית.
  11. השווה הסינאפסית בתגובה בודד וחוזר stimulations (גירויים ≥2 ב ≤20 הרץ) לבין מיר שליטה של מירס מיקוד החלבונים presynaptic תחת חקירה.

תוצאות

ההליכים המתוארים לעיל מספקות שיטה חזקה כדי להעריך כמה הסינאפסית מושפע את נוקאאוט של חלבונים סינפטיים בנוירונים presynaptic. תוצאות נציג על איך נוקאאוט של חלופה אחוי איזופורמים של Ca presynapticv2.1 (P/Q-סוג) VGCCs מסדיר פלסטיות סינפטית לטווח קצר ב CA3 כדי CA1 הסינפסות סינאפסות הם כדלקמן כדוגמה.

Cav2.1 (P/Q-סוג) הערוצים שלנו VGCCs presynaptic השולט על הסינפסות מהיר ביותר במערכת העצבים המרכזית. חלופי שחבור של exons שבחירה 37 א ו- 37b של יוצרי נקבובית α1 יחידת משנה של Cav2.1 (α1A) מייצרת שני משתנים עיקריים, Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. כדי לקבוע אם Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb] באופן שונה לווסת הסינאפסית ואת הפלסטיות של החולדה הנוירונים בהיפוקמפוס כפירמידה, לראשונה פיתחנו מירס isoform ספציפיים כדי נוקאאוט באופן סלקטיבי Cav 2.1 [EFa] או Cav2.1 [EFb]5. למרות גודלו קצר (97 bp) ודמיון גבוהה (61.86% זהות באותה רמת נוקלאוטיד) בין exons 37 א, 37b, היינו יכולים לעצב שלוש מיר רצפים נגד עכברוש Cav2.1 [EFa] (מיר EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; מיר EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; מיר EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA), ושניים נגד עכברוש Cav2.1 [EFb] (מיר EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; מיר EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) עם החזוי יעילות גבוהה תמונות ציפורים. כפקד שלילי (miR שליטה), השתמשנו על פלסמיד pcDNA6.2 GW/EmGFP-מיר-. שלילי המכיל רצף כיעד ג'ין חוליות ידוע לכל. מבוסס על מסך הראשונה בתאים HEK 293 נגד ערוצי heterologous, אנו נבחר מיר EFa1, מיר EFa3 ומיר EFb2, משובטים קסטות הביטוי שלהם לתוך 3' UTR של וקטור pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, אשר נועד עבור הייצור של rAAVs, איפה סינפסין יזם כוננים הביטוי של channelrhodopsin מרביים של ChETA, החלבון הניאון אדום TdTomato את מיר שנוספו (איור 1). אנחנו גם משוכפל בקלטת ביטוי של מיר EFb2 כדי להגביר את היעילות תמונות ציפורים של מיר הזה.

בשלב הבא, אנו מוכנים rAAV1/2 המבנה 4 לעיל, לכמת והיעילות תמונות ציפורים, סלקטיביות בתרבויות עצביים החולדה הראשית באמצעות isoform ספציפיים לרביעיית-PCR. מיר EFa1 ו מיר EFa3 מופחת mRNA של יליד Cav2.1 [EFa] ~ 70% אבל לא זה של Cav2.1 [EFb], בעוד מיר EFb מופחת mRNA של יליד Cav2.1 [EFb] על ידי ~ 60% אבל לא זה של Cav2.1 [EFa] (איור 2).

אנחנו אז stereotactically מוזרק אחד של ארבע rAAV1/2 אזור CA3 של ההיפוקמפוס של חולדות P18 (איור 3 א-ג), עם נקודות הציון של −2.6 (A-P/M-L/D-V מ- Bregma) / ± 2.9 / −2.9. חמש עשרה עד עשרים וארבע ימים שלאחר ההזרקה, אנו המוכן פרוסות בהיפוקמפוס חריפה rAAV1/2-מוזרק חולדות, המשמש TdTomato זריחה כדי לאשר את הביטוי ואת לוקליזציה של rAAVs (איור 3B). כדי לבדוק אם presynaptic נוקאאוט של Cav2.1 [EFa] או Cav2.1 [EFb] מושפעות הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר ב CA3 כדי CA1 הסינפסות, אנחנו מגורה הנגוע באופן סלקטיבי נוירונים CA3 עם קצר 473 ננומטר לייזר להבזקי האור (2 ms-ארוך ; איור 3C), והקליט את EPSCs שנוצר על ידי תיקון כפירמידה נוירונים ב- proximal כדי בדרכי המדיאלי של האזור CA1 (איור 3C). . מצאנו נוקאאוט של Cav2.1 splice איזופורמים מושפעות התגובות דופק מזווגים גירוי בכיוונים מנוגדים: נוקאאוט של Cav2.1 [EFa] (מיר EFa1 או מיר EFa3) והציגה את הדופק-לזווג ההנחיה (PPF) ואילו תמונות ציפורים של Ca v2.1 [EFb] (מיר EFb2) ביטל אותו (דמות תלת-ממד, E).

figure-results-3844
איור 1: ערכה של המבנה עבור ביטוי בשילוב של optogenetic מרביים בדיקה ChETA, מירס isoform ספציפיים כנגד Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb]. (א) לבנות מפה של rAAV pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, המכיל מקדם synapsin (Syn), channelrhodopsin מרביים ChETA התמזגו TdTomato ו, על צינתור 3' UTR, מיר isoform ספציפיים splice Cav2.1. אנזימי הגבלה המוצגים הינם מחתך יחיד. (B) העליון, בסכמה הקלטת הביטוי. יזם synapsin כונני הביטוי של ChETA-TdTomato והן של מיר isoform ספציפיים. התחתון, המשלים הפוכה של הרצף 21-נוקלאוטיד היעד, אשר מהווים חלק בקלטת מיר. עבור מיר EFb2 שתי קלטות מיר זהים היו ביטוי טנדם אחד אחרי השני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4793
באיור 2. הערכה של יעילות תמונות ציפורים, סלקטיביות של מירס isoform ספציפיים עבור Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb]. ניתוח Isoform ספציפיים לרביעיית-PCR על RNA מבודד 17-18 DIV העיקרי תרבויות נגוע ב- 6 DIV rAAVs לבטא מירס מיקוד גם Cav2.1 [EFa] (מיר EFa1 ומיר EFa3) או Cav2.1 [EFb] (מיר EFb2). הנתונים הם מנורמל לפקד שלילי (miR שליטה). מיר EFa1 ו מיר EFa3 באופן משמעותי, באופן סלקטיבי להקטין mRNA של Cav2.1 [EFa] (n = 8 ו-7 תרבויות, בהתאמה), בעוד מיר EFb באופן משמעותי, באופן סלקטיבי מפחית mRNA של Cav2.1 [EFb] (n = 4 תרבויות; * * * p < 0.001; חד-כיווני ניתוח סטיה מבחן ולאחריו במבחן Tukey אין-ספור השעות שלאחר). הנתונים מוצגים אומר ± ב- SEM... איור זה כבר ממאמרו של Thalhammer, א. et al. 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5886
איור 3. להעריך את התפקיד של Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb] בהיפוקמפוס מקורית מאת ממוקד גירוי של נוירונים הפילו-למטה עם optogenetics. (א) בסכמה הקלטת ביטוי של המבנה rAAV המשמש ויוו זיהום. (B) סעיף בהיפוקמפוס מציג את זריחה TdTomato היא מוגבלת לאזור CA3 התחזיות שלה. תצורת ניסיוני (C) : קרן לייזר בוים על CA3 somata, תיקון קלאמפ ההקלטות בוצעו מ CA1 כפירמידה נוירונים. (ד) 2 ms-ארוך כחול (473 ננומטר) להבזקי האור הלייזר כיוונו 20 הרץ לעורר EPSCs את PPF אשר גדל במירס מיקוד Cav2.1 [EFa], ביטל מאת מיר עבור Cav2.1 [EFb]. סיכום (E) של דופק לזווג יחס לניסויים כמו (D), מראה עלייה PPF מיר EFa1, מיר EFa3, ירידה של מיר EFb2, באופן יחסי מיר שליטה (n = 9-11 הקלטות; * p = 0.02; * * p = 0.01; * * * p < 0.0004; ניתוח של המשותפת). הנתונים מוצגים אומר ± ב- SEM... איור זה כבר ממאמרו של Thalhammer, א. et al. 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

ביטוי משותף של בדיקה optogenetic של מיר נגד גן presynaptic עניין מציעה גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את ההשפעה של גנים על פונקציה presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע. לגישה ניסויית זו, חשוב לזהות ולאפיין מירס כי הם יעילים מאוד סלקטיבי הורסים את הגן עניין במערכות מקורית. במידת האפשר, מירס עצמאית שניים או יותר נגד mRNA באותו עניין יש להשתמש כדי לשלוט לאפקטים את המטרה בסופו של דבר. חילוץ ניסויים, בהם גן עמידים מיר מופיעה שוב במערכת, יכול לשמש בתור פקד עבור ירידה לפרטים.

שימוש הבונה אותו לבטא את optogenetic של החללית ואת מיר מאפשר לעירור שטיחות רק את הנוירונים presynaptic זה יש תומרנו. זה לא אפשרי עם stimulations חשמל כי הם אינם מבחינים בין הנוירונים נגוע, לבריא, ובכך לייצר תוצאות מעורבות מדולל. מאחר stimulations אופטי יכול לגרום פוטנציאל פעולה מספר15, חשוב לבחור רק את המהירה optogenetic הגששים, בין הרחבת לוח15,19,20,21. בנוסף, זה חיוני כדי להבטיח כי גירוי אופטי לא זירוז של דפולריזציה ישירה של presynaptic עם העיתון ons, כדי למנוע עקיפת חלק מהשלבים של ההעברה הסינאפסית אחד ורוצה לחקור22.

הגישה ניסיוני נתאר כאן, מאפשר להעריך במקביל הרלוונטיות פיזיולוגיים של גנים presynaptic מרובים של עניין בתוך פרק זמן מוגבל (4-6 חודשים). עם זאת, חשוב לזכור כי נפילות לעתים רחוקות להגיע 100%. יתר על כן, rAAVs צריך לבוא לידי ביטוי לפחות שבועיים לאפשר ביטוי תמונות ציפורים ומלא מקסימלי של המכשיר optogenetic, אשר עשוי לייצג אילוץ הזמן כאשר חוקרים מוקדם בתהליכים התפתחותיים. למרות יותר עכברים knockout זמן רב, מותנה מוגבל הנוירונים presynaptic, בדרך כלל לגרום להשלים את ההסרה של הגן עניין, מציעים לכן בגישה המשלימה בתוקף.

יתרון מסוים של הטכנולוגיה מיר הוא שהם מאפשרים הביטוי של מירס מרובים מייצוג המקדם אותו. מאפיין זה משמש בעיקר כדי להגביר את היעילות תמונות ציפורים על-ידי הוספת עותקים מרובים של מיר זהה או שונה מירס נגד גן המטרה זהה. עם זאת ניתן להתרגל גם נוקאאוט גנים מרובים על ידי הבעת מירס נגד יעד שונות הגנים7,23. אולי ניתן להשתמש במאפיין זה כדי להשתיק מספר חלבונים presynaptic לנתח presynaptic איתות המסלולים.

. הנה, שילבנו optogenetics עם מירס מלאכותי כדי לאפיין את ההשפעות של גנים על הפונקציה presynaptic חריפה פרוסות בהיפוקמפוס. בגישה דומה יכול לשמש גם כדי לתפעל בדיקה מעגלים עצביים ויוו. בנוסף, שילוב של מירס מלאכותיים עם chemogenetic גישות תאפשר אחד לחקור מעגלים עצביים על פרקי זמן ארוכים יותר.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים Benfenati פ (Istituto איטלקית di Tecnologia, IIT) על תמיכה, כרמלה ויטאלה שעזרת עם ההפגנה. עבודה זו מומן על ידי IIT ו סנט לוק סן פאולו (מענק מס 9734 LAC).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideSigmaAcrylamide/Bis-acrylamide, 30% solutionToxic
Animal Temperature Controller with heat padWPIATC2000
BCA protein assay kitThermoFisher Scientific23225
BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kitThermoFisher ScientificK4936-00
Brain slices PrechamberHarvard ApparatusBSC-PC
CCD camera-based imagerBio-RadChemiDoc™ MP
Cell Culture reagentsLife Technologies
Chemiluminescent substrateGE HelthcareECL Western Blotting Reagents, RPN2106
ChloroformSigmaC2432Toxic
Cytosine β-D-arabinofuranosideSigmaC6645
DrillForedomK.1030
EGTASigmaE4378
Gentamicin ointmentLocal pharmacy
GlucoseSigmaG7021
HepesSigma54459
Injection micropipettesNarishigeGD1
Inorganic salts & detergentsSigma
K2-creatine phosphateCalbiochem237911
KGluconateFluka60245
LaserLaserglow TechnologiesLRS-0473-GFM-00100-03
MembraneAmershamProtran™ 0.2 µm NC
MgATPSigmaA9187
Micropipette holderNarishigeIM-H1
Micropipette pullerNarishigePC-100
Na3GTPSigmaG8877
NaPyruvateSigmaP5280
Ocular lubricantLocal pharmacyLacrigel
Phosphate inhibitorsSigmaP0044, P5726
Protease inhibitorsSigmacOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Protein gel electrophoresis and blotting devicesBio-RadMini-Protean III Cell
Providone iodineLocal pharmacyBetadine
Qiazol Lysis ReagentQiagen79306Toxic
QuantiTect Reverse
Transcription Kit		Qiagen205311
RNeasy Micro KitQiagen74004
SpectrophotometerThermoFisher ScientificNanodrop 2000
Stereotactic apparatusWPI
TetrodotoxinTocris1069Toxic
VibratomeLeicaVT1200S

References

  1. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).
  2. Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
  3. Maejima, T., et al. Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice. J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).
  4. Mark, M. D., et al. Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations. J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).
  5. Thalhammer, A., et al. Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity. Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).
  6. Sambrook, J., Russell, D. W. Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  7. Chung, K. H., et al. Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. Nucleic Acids Res. 34 (7), e53(2006).
  8. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348(2011).
  9. Cingolani, L. A., et al. Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins. Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).
  10. Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition. J Vis Exp. (92), e51845(2014).
  11. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), (2002).
  12. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. B. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  15. Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
  16. Bourinet, E., et al. Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).
  17. Chaudhuri, D., et al. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).
  18. Soong, T. W., et al. Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation. J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).
  19. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  20. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  21. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  22. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  23. Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi. Nucleic Acids Res. 44 (5), e48(2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133OptogeneticschannelrhodopsinChETAmicroRNARNAadenorAAV1 2presynapticRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved